Summary
Her presenterer vi protokoller av dyrking menneskelige periodontal leddbånd (PDL) celle spheroids av Chitosan filmer. Kulturen i tre-dimensjonale (3D) Cellular spheroids gir et alternativ til konvensjonell vev kultur polystyren (TCPS) kultur system.
Abstract
Periodontal leddbånd (PDL) cellene holder store løftet for periodontal vev gjenfødelse. Konvensjonelt, er PDL celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag som vev kultur polystyren (TCPS). Imidlertid har karakteristiske endringer av PDL celler blitt observert under in vitro kultur. Dette fenomenet er sannsynligvis fordi 2D TCPS skiller seg fra in vivo tredimensjonale (3D) mikromiljøet. Sammenlignet med celler kultivert på 2D-underlag, har celler dyrket i en 3D-mikromiljøet, mer likheter med in vivo-celler. Derfor, 3D cellekultur modeller gir et lovende alternativ for konvensjonelle 2D monolag cellekultur. For å forbedre konvensjonelle PDL cellekultur modeller, har vi nylig utviklet en 3D-cellekultur metode, som er basert på spheroid dannelse av PDL celler på Chitosan filmer. Her presenterer vi detaljert celle spheroid kultur protokoller basert på Chitosan filmer. Den 3D-kultur system av PDL mobilnettet spheroids overvinne noen av begrensningene knyttet til konvensjonelle 2D monolag cellekultur, og dermed kan være egnet for å produsere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig periodontal vev gjenfødelse.
Introduction
Periodontitt, initialisert hovedsakelig av Dental plakk1, er preget av skaden av periodontal vev inkludert periodontal LEDDBÅND (PDL), alveolære bein, og cementen. Nåværende behandlinger for periodontitt er vanligvis vellykket i å forebygge fremdriften av den aktive sykdommen, men regenerering av tapt periodontal vev forblir en klinisk utfordring. Nylig har viktig fremgang er gjort i celle-baserte tilnærminger for periodontal vev gjenfødelse å overvinne ulempene med dagens behandlinger2,3,4.
Vår tidligere systematisk gjennomgang avslørte at PDL celler viste stort potensial for periodontal regenerering5. Konvensjonelt, er PDL celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag som vev kultur polystyren (TCPS). Imidlertid har karakteristiske endringer av PDL celler blitt observert under in vitro kultur6. Dette fenomenet er sannsynligvis fordi 2D TCPS skiller seg fra in vivo tredimensjonale (3D) mikromiljøet7. Sammenlignet med celler som er kultivert på 2D-underlag, har celler som dyrkes i 3D-mikromiljøet, mer likheter med in vivo-celler8. Derfor, 3D cellekultur modeller gir et lovende alternativ for konvensjonelle 2D monolag cellekultur.
Konvensjonell 3D-kultur metoden er innkapsle celler i 3D-Biomaterials. Sammenlignet med celler innkapslet i 3D Biomaterials, cellular spheroids etterligne in vivo situasjonen tettere fordi spheroids er aggregater av celler vokser fritt for utenlandske materialer9,10,11, 12. det er rapportert at mobilnettet SPHEROIDS forfremmet MSC bioactivities via bevaring av ekstracellulære MATRISE (ECM) komponenter inkludert fibronektin og laminin13. For å forbedre konvensjonelle PDL cellekultur modeller, har vi nylig utviklet en 3D PDL cellekultur metode, som er basert på spheroid dannelse av PDL celler på Chitosan filmer14. Spheroid formasjon økte selv Fornyelses-og osteogen differensiering kapasiteter av PDL celler14. Her presenterer vi detaljert PDL celle spheroid kultur protokoller basert på Chitosan filmer. Den 3D-kultur system av PDL mobilnettet spheroids overvinne noen av svakhetene knyttet til konvensjonelle TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet for å produsere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig periodontal vev gjenfødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien protokollen ble godkjent av etikk Committee of School og Hospital of Stomatology, Tongji University. Alle pasientene leverte skriftlig informert samtykke.
1. PDL celle isolasjon
- Lag spredning medium for kultur av PDL celler: α-MEM medium supplert med 10% FCS og 100 U/mL penn/strep.
- Forbered en container med is for å overføre isolerte tredje jeksler.
- Sterilisere Kirurgiske instrumenter ved hjelp av en autoklav.
- Pakk ut normal menneskelig påvirket tredje jeksler fra voksne (18-28 år) ved Dental Clinic på skolen og Hospital of Stomatology, Tongji University.
- Plasser den tredje jeksler i sprednings mediet og overfør den til laboratoriet ved 4 ° c.
- Plasser den utpakkede tannen i en steril 100 mm Petri parabol, arbeider innenfor en Biohazard laminær Flow Hood.
- Tilsett 10 mL PBS for å vaske den utpakkede tannen. Gjenta vaske trinnet to ganger.
- Ved å bruke en steril skalpell, forsiktig skille PDL fra roten.
Merk: PDL skal være skrapet fra den midterste tredje delen av roten for å unngå forurensninger fra gingival eller apikale vev. - Hakke PDL i 1-2 mm fragmenter ved hjelp av en sterilisert skalpell blad.
- Place PDL fragmenter i en T-25 kultur kolbe, fylt med 3-4 mL spredning medium.
- Kultur prøvene i en inkubator ved 37 ° c i 5% CO2 med fuktet luft.
- Endre kulturen medium etter utvekst av PDL celler ble observert. Det tar vanligvis 1-2 uker for utvekst av PDL celler. Observer utvekst av PDL celler via en invers fase kontrast mikroskop.
- Endre kulturen medium to ganger per uke etterpå.
- Når PDL cellene har nådd samløpet, sub-kultur celler i forhold til 1:4 (passasje 1).
- Observere cellevekst daglig og endre kulturen medium to ganger per uke.
- Utfør hver etterfølgende passasje i forholdet 1:4 etter at cellene oppnå 80% samløpet. Bruk tredje til femte generasjon av PDL celler for celle seeding.
2. utarbeidelse av Chitosan filmer
- For fremstilling av en 1% (v/v) eddiksyreløsning, tilsett 5 mL eddiksyre til 495 mL dobbelt destillert vann i et rent glass beger.
- For tilberedning av 1% w/v Chitosan oppløsning, veie 5 g Chitosan pulver (gjennomsnittlig molekylvekt 400 kDa, 85% grad av acetylering) og tilsett til 495 mL 1% (v/v) eddiksyreløsning.
- Rør den tilberedte løsningen i 24 timer med røring bar og magnetisk stirring plate ved 60 ° c.
- Autoklav den tilberedte løsningen for å sikre fullstendig oppløsning av Chitosan.
Merk: eksperimentet kan stanses midlertidig på dette stadiet. - For å danne Chitosan filmer, tilsett 1% w/v Chitosan løsning i vev kultur polystyren (TCPS) retter på 0,25 mL/cm2. For eksempel legge 0,5 mL 1% w/v Chitosan løsning til en brønn av 24-brønn plate.
- Tørr TCPS retter i en ovn ved 60 ° c i 24 timer for å danne Chitosan filmer.
- Forbered 0,5 N natriumhydroksid (NaOH). Rør 10 g NaOH, litt om gangen, inn i et stort volum av dobbel-destillert vann ved hjelp av magnetiske røres bar, og deretter fortynne løsningen for å gjøre 0,5 L.
Merk: Legg NaOH til vann-ikke Legg vann til solid NaOH. Ikke berør NaOH! Det kan føre til kjemiske brannskader. - Nøytralisere Chitosan filmer med 0,5 N NaOH. Tilsett 0,5 mL 0,5 N NaOH løsning på en brønn av 24-brønn plate i 2 timer.
- Vask Chitosan filmer tre ganger med dobbel destillert vann.
Merk: eksperimentet kan stanses midlertidig på dette stadiet. - Før celle seeding, sterilisere Chitosan-belagt 24-brønn plater i 70% alkohol over natten ved romtemperatur.
- Skyll Chitosan plater tre ganger med PBS ved romtemperatur.
- Sterilisere Chitosan plater ved behandling under ultrafiolett lys over natten ved romtemperatur.
3. celle seeding
- Pre-varm spredning medium PBS løsning og Trypsin/EDTA løsning til 37 ° c.
- Kast supernatanten fra T-75 cellekultur kolbe.
- Vask confluent PDL celler med 10 mL PBS løsning.
- Forkast PBS-løsningen.
- Tilsett 1 mL Trypsin/EDTA løsning til T-75 cellekultur kolbe.
- Ruge celler med Trypsin/EDTA-løsning i 3 minutter ved 37 ° c.
- Avslutte fordøyelsen prosessen med Trypsin ved å legge til 3 mL spredning medium til T-75 cellekultur kolbe.
- Overfør den forberedte celle fjæringen til et 15 mL konisk sentrifugerør.
- Sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 300 x g og romtemperatur.
- Kast supernatanten fra det 15 mL koniske sentrifuge røret og re-suspendere celle pellet i 500 μL av sprednings medium.
- Count PDL celler med en hemocytometer.
- Seed PDL celler ved tettheten av 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104, og 6 x 104 celler/cm2.
- Kultur PDL celler på Chitosan filmer i en inkubator på 37 ° c i 5% CO2 med fuktet luft.
- Endre kulturen medium to ganger per uke etterpå.
- På dag 1, 2, 3, 4 og 5, observere cellen morfologi daglig via en invers fase kontrast mikroskop.
4. celle overlevelse
- Etter 1, 3, og 6 dager med kultur, bestemme overlevelse av celler ved hjelp av en kommersiell levedyktighet/cytotoksisitet Kit.
- I et 15 mL rør, Forbered 2 mL av en frisk løsning av 2 mM calcein-AM og 4 mM etidiumbromid homodimer i PBS ved virvlingen for 5 s.
Merk: Hold prosessen i mørket. - Fjern kultur mediet og vask spheroids i PBS.
- Ruge spheroids i PBS inneholder 2 mM calcein-AM og 4 mM etidiumbromid homodimer i 30 min ved romtemperatur i mørket.
- Skyll spheroids to ganger i PBS. For spheroids fra en brønn av 24-brønn plate, bruk 2 mL PBS for hver gang.
- Observer prøvene ved å bruke et fluorescens mikroskop med 10x eller 20x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den nåværende protokollen ble levedyktige spheroids-celler vellykket dannet. Figur 1 viste at suspenderte celler eller spheroids i stedet for vedlagte celler hovedsakelig ble observert på Chitosan filmer. For seeding tettheten av 0,5 x 104 celler/cm2, vedlagt PDL celler ble tidvis funnet på dag 1 og 3, og PDL celle spheroids ble sjelden observert. Tvert imot, for seeding tettheten av 3 x 104 og 6 x 104 celler/cm2, ulike størrelser av PDL Cell spheroids ble funnet siden dag 1. PDL celle spheroid formasjon ble observert fra alle seeding tettheten etter 3 dager. Som vist i figur 1, 3 x 104 celler/cm2 var den optimale PDL cellen seeding tetthet fordi størrelsen på PDL celle spheroids var homogen på denne cellen seeding tetthet. Etter 5 dager med kultur ble større spheroids dannet for alle celle seeding tettheten. Suspenderte PDL celler ble sjelden funnet på dag 5.
Levedyktigheten til PDL celler i spheroids ble vurdert etter 1, 3 og 6 dager. Som vist i figur 2var de fleste cellene i spheroids levende celler på dag 1, 3 og 6. Mens på dag 6, antall døde celler ble økt i den sentrale delen.
Figur 1. Den morfologi av PDL mobilnettet spheroids.
For seeding tettheten av 0,5 x 104 celler/cm2, PDL Cell spheroids ble sjelden observert på dag 1 og 3. For seeding tettheten av 3 x 104 og 6 x 104 celler/cm2, ulike størrelser av PDL Cell spheroids ble funnet siden dag 1. PDL celle spheroid formasjon ble observert fra alle seeding tettheten etter 3 dager. Etter 5 dager med kultur ble større spheroids dannet for alle celle seeding tettheten. Suspenderte PDL celler ble sjelden funnet på dag 5. Scale bar: 200 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Yan et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Levedyktigheten til PDL mobil spheroids på Chitosan filmer.
Levedyktigheten til PDL celler i spheroids ble vurdert etter 1, 3 og 6 dager. Som vist her, var de fleste cellene i spheroids levende celler på dag 1, 3 og 6. Mens på dag 6, antall døde celler ble økt i den sentrale delen. Vektstenger: 200 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Yan et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende studien introduserte en 3D cellekultur system for å overvinne noen begrensninger knyttet til konvensjonelle 2D monolag cellekultur. Ifølge protokollen ble PDL Cellular spheroids vellykket dannet av dyrking celler på Chitosan filmer. Vår tidligere studie rapporterte at spheroid formasjon økte selv-fornyelse og osteogen differensiering kapasitet på PDL celler14. I stedet for å bruke et enzym for å høste celler fra TCPS, kan PDL celle spheroids høstes fra Chitosan filmer ved å pipettering mediet et par ganger14. Dermed kan ECM og intercellulære veikryss være godt bevart.
De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer: (1) å sørge for at Kirurgiske instrumenter og Chitosan filmer er sterilisert for cellekultur; (2) skraping av PDL fra den midterste tredje delen av roten for å unngå forurensninger fra gingival eller apikale vev; og (3) krever høyere celle seeding tetthet (≥ 3 x 104 celler/cm2) for vellykket spheroid dannelse av PDL celler.
Men en begrensning for denne metoden er at redusert spredning av PDL celler ble observert etter spheroid formasjon14, som ligner på noen tidligere studier som utføres på fett stromal celler10 og leverkreft cellelinje15. Dette er sannsynligvis forårsaket av forskjellen i regulering av cyclin-avhengige kinase hemmere mellom spheroid og monolag celler16. Til fordel for klinisk anvendelse, er videre studier for å fremme spredning av celle spheroids nødvendig.
En annen ulempe med mobilnettet spheroid er utilstrekkelig diffusjon i kjernen. Selv om PDL celler var hovedsakelig i live i spheroid kultur, ble antallet døde celler økt i den sentrale delen av spheroids på dag 6. Dette fenomenet var sannsynligvis fordi spredningen av oksygen og næringsstoffer er kompromittert i spheroid kjernen som PDL celle spheroids bli større17,18.
Andre metoder som rapporteres å indusere cellulær spheroids inkluderer en ikke-tilhenger overflate19, microwells20, spinner flasker21, micropatterned overflater22,23, hengende dråper24, og en tvungen-aggregering teknikk25. Sammenlignet med tidligere nevnte metoder, er Chitosan filmer relativt kostnadseffektive og enkle å reprodusere. En annen fordel med denne metoden er de antimikrobielle egenskapene til Chitosan26, som er betydelig gunstig for in vitro cellekultur.
Oppsummert her presenterer vi detaljerte 3D celle spheroid kultur protokoller basert på Chitosan filmer. Kulturen i PDL mobilnettet spheroids overvinne noen av begrensningene knyttet til konvensjonelle 2D TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet for å produsere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig periodontal vev gjenfødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble sponset av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grunnleggende forskningsmidler for de sentrale universitetene (1504219050), Natural Science Foundation i Shanghai (17ZR1432800), og Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
