Articolo metodologico

Modulazione della localizzazione subcellulare Tau come strumento per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia

DOI:

10.3791/59988

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20 dicembre 2019

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1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Tau è una proteina neuronale presente sia nel citoplasma, dove lega i microtubuli, sia nel nucleo, dove esercita funzioni non convenzionali tra cui la modulazione dei geni correlati alla malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo un metodo per studiare la funzione del Tau nucleare escludendo eventuali interferenze provenienti da citoplasmatica Tau.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Tau è una proteina legante di microtubuli espressa nei neuroni e la sua principale funzione nota è legata al mantenimento della stabilità citoscheletrica. Tuttavia, prove recenti hanno indicato che Tau è presente anche in altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo in cui è implicato nella protezione del DNA, nella trascrizione del rRNA, nella mobilità dei retrotrasposoni e nell'organizzazione strutturale del nucleolus. Recentemente abbiamo dimostrato che il Tau nucleare è coinvolto nell'espressione del gene VGluT1, suggerendo un meccanismo molecolare che potrebbe spiegare l'aumento patologico del rilascio del glutammato nelle prime fasi del morbo di Alzheimer. Fino a poco tempo fa, il coinvolgimento del Tau nucleare nella modulazione dell'espressione dei geni bersaglio è stato relativamente incerto e ambiguo a causa di limitazioni tecniche che impedivano l'esclusione del contributo di Tau citoplasmico o dell'effetto di altri fattori a valle non correlati al Tau nucleare. Per superare questa incertezza, abbiamo sviluppato un metodo per studiare l'espressione di geni bersaglio specificamente modulati dalla proteina Nucleare Tau. Abbiamo impiegato un protocollo che afcoppia l'uso di segnali di localizzazione e la frazione subcellulare, consentendo l'esclusione dell'interferenza dalle molecole citoplasmiche Tau. In particolare, il protocollo è facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule e condizioni cellulari.

Introduzione

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Le funzioni della proteina Tau nel nucleo hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, in quanto è stato dimostrato essere strettamente associato agli acidi nucleici1,2,3,4,5,6. Ineffetti, un recente studio a livello di genoma ha dimostrato che Tau lega sequenze di DNA genico e intergenico in vivo7. Un ruolo nell'organizzazione nucleolare è stato suggerito8,9,10,11. Inoltre, è stato proposto che Tau sia coinvolto nella protezione del DNA dallo stress ossidativo e ipertermico5,10,12,13, mentre Tau mutato è stato collegato all'instabilità cromosomica e all'aneuploidità14,15,16.

Fino ad ora, le sfide nello studio delle funzioni di Tau nel compartimento nucleare sono rimaste quasi irrisolte a causa delle difficoltà nel sezionare il contributo specifico del Tau nucleare dal contributo di Citoplasma Tau. Inoltre, le funzioni attribuite alle molecole Tau nel compartimento nucleare, fino ad ora, sono correlate solo perché mancano di una dimostrazione inequivocabile del coinvolgimento diretto delle proteine Nucleari Tau. Infatti, il coinvolgimento di Tau nella mobilità dei retrotrasposoni o nella trascrizione del rRNA o nella protezione del DNA11,12,17,18,19 potrebbe essere spiegato anche dal contributo di Tau citoplasmico o dall'effetto di altri fattori a valle non legati al Tau nucleare.

Qui, forniamo un metodo che può risolvere questo problema sfruttando una procedura classica per isolare il compartimento nucleare combinato con l'uso di costrutti Tau 0N4R etichettati con localizzazione nucleare (NLS) o segnali di esportazione nucleare (NES). Questo approccio elimina i complessi problemi relativi ai possibili artefatti dovuti alla fuoriuscita di molecole Tau dal compartimento citoplasmatico. Inoltre, i costrutti Tau-NLS e Tau-NES inducono l'arricchimento o l'esclusione delle molecole Tau dal compartimento nucleare, rispettivamente, fornendo controlli positivi e negativi per il coinvolgimento delle molecole nucleari Tau in una funzione specifica. Il protocollo è tecnicamente facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule, differenziate o meno, come le cellule tumorali che riattivano l'espressione Tau20,21. Inoltre, potrebbe essere applicato anche ad altre proteine che sono presenti sia nel citoplasma che nel nucleo al fine di sezionare le funzioni biologiche relative a diversi compartimenti.

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Protocollo

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1. Cultura cellulare

  1. Cellule SH-SY5Y di coltura (linea cellulare del neuroblastoma umano, CRL-2266) nel mezzo completo (Dulbecco's modified Eagle medium:miscela nutritiva F12 [DMEM/F-12] completata con 10% di siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicillina e 100 streptonomici). Mantenere le cellule in un'incubatrice a 37 e 5% di CO2. Crescere le cellule in piastre 10 cm e dividere quando confluente.

2. Differenziazione cellulare

  1. Per differenziare le cellule SH-SY5Y, il giorno dopo la placcatura, aggiungere 10 -M di acido retinoico (RA) per completare il mezzo per 5 giorni.
  2. Il sesto giorno sostituisce il mezzo con il mezzo di differenziazione: DMEM/F-12 integrato con 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. Non aggiungere FBS o antibiotici.
  3. Far crescere le cellule in mezzo di differenziazione per 3 giorni.

3. Costrutte chimetriche La clonazione

  1. Generare il costrutto Tau-NLS mediante clonazione per digestione enzimatica di restrizione nel telaio alla fine 3' della sequenza Tau 0N4R (383aa) il 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAGAGAGAGAAGGAAAAAGAA.AAGAAGAAGGTAGAAAAAAGAAGAAGA-3.
    NOT: Il 3xNLS alla fine 3' di Tau è clonato nel pCMV-Tau plasmide per l'espressione dei mammiferi che sfruttano i siti di restrizione XhoI e BamHI nel sito di multicloning (MCS).
  2. Generare il costrutto Tau-NES mediante clonazione per digestione enzimatica di restrizione nel frame alla fine 3' della sequenza Tau 0N4R (383aa) la sequenza NES: 5'-AGTGAGCGAACAAGCTGGAGAGTTGGATGGGGCTCGTACAA-3'.
    NOT: Il NES alla fine 3' di Tau è clonato nel pCMV-Tau plasmide per l'espressione dei mammiferi sfruttando i siti di restrizione EcoRI e BamHI nell'MCS.
  3. Trasformare la deformazione DH5alpha E.coli con 100 ng di DNA dal passo 3.1 o 3.2 e piastre lamino su piastre LB-Agar con 100 mg/mL di ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
  4. Scegli una singola colonia e spike le cellule in 5 mL di LB con ampicillina. Lasciare che le cellule crescano a 37 gradi centigradi in agitazione durante la notte.
  5. Estrarre il plasmide con un miniprep di DNA (Tabella dei materiali) e la sequenza per verificare i costrutti.
  6. Trasformare la deformazione DH5alpha E. coli con la sequenza dei costrutti e delle cellule delle lastre verificate su piastre LB-Agar con ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
  7. Scegli una singola colonia e spike le cellule in 5 mL di LB con ampicillina. Lasciare che le cellule crescano a 37 gradi centigradi in agitazione per 2 h.
  8. Mettere le celle dal passo 3.7 in 200 mL di LB con ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
  9. Pellere le cellule a 3.500 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  10. Estrarre il plasmide con un maxiprep di DNA (Tabella dei materiali).

4. Trasfezione cellulare

  1. Seme 400.000 cellule dal passo 1.1 in piastre 6-pozzi o 20.000 cellule in 7-well diapositive camera. Piastra quattro campioni: celle di controllo da trasfetare con un vettore vuoto, cellule da trasfetare con Tau senza tag, cellule da trasfetare con Tau-NLS e cellule da trasfetare con Tau-NES.
  2. Il giorno dopo la seeding transfect 400 ng di DNA per ogni pozzo utilizzando i lipidi cationici (Tabella dei materiali) in piastre a 6 pozzetti o 200 ng di DNA per ogni pozzo per 8-pozzi camere diapositive, secondo le istruzioni del produttore.
    1. Incubare il DNA e i lipidi cationici separatamente in 250 gradi l (per piastre 6 pozze) o 25 l (per i vetrini a 8 pozzi) di mezzo siero ridotto per 5 min a RT. Quindi combinarli per generare il complesso DNA-lipidico e incubare per 20 min.
    2. Sostituire il supporto di coltura con 2 mL (per piastre di 6 pozze) o 250 l (per scivoli da camera a 8 pozze) di fresco mezzo di coltura completa. Aggiungete il complesso DNA-lipidico alle cellule e incubate a 37 gradi durante la notte.
  3. In alternativa, trasfecare il DNA con il reagente cationico in polietilenimine (PEI).
    1. Mescolare 2 g di DNA e 6 l. di PEI con 200 l di mezzo di coltura completa (per ogni pozzo in 6 pozze di fissità), o 1 g di DNA e 3 G di PEI con 100 l di mezzo di coltura completo (per ogni pozzo in scivoli da camera a 8 pozze) , vortice e incubare per 10 min a RT.
    2. Aggiungete il mix alle cellule e aggiungete 1,8 mL di mezzo di coltura completo per pozzo in piatti a 6 pozzetti o 150 l di mezzo di coltura completa per pozzo in scivoli da 8 camere per raggiungere il volume di placcatura.
  4. Modificare il supporto il giorno dopo la trasfezione e aggiungere il supporto di differenziazione come descritto nel passaggio 2.2.

5. Immunofluorescenza

  1. Rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare le cellule con 1x PBS. Fissare le cellule con metanolo freddo al 100% per 3 min senza agitare. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare brevemente con 1x PBS.
  2. Permeabilizzare con 0,1% di surfactant non ionico in 1x PBS per 5 min a temperatura ambiente (RT). Lavare brevemente con 1x PBS, 3 volte.
  3. Incubare cellule con buffer di blocco (0,1% Tween 20 e 1% BSA in PBS) per 30 min a RT su uno shaker orbitale.
  4. Incubare con anticorpi primari appropriati (ad esempio, anticorpo anti-Tau13 monoclonale murino) diluito 1:500 nel buffer di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con 1x PBS.
  5. Incubazione con anticorpi secondari coniugati al fluoroforo (ad esempio, anticorpi antito-tono di capra coniugati ad Alexa Fluor 633) diluito 1:500 nel buffer di blocco per 1 h a RT. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con 1x PBS 3 volte.
  6. Per macchiare i nuclei, incubare con DAPI diluito 1:20,000 nel buffer di blocco per 10 min a RT. Lavare con 1x PBS 3 volte. Montare i copricapi su una diapositiva utilizzando il supporto di montaggio antisbidisca.

6. Blot Occidentale

  1. Per raccogliere il pellet cellulare dal passaggio 4.4, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Incubare con 500 gradi l di 0,1% di metapsina per 4 min a 37 gradi centigradi. Aggiungere un volume uguale di celle medie complete e di sospensione.
  2. Raccogliere le cellule in un tubo e centrifugare a 500 x g per 5 min. Alla fine della centrifuga rimuovere con attenzione il super-natante. Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 500 x g per 5 min e rimuovere con attenzione il supernatante. Conservare i pellet cellulari sul ghiaccio per un uso immediato o congelare a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
  3. Per estratti totali di proteine, incubare il pellet cellulare per 30 min sul ghiaccio nel tampone di lisi (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% di ottilfenioli poli(etileneosy)etanolo, ramificato (Tabella dei materiali), 10 mM EDTA) integrato con proteasi e fofoshare. In base all'abbondanza del pellet, utilizzare da 50 a 100 l of lysis buffer.
    1. Centrifugare l'estratto a 16.000 x g per 15 min. Raccogliere il supernatante e quantificare la concentrazione proteica con qualsiasi saggio di quantificazione standard. Preparare i campioni di proteine per l'SDS-PAGE mescolando 20 g di proteine con 5 g di 4x laemmli tampone in un volume totale di 20 gradi centigradi e far bollire a 100 gradi centigradi per 5 min.
      NOT: Il campione può essere conservato a -20 gradi centigradi.
  4. Per le frazioni subcellulari, risospendere le cellule del passaggio 6.2 nel mezzo completo e raccogliere 1 x 106 cellule per ogni campione. Centrifuga a 500 x g per 10 min per ottenere pellet cellulari per i seguenti passaggi.
    1. Per isolare i compartimenti subcellulari, frazionare secondo le specifiche del kit. Per isolare ogni frazione, incubare il pellet cellulare dal punto 6.4 con il buffer corrispondente, centrifugare, raccogliere il supernatante e aggiungere il buffer successivo al pellet come descritto in 6.4.1.1-6.4.1.5. Aggiungere in ordine buffer di estrazione citoplasmica, buffer di estrazione della membrana, buffer di estrazione nucleare, buffer di estrazione nucleare integrato con 5 mM CaCl2 e 3 buffer di estrazione nucoccale e citoscheletro.
      NOT: Tutti i buffer devono essere integrati con inibitori della proteasi. Ridimensiona i volumi del buffer in base al volume del pellet cellulare.
      1. Per isolare la frazione citosolica, incubare pellet cellulari in 100 gradi di buffer di estrazione citoplasmica ghiacciata integrata con inibitori della proteasi a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione per 10 min. Centrifugi a 500 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti e trasferire il soldante in tubi pre-raffreddati.
      2. Aggiungete al pellet 100 l di macchia di estrazione della membrana ghiacciata al pellet da 6,4,1,1, e incubate a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione per 10 min. Centrifughe a 3.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min e raccogliete il supernatante.
      3. Per la frazione nucleare solubile, aggiungere 50 l di buffer di estrazione nucleare integrato con inibitori della proteasi al pellet dal passo 6.4.1.2, e vortice. Incubare a 4 gradi centigradi per 30 min, centrifugare a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min, e raccogliere il supernatante.
      4. Per la frazione nucleare insolubile, aggiungere 50 l of nuclear extraction buffer integrati con inibitori della proteasi, CaCl2 e nuclease micrococcale al pellet dal punto 6.4.1.3 e vortice. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min, quindi rivorare. Centrifuga a 16.000 x g a RT per 5 min e raccogliere il supernatante.
      5. Per la frazione citoscheletrica, aggiungere 50 lofsac che il buffer di estrazione citoscheletro integrato con inibitori della proteasi al pellet dal passo 6.4.1.4 e il vortice. Incubare 10 min a RT. Centrifugare il tubo a 16.000 x g per 5 min, raccogliere il supernatante e scartare il pellet.
        NOT: Ridimensiona i volumi del buffer in base al volume della cella, come indicato nel protocollo del kit. Fare riferimento al protocollo del kit per ulteriori dettagli su incubazione e tempo di centrifugazione e temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. In alternativa, utilizzare qualsiasi metodo standard30 che, utilizzando detergenti e aumentando la forza ionica e la velocità di centrifugazione, separa il citosolico, la membrana-bound, le frazioni citoscheletriche e nucleari. Separare la frazione nucleare solubile e la frazione nucleare insolubile sfruttando i buffer di estrazione nucleare standard. Il campione può essere conservato a -20 gradi centigradi.
    2. Per l'SDS-PAGE, aggiungete 7 - L di 4x Laemmli buffer a 20 - L di frazioni subcellulari ottenute dai passi 6.4.1.1.6.1.5, far bollire a 100 gradi centigradi per 5 min.
  5. Caricare campioni su un gel di acrilammide ed eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 120 V. Trasferire le proteine alla membrana di nitrocellulosa a 250 mA per 90 min.
  6. Controllare l'elettroforesi in gel proteico corretto e gonfiore di successo incubando la membrana per 5 min nella soluzione di colorazione Ponceau. Sciacquare la membrana in acqua distillata fino a quando lo sfondo è pulito. Rimuovere la macchia continuando il lavaggio con Tris tamponata salina con Tween 20 (TBST) per 10 min su uno shaker.
  7. Incubare la membrana con soluzione di blocco (5% di latte in TBST) per 1 h a RT su shaker. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
  8. Ibridare la membrana con l'anticorpo primario nella soluzione di blocco (1% di latte in TBST) durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
  9. Ibrida reati la membrana con l'anticorpo secondario coniugato HRP in soluzione di blocco per 1 h a RT. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
  10. Rilevare la fascia proteica utilizzando la chemiluminescenza. Quantifica l'intensità delle bande Western Blot di ImageJ. Normalizzare l'espressione proteica sul prodotto di un gene di pulizia: istone H2B per la frazione solubile e insolubile nucleare, GAPDH per la frazione citoplasmatica e per gli estratti totali.

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Risultati

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La strategia utilizzata per sezionare l'impatto del Tau nucleare nell'espressione genica evitando il contributo delle proteine Tau citoplasmiche è stata descritta nella Figura 1. In breve, le proteine Tau etichettate con NLS o NES vengono accumulate o escluse rispettivamente dal compartimento nucleare. L'effetto funzionale di questo squilibrio è l'alterazione dell'espressione genica misurata come prodotto del gene VGluT1.

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Discussione

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Descriviamo un metodo per misurare l'impatto della proteina Tau nucleare sull'espressione genica. Con questo protocollo il contributo di Tau citoplasmatica è fortemente limitato. I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti: la differenziazione delle cellule umane del neuroblastoma SH-SY5Y, la frazione subcellulare e la localizzazione della proteina Tau nel compartimento nucleare.

In primo luogo, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, la differenziazione delle ce...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni di Normale Scuola Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 633 capra anti-topo IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
anti anti-actina anticorpoBETHYL LABORATORIEA300-485Aanti-coniglio WB 1:10.000
anti GAPDH AnticorpoFitzgerald Industries International10R-G109aanti-topo WB 1:10.000
anti H2B AnticorpoAbcamab1790anti-coniglio WB 1:15.000
anti Tau-13 AnticorpoSanta Cruz Biotechnologysc-21796anti-topo WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa AnticorpoThermo Fisher ScientificPA5-16891anti-topo WB 1:5.000
anti VGluT1 AnticorpoSigma-AldrichAMAb91041anti-topo WB 1:500
BCA Protein Assay KitEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404Latte scremato in polvere
BOVIN SIERO ALBUMINASigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001inibitore della proteasi
Criterio TGX 4-20% senza macchie, 10 pozzettiBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low GlucosioEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 M
Siero bovino fetaleEurocloneEC50182L
gliceroloSigma-AldrichG5516-500ml
Capra anti-topo IgG-HPRSanta CruzBiotechnology sc-2005WB 1:1.000
Capra anti-coniglio IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1.000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 wellslide nunc177402
L-glutamminaEurocloneECB3000D100X
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific12566014lipidi cationici
MetanoloSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM siero ridotto mezzoGibco31985070
PEISigma-Aldrich40.872-7
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific 1514012210.000 U/mL, 100 mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001inibitore della fosfatasi
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Passaggio 3.10
Acido retinoicoSigma-AldrichR2625-100mg
Kit di frazionamento delle proteine subcellulari per cellule in colturaThermo Fisher Scientific78840
Membrana di nitrocellulosa supportataBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833.920
TCS SP2 microscopio confocale a scansione laserLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlTensioattivo non ionico
Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific154000540,50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD mezzo di montaggio antisbiadimentoVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemidi purificazione del DNAPromegaA1330Passaggio 3.5
glass

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577(2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

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