Summary
타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.
Abstract
타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.
Introduction
핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,13,돌연변이 타우가 염색체 불안정성 및 이수성 및 이수성14,15,16에연결되는 반면, 산성 및 고열 스트레스로부터 DNA 보호에 관여하는 것으로 제안되었다.
지금까지 핵구획에서 타우의 기능을 연구하는 과제는 세포질 타우의 기여에서 핵타우의 구체적인 기여를 해부하는 어려움으로 인해 거의 해결되지 않았다. 더욱이, 핵 구획에 있는 타우 분자에 기인하는 기능은, 지금까지, 핵 타우 단백질의 직접적인 관여의 명백한 데모가 결여되기 때문에, 단지 상관관계가 있습니다. 실제로, 타우가 레트로트랜스포손의 이동성 또는 rRNA 전사 또는 DNA 보호에 11,12,17,18,19의 관여는 또한 세포질 타우의 기여 또는 핵 타우와 관련이 없는 다른 다운스트림 요인의 효과에 의해 설명될 수 있다.
여기서, 우리는 핵국극화(NLS) 또는 핵수출신호(NES)로 태그된 타우컨스0N4R의 사용과 결합된 핵구획을 분리하는 고전적인 절차를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공한다. 이 접근법은 세포질 구획에서 타우 분자의 유출로 인해 가능한 유물과 관련된 복잡한 문제를 제거합니다. 더욱이, 타우-NLS 및 타우-NES 구성은 핵 구획에서 타우 분자의 농축 또는 배제를 유도하고, 특정 기능에서 핵 타우 분자의 개입에 대한 긍정적 및 음성 적 제어를 제공한다. 이 프로토콜은 기술적으로 용이하고 타우발현(20,21)을재활성화시키는 암세포와 같은 다른 세포 유형에서 타우의 핵기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용가능한 고전적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 구성된다. 더욱이, 그것은 다른 구획에 관련되었던 생물학 기능을 해부하기 위하여 세포질 및 핵 둘 다에 존재하는 그밖 단백질에도 적용될 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할.
2. 세포 분화
- SH-SY5Y 세포를 분화하기 위해 도금 다음날, 10 μM 레티노산(RA)을 첨가하여 5일 동안 배지를 완성합니다.
- 6일째는 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM/F-12를 분화 배지로 대체합니다. FBS 나 항생제를 추가하지 마십시오.
- 세포를 분화 배지에서 3일 동안 성장시다.
3. 키메라 구조물 복제
- 타우서열 0N4R(383aa)의 3' 말단에서 프레임에 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NLS 구성을 생성하여 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
참고: 타우의 3' 끝에 있는 3xNLS는 XhoI 및 BamHI 제한 사이트를 멀티클로닝 사이트(MCS)로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-Tau 플라스미드로 복제됩니다. - NES 서열의 3' 끝 부분의 프레임에서 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NES 구성을 생성한다: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGAGAGAGAGATTGGGT박귀액타카-3'.
참고: 타우의 3' 끝에 있는 NES는 에코리 및 밤히 제한 사이트를 MCS로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-타우 플라스미드로 복제된다. - 3.1 단계 또는 3.2 단계에서 DNA 100 ng로 DH5alpha 대장균 균주를 변형시키고 LB-Agar 플레이트에서 100 mg / mL 암피실린으로 플레이트 세포를 변형시킵니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
- 단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 밤새 교반에서 37 °C에서 성장하게하십시오.
- DNA 미니프렙(물자표)을사용하여 플라스미드를 추출하고 시열을 확인하여 시공을 확인하였다.
- 암피실린으로 LB-Agar 플레이트에서 확인된 구성물 및 플레이트 셀로 DH5alpha E. 대장균 균주를 변환합니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
- 단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 2 시간 동안 교반에서 37 °C에서 자라게하십시오.
- 암피실린을 가진 LB의 200 mL에 단계 3.7에서 세포를 넣습니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
- 4 °C에서 10 분 동안 3,500 x g에서 세포를 펠렛.
- 추출 플라스미드와 DNA 맥시프렙(재료표).
4. 세포 감염
- 종자 400,000 세포는 6 웰 플레이트에서 1.1 단계 또는 8 웰 챔버 슬라이드에서 20,000 셀. 플레이트 4개의 샘플: 제어 세포는 빈 벡터로 형질감염되고, 세포는 태그가 지정되지 않은 타우로 형질전환되고, 세포는 타우-NLS로 형질감염되고 세포는 타우-NES로 형질감염된다.
- 제조자의 지시에 따라, 8웰 챔버 슬라이드에 대해 각 웰 플레이트또는 200 ng의 DNA를 6웰 플레이트에 사용하여 각 웰에 대한 DNA의 트랜스펙트 400 ng를 파종한 다음날.
- RT에서 5분 동안 감소된 혈청 배지의 DNA와 양이온 지질을 250 μL(6-well 플레이트의 경우) 또는 25 μL(8웰 챔버 슬라이드의 경우)으로 별도로 배양합니다. 그런 다음 이를 결합하여 DNA-지질 복합체를 생성하고 20분 동안 배양한다.
- 배양 배지를 신선한 완전한 배양 배지의 2 mL(6-웰 플레이트용) 또는 250 μL(8-well 챔버 슬라이드용)으로 교체합니다. DNA-지질 복합체를 세포에 추가하고 밤새 37°C에서 배양한다.
- 대안적으로, 양이온성 시약폴리에틸렌민(PEI)을 가진 트랜스펙트 DNA.
- DNA 2 μg와 PEI 6 μL을 완전한 배양 배지 200 μL(6웰 플레이트의 각 우물에 대해), DNA 1 μg, PEI 3 μL과 완전한 배양 배지 100 μL(8웰 챔버 슬라이드의 각 우물)과 혼합하십시오. , RT에서 10 분 동안 소용돌이및 배양.
- 혼합물을 세포에 첨가하고 도금 부피에 도달하기 위해 8웰 챔버 슬라이드에서 웰 당 6웰 플레이트 또는 150 μL의 완전한 배양 배지에 웰당 1.8 mL의 완전한 배양 배지를 추가한다.
- 형질전환 후 다음날 배지를 변경하고 2.2단계에서 설명한 바와 같이 분화 매체를 추가한다.
5. 면역 형광
- 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 세포를 헹구다. 100% 얼음 차가운 메탄올로 세포를 흔들지 않고 3분 동안 고정시다. 고정 용액을 제거하고 1x PBS로 간략하게 씻으소서.
- 실온(RT)에서 5분 동안 1x PBS에서 0.1% 비이온 계면활성제로 투과합니다. 간단히, 1 x PBS로 씻어, 3 번.
- 차단 버퍼 (0.1 % 트웬20 및 PBS에서 1 % BSA)로 세포를 인큐베이션하여 궤도 셰이커에서 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
- 적절한 1차 항체(예를 들어, 마우스 단일클론 항-Tau13 항체)로 배양하여 궤도 셰이커상에서 4°C에서 하룻밤 동안 차단 완충액에서 1:500을 희석하였다. 항체 용액을 제거하고 1x PBS로 간단히 씻으하십시오.
- 불소로 공액된 이차 항체(예를 들어, 염소 항마우스 항체가 알렉사 플루어 633에 공액화됨)를 RT에서 1시간 동안 차단 완충액에서 1:500 희석한 이차 항체와 배양하고 1x PBS로 3회 간음하였다.
- 핵을 염색하기 위해, DAPI로 배양하여 RT. 워시에서 10분 동안 차단 완충액에서 1:20,000을 1x PBS로 3회 세척하였다. 안티페이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 덮개를 장착합니다.
6. 웨스턴 블롯
- 4.4단계에서 세포 펠릿을 수집하려면, 배지를 제거하고, PBS로 세포를 세척한다. 37°C에서 4분 동안 0.1% 트립신의 500 μL로 배양한다. 완전한 배지 및 재일시 중단 셀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 5 분 동안 500 x g에서 튜브와 원심 분리기에 세포를 수집합니다. 원심 분리의 끝에서 조심스럽게 상한을 제거합니다. PBS 1 mL, 원심 분리기를 5 분 동안 500 x g에 넣고 조심스럽게 상류를 제거하십시오. 세포 펠릿을 얼음에 저장하여 즉시 사용하거나 -80°C에서 동결하여 장기간 보관하십시오.
- 총 단백질 추출물의 경우, 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 옥틸플레네옥시 폴리 (에틸렌 옥시)에탄올, 분지(재료 표),10 mM EDTA)로 보충 된 용해 완충액에서 얼음에 30 분 동안 세포 펠릿을 배양하십시오. 펠릿의 풍부에 따르면, 용해 완충제의 50 μL ~ 100 μL을 사용하십시오.
- 추출물을 15분 동안 16,000 x g에서 원심분리합니다. 20 μg의 단백질과 4x Laemmli 완충액의 5 μL을 총 부피에서 혼합하고 100 °C에서 5 분 동안 끓여 SDS-PAGE용 단백질 샘플을 준비합니다.
참고: 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.
- 추출물을 15분 동안 16,000 x g에서 원심분리합니다. 20 μg의 단백질과 4x Laemmli 완충액의 5 μL을 총 부피에서 혼합하고 100 °C에서 5 분 동안 끓여 SDS-PAGE용 단백질 샘플을 준비합니다.
- 세포내 분획의 경우, 완전한 배지에서 6.2단계에서 세포를 재중단하고 각 샘플당 1 x 106셀을 수집합니다. 500 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 다음 단계에 대한 세포 펠릿을 얻었다.
- 세포내 구획을 분리하려면 키트 사양에 따라 분별합니다. 각 분획을 분리하기 위해, 6.4 단계에서 세포 펠렛을 해당 완충액, 원심분리기로 인큐베이션하고 상온자를 수집하고 6.4.1.1-6.4.1.5에 기재된 대로 펠릿에 다음 버퍼를 추가합니다. 세포질 추출 버퍼, 멤브레인 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼 5 mM CaCl2 및 3 U/μL 마이크로 코칼 뉴클레아제 및 세포골격 추출 버퍼로 보충된 순서대로 추가합니다.
참고: 모든 버퍼는 프로테아제 억제제로 보충되어야 합니다. 셀 펠릿의 부피에 따라 버퍼 볼륨을 배율 조정합니다.- 세포분열 분획을 분리하기 위해, 4°C에서 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 세포질 추출 완충액의 100 μL에 세포 펠릿을 배양하고, 10분 동안 부드러운 혼합을 한다. 원심분리기는 4°C에서 500 x g에서 5분 동안 5°C에서 5분 간, 상급을 미리 냉각된 튜브로 옮긴다.
- 6.4.1.1 단계에서 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 막 추출 완충액 100 μL을 추가하고, 4°C에서 10분 동안 부드러운 혼합으로 4°C에서 배양하고, 4°C에서 3,000 x g에서 원심분리기를 5분 동안 5분 동안 포근을 수집합니다.
- 수용성 핵 분획의 경우, 6.4.1.2 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제제를 보충한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 배양하고, 5,000 x g에서 5°C에서 원심분리기를 5분 동안 4°C에서 배양하고, 상한체를 수집한다.
- 불용성 핵 분획의 경우, 프로테아제 억제제, CaCl2 및 마이크로코칼 뉴클레아제를 첨가한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 6.4.1.3 단계 및 와류로부터 펠릿에 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 다시 소용돌이를 보습니다. RT에서 16,000 x g의 원심분리기를 5분 간 및 상급체를 수집합니다.
- 세포골격 분획의 경우, 6.4.1.4 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제물로 보충된 50 μL의 세포골격 추출 버퍼를 추가합니다. RT. 원심분리기에서 10 분 동안 튜브를 16,000 x g에서 5 분 동안 인큐베이션하고 상류를 수집하고 펠릿을 버립니다.
참고: 키트 프로토콜에 표시된 대로 셀 볼륨에 따라 버퍼 볼륨을 확장합니다. 인큐베이션 및 원심 분리 시간 및 온도22,23,24,25,26,27,28,29에대한 자세한 내용은 키트 프로토콜을 참조하십시오. 대안적으로, 세제를 사용하고 이온 강도 및 원심분리 속도를 증가시킴으로써, 세포질, 막 결합, 세포골격 및 핵 분획을 분리하는 임의의 표준방법(30)을 사용한다. 표준 핵 추출 버퍼를 이윤을 이루에 의해 용해성 핵 분획과 용해성 핵 분획을 분리합니다. 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.
- SDS-PAGE의 경우, 6.4.1.1-6.4.1.5 단계에서 얻은 세포 내 분획의 20 μL에 4x Laemmli 완충액 7 μL을 넣고 100 °C에서 5 분 동안 끓입니다.
- 세포내 구획을 분리하려면 키트 사양에 따라 분별합니다. 각 분획을 분리하기 위해, 6.4 단계에서 세포 펠렛을 해당 완충액, 원심분리기로 인큐베이션하고 상온자를 수집하고 6.4.1.1-6.4.1.5에 기재된 대로 펠릿에 다음 버퍼를 추가합니다. 세포질 추출 버퍼, 멤브레인 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼 5 mM CaCl2 및 3 U/μL 마이크로 코칼 뉴클레아제 및 세포골격 추출 버퍼로 보충된 순서대로 추가합니다.
- 아크릴아미드 겔에 시료를 로드하고 120V. 단백질을 250 mA에서 90분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전송하는 일정한 전압에서 전기 동거의 작업을 수행합니다.
- Ponceau 염색 용액에서 5 분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기 동동및 성공적인 블로팅을 확인하십시오. 배경이 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구어 줍니다. 트렌 20(TBST)으로 트리스 완충 식염수로 셰이커에서 10분 동안 계속 세척하여 얼룩을 제거합니다.
- 셰이커에서 RT에서 1 시간 동안 차단 용액 (TBST의 5 % 우유)으로 멤브레인을 배양하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.
- 4 °C에서 하룻밤 동안 차단 용액 (TBST에서 1 % 우유)에서 1 차 항체와 멤브레인을 혼성화하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.
- RT에서 1 시간 동안 차단 용액에서 HRP 컨쥬게이트 이차 항체로 멤브레인을 혼성화하십시오.
- 화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 검출합니다. ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화합니다. 하우스키핑 유전자의 생성물상단백질 발현을 정상화합니다: 핵용해 및 용해성 분획을 위한 히스톤 H2B, 세포질 분획및 총 추출물에 대한 GAPDH.
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Representative Results
세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다.
프로토콜 설명에 따라, SH-SY5Y 세포를 MIToTIC 후 신경유사 세포를 얻기 위해 5일 동안 RA로 처리한 다음 BDNF로 3일 동안 처리하였다(도2). RA 및 BDNF의 부재에서, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태를 가정하고 세포 덩어리를 형성한다. 예상대로, 분화 프로토콜을 시작, 덩어리가 풀고 세포는 신경구를 확산; 분화의 끝에서, 세포는 균일하게 분포되고 분지 된 신경염의 네트워크를 통해 상호 연결됩니다.
파종 다음날, 세포는 양이온 지질로 타우-NLS 또는 타우-NES 플라스미드(섹션 4.2)로 형질감염되었다. 타우-NLS 또는 타우-NES 구소를 발현하는 세포의 경우, 타우 아세포 국소화는 항타우 항체를 가진 면역형광에 의해 검출될 수 있다. 형질의 효율에 따라, 세포는 타우-NLS 또는 타우-NES로 성공적으로 형질감염된 경우 DAPI 신호 또는 빈 핵으로 세포질 염색과 병합되는 강력한 핵 염색을 각각 표시한다(그림3). 이러한 특정 신호의 부족은 비효율적인 형질전환을 나타냅니다.
다른 세포 내 구획에서 농축 된 단백질을 분석하기 위해 세포는 샘플 당 동일한 양의 세포를 처리하기 위해 수집되고 계산되었습니다. 증가하는 세제 및 이온 강도를 악용하고 원심 분리 속도를 증가시키는 표준 분획 방법은 세포 구획을 서로 분리하여 세포질, 막 결합, 세포골격을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그리고 핵 분수.
일단 핵이 분리되면, 핵 수용성 분획 및 염색질 결합 분획을 마이크로코칼 뉴클레아제의 3 U/μL 및 5 mM CaCl2를첨가하여 분리되었다.
웨스턴 블롯 분석의 경우, 각 단계에서 첨가된 다양한 양의 버퍼를 보정하기 위해, 그라데이션 프리캐스트 아크릴아미드 겔에 동일한 양의 세포질 및 막 분획및 다른 분획의 절반 부피가 적재되었다.
상이한 분획의 효율적인 분리를 확인하기 위해, 다음과 같은 항체를 이용하는 웨스턴 블롯이 수행되었다: 항-GADPH (세포골격을 제외한 모든 분획에 존재하며 특히 세포질 분획에서 농축); 항 액틴 (특히 세포골격 분획이 풍부함); 항 tubulin (특히 세포질 및 세포골격 분획이 풍부함); 안티 -H2B (핵 분획농축)(그림 4).
상이한 세포간 분획에서 이러한 마커의 농축은 분획이 잘 수행되지 않음을 나타낸다. 세포 분획에 대한 모든 프로토콜은 분획 사이의 오염의 10-15 %를 제시 할 수 있음을 주목해야한다.
일단 샘플의 성공적인 분획을 검증한 후, 서부 블롯은 총 추출물에서 핵 구획 내의 타우 및 VGluT1 신호의 신호를 확인하기 위해 수행되었다(도5). 태그가 지정되지 않은 타우는 모든 분획에서 검출할 수 있지만, 타우-NLS는 핵 구획에서 강하게 농축되어 세포질 분획에서 검출이 제대로 되지 않습니다. 반대로, 타우-NES는 세포질 분획에서 농축되고 핵 분획에서 덜 검출된다. 수용성 핵 분획에 소량의 타우-NES가 존재한다는 것은 내인성 타우처럼 핵으로 전이되고 핵 수반에 한 번 핵 수출 신호가 세포질로전좌를 허용하기 때문에 예상되어야 한다. 이 2개의 융합 단백질을 위한 다른 농축의 검출은 형질전환의 효율성 에 있는 문제를 나타낼 지도 모릅니다 또는 구조물의 복제 또는 분획에서.
웨스턴 블롯의 정량 분석은 ImageJ를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 값은 각 분획에 특이적인 하우스키핑 유전자에 대해 정규화됩니다(세포질 분획에 대한 GAPDH; 수용성 핵 및 크로마틴 결합 분획에 대한 히스톤 H2B).
그림 5B의 그래프는 타우-NLS가 수용성 핵 분획(SNF)에서 고도로 농축되고 타우-NES가 감소하는 동안 용해성 핵 분획 및 세포질 분획에서 타우의 비율을 보고합니다. 더욱이, 타우-NLS는 타우-NES가 감소하는 동안 세포질 분획(CF)에 대하여 염색질 결합 분획(CBF)에서 농축된다. SNF/CF = 1 및 CBF/CF = 1은 대조군 셀의 타우 비율에 해당합니다. 내인성 타우는 예상대로 모든 분획에서 약하게 검출할 수 있습니다. 도5C의 그래프는 서로 다른 양의 핵타우를 발현하는 샘플의 총 추출물에서 VGluT1 발현의 정량화를 보고한다. 타우-NES를 발현하는 세포에서, VGluT1 발현은 대조군 세포에서기준선 발현과 비교된다. 반대로, 태그가 지정되지 않은 타우 또는 타우-NLS를 발현하는 세포에서, VGluT1의 발현은 두 배 이상이다.
그림 1: 타우의 핵 또는 세포질 축적을 허용하는 데 사용되는 전략의 그래픽 표현. 타우-NLS는 핵칸에 축적되고 타우-NES는 제외된다. 실험 판독은 VGluT1 발현의 변조이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 대표적인 미분화 및 분화 세포 배양. 미분화 SH-SY5Y(왼쪽), RA(가운데)에 의해 분화된 세포및 RA 및 BDNF(오른쪽)에 의해 분화된 세포들의 이미지. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 면역형광에 의한 타우 아세포 농축의 대표적인 이미지. 태그가 지정되지 않은 타우, 타우-NES 또는 타우-NLS 구아를 비변형 또는 발현하는 세포의 이미지. 타우 신호는 면역형광(red)에 의해 수득되었으며, 핵 신호는 DAPI 염색(blue)에 의해 얻어졌으며, 병합된 이미지는 보고된다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 서양 얼룩에 의해 세포 분열에서 농축 된 단백질의 대표적인 검출. SH-SY5Y 세포에서 세포 분열의 서쪽 얼룩. CF = 세포질 분획; MF = 막 분획; SNF = 수용성 핵 분획; CBF = 크로마틴 바운드 분수; CKF = 시토스켈레탈 분획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 핵 타우 및 VGluT1 단백질의 대표적인 검출. (A)핵 및 세포질 분획에서 검출된 타우 단백질의 서쪽 얼룩. (B)그래프는 핵 분획 및 세포질 분획에서 타우의 비율을 보고한다. 값은 내인성 타우에서 정규화되었습니다. SNF/CF = 1 및 CBF/CF =1은 대조군 세포에서 내인성 타우 비에 해당한다. (C)VGluT1 단백질의 서양 얼룩. (D)그래프는 서로 다른 양의 핵타우를 발현하는 샘플의 총 추출물에서 VGluT1 발현의 정량화를 보고한다. 크루스칼-월리스 ANOVA 와 만 휘트니 테스트; p < 0.001, **** p < 0.0001, n.s. p > 0.05. 모든 결과는 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터 평균 ±SEM으로 도시된다. 이 대표적인 수치는 Siano 외31에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.
먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 배양에서 뉴런 유사 세포의 양호한 제제를 얻는 데 매우 중요하다. 더 낮은 조밀도가 세포 증식에 영향을 미칠 수 있기 때문에 종자 된 세포의 밀도는 특히 중요합니다. 더욱이, 세포 분획 및 웨스턴 블롯과 같은 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험의 경우, BDNF 분화 단계는 말단 분화를 허용하도록 세포 증식을 차단하여 배양내의 세포 수를 제한한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 대체 분화 프로토콜은 BDNF 대신 RA 또는 NGF만 사용합니다. 그러나, RA 후 BDNF를 첨가하면 더 나은 형태학적 분화에 도달할 수 있도록32,33,NGF는 SH-SY5Y세포(34)에서약한 신경외자 자성장을 유도한다. 더욱이, RA와 BDNF의 조합이 뉴런 마커의 발현과 함께 균질한 뉴런 집단을 수득할 수 있고증식감소(35)가광범위하게 입증되었다. 이러한 이유로 여기서 악용되는 분화 프로토콜은 RA와 BDNF를 결합합니다.
그러나, 상이한 세포외 구획에서 타우의 역할을 해부하기 위해 보고된 절차는 미분화 세포 또는 상이한 세포 유형에 대해서도 사용될 수 있다.
세포내 분획은 매우 중요한 단계이며, 상용 키트는 1 x 106 셀만 필요로 하지만 다른 절차는 훨씬 더 높은 시작 수량이 필요할 수 있습니다. 또한 표준 버퍼 및 단계가 있는 키트를 사용하면 불가피하고 필수적인 실험의 재현성을 보장합니다. 그러나, 완충제의 조성은 수시로 독점적이기 때문에, 그(것)들은 관심있는 단백질의 기능을 바꿀 수 있는 세제를 포함할 수 있고 분획의 격리를 낙관하는 것은 어려울 지도 모릅니다. 또한 최상의 조건에서도 분획 간에 10-15%의 오염이 있을 수 있습니다. 각 분획의 불량 수율은 특정 분획의 추출 버퍼에서 인큐베이션 시간을 증가시킴으로써 극복될 수 있습니다.
핵타우의 기능은 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있기 때문에, 다른 세포 구획에서 타우의 기능을 해부하는 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것이 특히 중요하다. 핵에서 특별히 지시또는 배제된 타우 구의 발현과 함께 세포간 분획을 결합하면 다른 구획에서 타우의 양을 미세하게 조정할 수 있습니다.
이 프로토콜의 이 부분에서 중요한 단계는 핵 국소화 신호 또는 핵 수출 신호로 태그가 지정된 Tau의 복제입니다. NLS의 효율성은 SV40 바이러스로부터 3XNLS 합의 서열의 존재에 의해 보장된다. 단백질의 핵 전좌는 면역 형광에 의해 쉽게 검사 될 수 있으며, 핵으로의 신호 부족은 잘못된 복제 또는 비효율적인 형질전환 때문일 수 있습니다. 반대로, 핵 수출은 NES 합의 순서에 의해 보장된다. 이 경우, 면역형광은 핵으로부터 타우의 수출을 검사할 수 있다. 그러나, 타우-NES 단백질이 핵에 진입하기 때문에 약한 핵 신호는 배제되지 않으며, 그 후, NES 서열로 인해, 시토솔로 수출된다.
지금까지 핵타우의 기능은 직접적인 개입을 보장하지 않는 상관관계에 의해서만 연구되어 왔다. 여기서 설명한 프로토콜은 타우의 특정 기능을 핵구획으로 명확하게 구별할 수 있도록 하는 제1 접근법을 제공한다. 앞서 입증된 바와 같이, 내인성 타우는 이 프로토콜에 의해 얻어진 결과에 영향을 미치지 않는다. 실제로, 내인성 타우를 발현하지 않는 비뉴런 세포에서 수행된 동일한 실험은 VGluT1 의 변경된 발현으로 이끈다. 우리는 질병 관련 유전자의 발현을 연구하기 위하여 이 프로토콜을적용했습니다 31. 어쨌든, DNA 손상에 의한 관여, 핵 보조 인자 또는 염색질과의 상호 작용과 같은 다른 핵 타우 기능을 조사하기 위해 악용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 스쿠올라 노멀 슈페리어 (SNS14_B_DIPRIMIO 의 보조금에 의해 지원되었다; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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