Method Article

Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

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La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l'isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell'escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell'invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L'obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.

Abstract

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Lo stato neuroinfiammatorio del sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo chiave nelle condizioni fisiologiche e patologiche. La microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, e talvolta i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMSDM), regolano il profilo infiammatorio del loro microambiente nel SNC. Ora è accettato che le popolazioni di vescicoli extracellulari (EV) provenienti da cellule immunitarie agiscano come mediatori immunitari. Pertanto, la loro raccolta e isolamento sono importanti per identificare il loro contenuto, ma anche valutare i loro effetti biologici sulle cellule riceventi. I dati attuali evidenziano i requisiti cronologici per l'isolamento degli EV dalle cellule della microglia o dai macrofagi del sangue, compresi i passi di ultracentrifugazione e cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC). Un'analisi proteomica non mirata ha permesso la convalida delle firme delle proteine come marcatori EV e ha caratterizzato il contenuto di EV biologicamente attivo. Gli EV derivati dalla microglia sono stati utilizzati anche funzionalmente sulla coltura primaria dei neuroni per valutarne l'importanza come mediatori immunitari nella escrescenza di neurite. I risultati hanno mostrato che i veicoli elettrici derivati dalla microglia contribuiscono a facilitare la escrescenza di neurite in vitro. Parallelamente, gli EV derivati dai macrofaci del sangue sono stati usati funzionalmente come mediatori immunitari nelle colture sferoidi delle cellule glioma C6, i risultati mostrano che questi EV controllano l'invasione delle cellule glioma in vitro. La presente relazione evidenzia la possibilità di valutare le funzioni delle cellule immunitarie mediate da EV, ma anche di comprendere le basi molecolari di tale comunicazione. Questa decifrazione potrebbe promuovere l'uso di vesciche naturali e/o la preparazione in vitro di vescicoli terapeutici al fine di imitare le proprietà immunitarie nel microambiente delle patologie del SNC.

Introduction

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Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall'ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati "microglia" sembrano essere all'interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario1. La microglia ha un'origine mieloid....

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Protocol

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1. Cultura primaria di microglia/macrofagi

  1. Cultura primaria della microglia
    1. Microglia primaria di ratto commerciale di coltura (2 x 106 cellule) (vedi la Tabella dei Materiali)nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero senza esosoma, 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL streptomicina e 9,0 g/glucosio a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
    2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 48 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.
  2. Cultura primaria dei macrofagi
    1. Coltura ratto commerciale macrofa....

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Results

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Una delle principali sfide per attribuire gli effetti biologici alle vescicle extracellulari (EV) è la capacità di isolare i veicoli elettrici dall'intero mezzo di coltura. In questo rapporto, presentiamo un metodo che utilizza l'ultracentrifugation (UC) e la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) che è accoppiato all'analisi su larga scala delle firme proteiche per convalidare i marcatori EV e identificare i composti bioattivi. I vela di macrofago o microglia sono stati isolati dal mezzo condizionato rispett.......

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Discussion

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Il sistema nervoso centrale (CNS) è un tessuto complesso in cui la comunicazione da cellula a cellula regola le normali funzioni neuronali necessarie per l'omeostasi30. I veicoli elettrici sono ora ampiamente studiati e descritti come importanti carichi molecolari per la comunicazione da cellula a cellula31. Essi forniscono specificamente un cocktail di mediatori alle cellule dei destinatari influenzando così le loro funzioni in condizioni sane e patologiche

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Il lavoro presentato è stato sostenuto dalla Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Ringraziamo con gratitudine lo strumento BICeL- Campus Scientific City per l'accesso a strumenti e consigli tecnici. Ringraziamo jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier per l'assistenza alla spettrometria di massa. Ringraziamo con gratitudine Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière per il loro forte contributo agli sviluppi scientifici e tecnici.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTEIFORME Gel proteici prefabbricati TGXBio-rad4561045EDU 
AcetonitrileFisher ChemicalsA955-1 
Filtro centrifugo Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
Bicarbonato di ammonioSigma-Aldrich9830 
Anticorpo HSP90 &alfa;/β (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
Supplemento B27 PlusGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificoBV1003 
Concentrato di reagenti colorante per il dosaggio delle proteine Bio-Rad (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
cellula di glioma di ratto C6ATCC ATCCCCL-107 
Tubi canoniciSarstedt62.554.002 
CentrifugaEppendorf5804000010 
CO2 incubatoreThermoFisher  
Microscopio confocale LSM880Carl ZeissLSM880 
Vetro di coperturaMarienfeld111580 
Piatto di coltura (60 mm)Sarstedt82.1473 
DitiotreitoloSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
Cromatografo liquido EASY-nLC 1000ThermoFisher 
Microscopio elettronico JEM-2100JEOL  
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N&primo;-acido tetraaceticoSigma-Aldrich03777-10G 
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Database FBS ExoCarta impoverito dell'esosoma
(le prime 100 proteine di Evs)  http://www.exocarta.org/
Siero fetale bovinoGibco16140071 
Siero Fetale di CavalloBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand  Sonicatore Q500 con sondaFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Mezzo di montaggio a fluorescenzaAgilentS3023 
Acido FormicoSigma-Aldrich695076 
Griglie in rame rivestite in carbonio FormvarAgar scientific LtdAGS162-3 
GlucosioSigma-AldrichG8769 
GlutaraldeideSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamideSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Microscopio a luce invertita CKX53Olympus  
L-glutamminaGibco25030-024 
LabTek II 8 pozzetti Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
Software MaxQuant (software di identificazione delle proteine)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polaccostell Brucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MetilcellulosaSigma-AldrichM6385-100G 
Acqua MiliQMerck Millipore  
LatteRegilaitREGILAIT300 
Cella per elettroforesi verticale Mini PROTEANBio-Rad1658000FC 
Colonna FPLC MonoPGE Healthcare non più disponibile
Nanosight NS300Malvern PanaliticoNS300 
Software NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
Pompa a siringa NanoSightMalvern Panalytical  
Gibconeurobasale21103-049 
membrana in nitrocellulosaGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multipiatto 24 pozzettiThermoFisher82.1473 
ParaformaldeideElettromicroscopia Scienza15713 
Linea cellulare PC-12ATCC ATCCCRL-1721 
Penicillina-streptomicinaGibco15140-122 
Miscela di calibrazione di peptidiLaserBio LabsC101 
Perossidasi AffiniPura IgG anti-topo di capra (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Software Perseus (Elaborazione di proteine identificate)  https://maxquant.net/perseus/
Coniugato falloidina-tetrametilrodaminaSanta-cruzsc-362065 
FenilmetansulfonilfluoruroSigma-Aldrich78830 
Tampone fosfato Soluzione salinaInvitrogen14190094senza calcio, senza magnesio
pluriFiltro M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407 
Provette da centrifuga in policarbonatoBeckman Coulter355651 
Inibitore della proteasiSigma-AldrichS8830-20TAB
Sistemi di cellePureCol5005 
Spettrometro di massa Q-ExactiveThermoFisher 
spettrometro di massa rapifleXBrucker 
Neuroni corticali di rattoApplicazioni cellulariR882N-20Origine cellulare: Derivato da cortecce cerebrali del giorno 18 embrionale Sprague Dawley cervelli di ratto
Macrofago di ratto & Applicazioni cellulari medie di coltura della microgliaR620K-100Origine cellulare: Midollo osseo di ratto sano normale
Macrofagi primari di rattoApplicazioni cellulariR8818-10a 
Microglia primaria di rattoLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Grado di sequenziamento Tripsina modificataPromegaV5111 
Spolverinoper scivoli100204 
Cloruro di sodioScharlauSO0227 
Sodio Dodecil SolfatoSigma-AldrichL3771 
Fluoruro di sodioSigma-AldrichS7920-100G 
Idrossido di sodioScharlabSO0420005P 
Pirofosfato di sodioSigma-AldrichS6422-100G 
Concentratore sottovuoto SpeedVacThermoFisher  
Software di stringa (reti di associazione proteica funzionale)  https://string-db.org/
Substrato SuperSignal West Dura a durata estesaThermoFisher34075 
Siringa 1,0 mLTerumo8SS01H1 
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SDBio-Rad1703940 
Acido trifluoroaceticoSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlicinaEuromedexEU0550 
Interpolazione 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrifugaBeckman CoulterA95765 
Ultracentrifuga Rotore 70.1 TiBeckman Coltro342184 
Acetato di uranileAgar Scientific LtdAGR1260A 
Carta da filtro WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
&alfa;-Acido ciano-4-idrossicinnamicoSigma-AldrichC2020-25G 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

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