Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare

Sommario

La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l'isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell'escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell'invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L'obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.

Abstract

Lo stato neuroinfiammatorio del sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo chiave nelle condizioni fisiologiche e patologiche. La microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, e talvolta i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMSDM), regolano il profilo infiammatorio del loro microambiente nel SNC. Ora è accettato che le popolazioni di vescicoli extracellulari (EV) provenienti da cellule immunitarie agiscano come mediatori immunitari. Pertanto, la loro raccolta e isolamento sono importanti per identificare il loro contenuto, ma anche valutare i loro effetti biologici sulle cellule riceventi. I dati attuali evidenziano i requisiti cronologici per l'isolamento degli EV dalle cellule della microglia o dai macrofagi del sangue, compresi i passi di ultracentrifugazione e cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC). Un'analisi proteomica non mirata ha permesso la convalida delle firme delle proteine come marcatori EV e ha caratterizzato il contenuto di EV biologicamente attivo. Gli EV derivati dalla microglia sono stati utilizzati anche funzionalmente sulla coltura primaria dei neuroni per valutarne l'importanza come mediatori immunitari nella escrescenza di neurite. I risultati hanno mostrato che i veicoli elettrici derivati dalla microglia contribuiscono a facilitare la escrescenza di neurite in vitro. Parallelamente, gli EV derivati dai macrofaci del sangue sono stati usati funzionalmente come mediatori immunitari nelle colture sferoidi delle cellule glioma C6, i risultati mostrano che questi EV controllano l'invasione delle cellule glioma in vitro. La presente relazione evidenzia la possibilità di valutare le funzioni delle cellule immunitarie mediate da EV, ma anche di comprendere le basi molecolari di tale comunicazione. Questa decifrazione potrebbe promuovere l'uso di vesciche naturali e/o la preparazione in vitro di vescicoli terapeutici al fine di imitare le proprietà immunitarie nel microambiente delle patologie del SNC.

Introduzione

Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall'ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati "microglia" sembrano essere all'interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario¹. La microglia ha un'origine mieloide e deriva dal sacco di tuorlo durante l'ematopoiesi primitiva per colonizzare il cervello, mentre i macrofagi periferici sono derivati dal fegato fetale durante l'ematopoiesi definitiva per diventare macrofagi periferici². Le cellule di microglia comunicano con neuroni e cellule gliali derivate da neuroni come astrociti e oligodendrociti³. Diversi studi recenti hanno dimostrato che le microglia sono coinvolte nella plasticità neuronale durante lo sviluppo del SNC e l'omeostasi del tessuto adulto, e anche nello stato infiammatorio associato alle malattie neurodegenerative^4,5. In caso contrario, l'integrità della barriera ematoence-encefalica può essere compromessa in altre patologie CNS. Le risposte immunitarie, soprattutto nel cancro del glioblastoma multiforme, non sono supportate solo dalle microglia come la barriera elica viene riorganizzata attraverso processi angiogenici e la presenza di vasi linfatici^6,7. Pertanto, un'infiltrazione di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) si verifica nel tumore cerebrale durante i meccanismi di angiogenesi dipendenti dal tumore⁸. Le cellule tumorali esercitano un'influenza significativa sui BMM infiltrati che portano alle proprietà immunosoppressive e alla crescita del tumore⁹. Così la comunicazione tra le cellule immunitarie e il loro microambiente cerebrale è difficile da capire in quanto l'origine cellulare e i segnali di attivazione sono diversi^10,11. È quindi interessante comprendere le funzioni delle firme molecolari associate alle cellule immunitarie in condizioni fisiologiche. A questo proposito, la comunicazione cellule-cellule tra cellule immunitarie e microambiente cellulare può essere studiata attraverso il rilascio di vesciche extracellulari (EV).

I VE sono sempre più studiati nella regolazione delle funzioni immunitarie in condizioni sane e patologiche^12,13. Due popolazioni, esosomi e microvescicoli, possono essere prese in considerazione. Presentano diverse biogenesi e gamme di dimensioni. Gli esosomi sono vesciche di diametro compreso tra 30 e 150 nm e sono generati dal sistema endosomico e secreti durante la fusione di corpi multivessicolari (MVB) con la membrana plasmatica. I microvescicoli hanno un diametro di circa 100-1.000 nm e sono generati da un germogliamento esteriore dalla membrana plasmatica cellulare¹⁴. Poiché la discriminazione esosoma contro microvescicolo è ancora difficile da realizzare in base alle dimensioni e ai modelli molecolari, useremo solo il termine EV nella presente relazione. La comunicazione associata a EV nel SNC rappresenta un meccanismo ancestrale poiché gli studi hanno mostrato il loro coinvolgimento nelle specie invertebrate tra cui nematodi, insetti o annelidi^15,16. Inoltre, i risultati che mostrano che i veicoli elettrici possono comunicare con cellule di diverse specie dimostrano che questo meccanismo è un sistema di blocco a chiave, basato prima sul riconoscimento superficie-molecola tra vescicoli e cellule riceventi e quindi consentendo l'assorbimento di mediatori^16,17. Infatti, gli EVi contengono molte molecole come proteine (ad esempio, enzimi, trasduzione del segnale, fattore biogenesi), lipidi (ad esempio, ceramide, colesterolo) o acidi nucleici (ad esempio DNA, mRNA o miRNA) che agiscono come regolatori diretti o indiretti delle attività delle cellule riceventi¹⁴. Ecco perché sono stati effettuati studi metodologici anche sulle cellule immunitarie per isolare i veicoli elettrici e caratterizzare completamente le loro firme proteiche^18,19.

I primi studi hanno dimostrato il rilascio di esosomi dalla microglia primaria di ratti coltivati come meccanismo inducibile dopo un'attivazione Wnt3a- o serotonina-dipendente^20,21. Funzionalmente nel SNC, gli EV derivati dalla microglia regolano il rilascio di vesciboli era sinaptiche da terminali pressinaptici nei neuroni che contribuiscono al controllo dell'eccitabilità neuronale^22,23. Gli EV derivati dalla microglia potrebbero anche propagare la risposta infiammatoria mediata da citochine nelle grandi regioni cerebrali^24,25. È importante sottolineare che i diversi ligandi per la famiglia di recettori a pedaggio potrebbero attivare produzioni specifiche di veicoli elettrici nella microglia²⁶. Ad esempio, studi in vitro mostrano che le linee cellulari microglia BV2 attivate da LPS producono contenuti EV differenziali, tra cui citochine pro-infiammatorie²⁷. Pertanto, la diversità funzionale delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nel SNC, nella microglia e nell'infiltrazione di BMM, potrebbe essere valutata attraverso le proprie popolazioni di EV, tra cui l'impatto EV sulle cellule riceventi e l'identificazione del contenuto di EV.

In precedenza abbiamo descritto metodi per valutare le proprietà funzionali degli EV derivati da microglia e BMDM dopo il loro isolamento^16,19. Nella presente relazione, proponiamo di valutare in modo indipendente l'effetto dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sull'escrescenza dei neuriti e l'effetto dei VE derivati dai macrofaci sul controllo degli aggregati cellulari del glioma. Questo studio propone anche un'ampia analisi proteomica delle frazioni EV al fine di convalidare la procedura di isolamento EV e identificare le firme proteiche biologicamente attive. Gli effetti benefici e la decifrazione molecolare del contenuto di EV potrebbero aiutare la loro possibile manipolazione e uso come agenti terapeutici nei disturbi cerebrali.

Protocollo

1. Cultura primaria di microglia/macrofagi

1. Cultura primaria della microglia
   1. Microglia primaria di ratto commerciale di coltura (2 x 10⁶ cellule) (vedi la Tabella dei Materiali)nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero senza esosoma, 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL streptomicina e 9,0 g/glucosio a 37 gradi centigradi e 5% di CO_2.
   2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 48 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.
2. Cultura primaria dei macrofagi
   1. Coltura ratto commerciale macrofaages primario (1 x 10⁶ cellule) nel mezzo fornito dal produttore (vedi la tabella dei materiali) a 37 e 5% CO₂, con siero privo di esosomi.
   2. Raccogliere il mezzo condizionato dopo una coltura di 24 h e procedere all'isolamento dei veicoli elettrici.

2. Isolamento dei veicoli elettrici

1. Pre-isolamento dei veicoli elettrici dal mezzo condizionato
   1. Trasferire il mezzo di coltura condizionato dalle colture microglia o macrofagi (passaggi 1.1.2 o 1.2.2) in un tubo conico.
   2. Centrifuga a 1.200 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per pellet le cellule.
   3. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo conico. Centrifuga a 1.200 x g per 20 min a RT per eliminare i corpi apoptotici.
   4. Trasferire il supernatante in un tubo in policarbonato da 10,4 mL e trasferire il tubo in un rotore Ti 70.1. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 90 min a 4 gradi centigradi per pelletare gli EV.
   5. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet contenente eV in 200 .ll di 0,20 m filtrato fosfato buffer salina (PBS).
2. Isolamento dei veicoli elettrici
   1. Preparazione della colonna cromatografia di esclusione delle dimensioni fatta in casa (SEC)
      1. Svuotare una colonna di cromatografia di vetro (lunghezza: 26 cm; diametro: 0,6 cm) (vedere la tabella dei materiali), lavarla e sterilizzarla.
      2. Posizionare un filtro di 60 m nella parte inferiore della colonna.
      3. Impilare la colonna con la matrice di filtrazione gel di agarose cross-linked per creare una fase stazionaria di un diametro di 0,6 cm e un'altezza di 20 cm.
      4. Risciacquare la fase con 50 mL di 0,20 m di PBS filtrato. Conservare a 4 gradi centigradi per essere utilizzati in un secondo momento, se necessario.
   2. Posizionare il pellet EV risospeso sopra la fase stazionaria della colonna SEC.
   3. Raccogliere 20 frazioni sequenziali di 250 gradi l pur continuando ad aggiungere PBS filtrato di 0,20 m sulla parte superiore della fase stazionaria per evitare l'essiccazione della colonna. Se necessario, conservare le frazioni a -20 gradi centigradi.
      NOT: Un'immagazzinamento più lungo di una settimana può essere eseguito a -80 gradi centigradi per mantenere l'integrità di EV per l'analisi molecolare.
3. Analisi della spettrometria di massa della desorptiazione laser assistita a matrice delle frazioni SEC
   1. Procedere all'isolamento EV come descritto nella sezione 2.2.
   2. Risospendere il pellet EV con 200 l di soluzione di miscela di calibrazione peptide (vedere la Tabella dei Materiali).
   3. Procedere alla raccolta EV come descritto nelle sezioni da 2.2.1 a 2.2.3.
   4. Asciugare completamente la frazione con un concentratore a vuoto.
   5. Ricostituire le frazioni con 10 o L di 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA).
   6. Mescolare 1 -L di frazione ricostituita con 1 -L di matrice di acido idrinamomico (HCCA) su una piastra bersaglio in acciaio lucido MALDI.
   7. Analizza tutte le frazioni con uno spettrometro di massa MALDI.
   8. Analizzare gli spettri generati con un software dedicato (vedere Tabella dei materiali).

3. Caratterizzazione dei veicoli elettrici

1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
   NOTA: L'analisi NTA viene eseguita con uno strumento di analisi del monitoraggio delle nanoparticelle (vedere la tabella dei materiali) e una pompa di siringa automatizzata.
   1. Effettuare una diluizione (intervallo da 1:50 a 1:500) di ogni frazione SEC dal punto 2.2.3 con PBS filtrato da 0,20 m.
   2. Vorticare la soluzione per eliminare gli aggregati EV.
   3. Mettere la soluzione diluita in una siringa da 1 mL e metterla nella pompa di siringa automatica.
   4. Regolare l'impostazione Fotocamera sul livello di guadagno dello schermo (3) e sul livello della fotocamera (13).
   5. Fare clic su Esegui e avviare lo script seguente.
      1. Caricare il campione nella camera di analisi (tasso di infusione: 1.000 per 15 s).
      2. Diminuire e stabilizzare il flusso di velocità per la registrazione video (velocità di infusione: 25 per 15 s). Cattura tre video da 60 s consecutivi del flusso di particelle.
      3. Regolare il livello della telecamera (13) e la soglia di rilevamento (3) prima dell'analisi dei video. Fare clic su Impostazioni. Ok per avviare l'analisi e fare clic su Esporta quando l'analisi è fatta.
   6. Tra ogni analisi frazionaria, lavare con 1 mL di 0,20 m di PBS filtrato.
2. Analisi della microscopia elettronica (EM)
   1. Isolare i veicoli elettrici come descritto nella sezione 2.
      NOT: Non sono richieste condizioni sterili.
   2. Ripetere la sezione 3.1 per quantificare i veicoli elettrici.
      NOT: Solo le frazioni positive saranno utilizzate per l'analisi dei risultati.
   3. Utilizzare un filtro centrifugo da 50 kDa (vedere Tabella dei materiali)per concentrare le frazioni SEC contenenti EV.
   4. Risospendere gli EV concentrati in 30 -L del 2% di paraformaldeide (PFA).
   5. Caricare 10 l del campione su una griglia di rame rivestita in carbonio.
   6. Incubare per 20 min in un ambiente umido.
   7. Ripetere i passaggi 3.2.5 e 3.2.6 per un buon assorbimento del campione sulla griglia.
   8. Trasferire la griglia in una goccia di 1% glutaraldeide in PBS per 5 min a RT.
   9. Lavare il campione con acqua ultrapura più volte.
   10. Contrapporre il campione per 10 min sul ghiaccio con una miscela del 4% di acetato uranilo e 2% di metilcellulosa (1:9, v/v). Rimuovere l'eccesso di miscela utilizzando una carta da filtro.
   11. Asciugare il campione e osservarlo al microscopio elettronico a 200 kV (vedere la Tabella dei Materiali).
3. Analisi delle macchie occidentali
   1. Estrazione di proteine
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici.
      2. Miscelare 50 -L di buffer DI RIPA (150 mM di cloruro di sodio [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acido [EGTA], 2 mM acido etilenedia-tetractica [EDTA], 100 mM di fluoruro di sodio [NaF], 10 mM di pirofafosfato di sodio, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmetathanesulfonyl fluoruro [PMSF], 1x inibitore di proteasi) con il campione di EV (25 anni L risultante dalla concentrazione EV sul filtro) per 5 min ghiaccio su proteine.
      3. Sonicare per 5 s (ampiezza: 500 W; frequenza: 20 kHz), 3 volte sul ghiaccio.
      4. Rimuovere i detriti vescicolari con centrifugazione a 20.000 x g per 10 min, a 4 gradi centigradi.
      5. Raccogliere il supernatante e misurare la concentrazione proteica con il metodo di saggio della proteina Bradford.
   2. Sodio dodecyl solfato poliacrilamina gel elettroforesi (SDS-PAGE) e gonfiaggio occidentale
      1. Estraenti proteici mix (30 g) con buffer di campione 5c Laemmli (v/v).
      2. Caricare la miscela proteica su un gel poliacrilammide del 12%.
      3. Migrare le proteine nel gel con tampone TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine, e 0.1% SDS), a 70 V per 15 min e 120 V per 45 min.
      4. Trasferire le proteine sulla membrana della nitrocellulosa con sistema semi-asciutto a 230 V per 30 min.
      5. Saturare la membrana per 1 h a RT con buffer di blocco (0,05% Tween 20 w/v, 5% latte in polvere w/v in PBS 0,1 M, pH 7,4).
      6. Incubare la membrana durante la notte a 4 gradi centigradi con l'anticorpo anti-umano di shock termico monoclonale del topo 90 (HSP90) diluito nel buffer di blocco (1:100).
      7. Lavare la membrana tre volte con PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) per 15 min.
      8. Incubare la membrana per 1 h a RT con anticorpo secondario IgG con coniugato di rafano di capra conossidasi anti-topo diluito diluito nel buffer di blocco (1:10,000).
         NOT: Un controllo negativo viene eseguito utilizzando solo anticorpi secondari.
      9. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 3.3.2.7).
      10. Rivelare la membrana con una maggiore chemiluminescenza (ECL) kit di substrato di gonfiazione occidentale (vedere Tabella dei materiali).
4. Analisi proteomica
   1. Estrazione di proteine e digestione in gel
      1. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.3 per isolare e concentrare i veicoli elettrici. Ripetere il passaggio 3.3.1 per l'estrazione di proteine EV.
      2. Eseguire la migrazione delle proteine nel gel di impilamento di un gel poliacrilammide 12%.
      3. Fissare le proteine nel gel con coomassie blu per 20 min a RT.
      4. Accisa ogni pezzo di gel colorato e tagliarlo in piccoli pezzi di 1 mm³.
      5. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 gradi di ciascuna soluzione: acqua ultrapura per 15 min, 100% acetonitrile (ACN) per 15 min, 100 mm di bicarbonato di ammonio (NH₄HCO₃) per 15 min, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con agitazione continua.
      6. Asciugare completamente i pezzi di gel con concentratore a vuoto.
      7. Eseguire la riduzione delle proteine con 100 mL di 100 mM NH₄HCO₃ contenenti 10 mM dithiothreitol per 1 h a 56oC.
      8. Eseguire l'alchilazione proteica con 100 mL di 100 mM NH₄HCO₃ contenenti 50 mM iodoacetamide per 45 min al buio a RT.
      9. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 l di ogni soluzione: 100 mM di NH₄HCO₃ per 15 min, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) per 15 min e 100% ACN per 5 min con un agitazione continua.
      10. Asciugare completamente i pezzi di gel con un concentratore a vuoto.
      11. Eseguire la digestione delle proteine con 50 gradi l di trypsin (12,5 g/mL) in 20 mM NH₄HCO₃ durante la notte a 37 .
      12. Estrarre le proteine digerite dal gel con 50 - L di 100% ACN per 30 min a 37 gradi centigradi e poi 15 min a RT con agitazione continua.
      13. Ripetere due volte le seguenti procedure di estrazione: 50 : L del 5% TFA in 20 mM NH₄HCO₃ soluzione per 20 min con agitazione continua.
      14. Aggiungere 100 L di 100% ACN per 10 min con agitazione continua.
      15. Proteine digerite a secco con concentratore di vuoto e risospendono in 20 gradi l uno dello 0,1% di TFA.
      16. Desala il campione utilizzando una punta di pipetta da 10 luna con mezzi di deformazione inversa C18 per il desalamento e la concentrazione di peptidi (vedi tabella dei materiali) e peptidi elusi con acido formico ACN:0.1% (FA) (80:20, v/v).
      17. Asciugare completamente il campione con un concentratore di vuoto e risospendere in 20 gradi L di ACN:0.1% FA (2:98, v/v) per la spettrometria di massa tandem di cromato liquida (LC-MS/MS).
   2. LC-MS/MS Analisi
      1. Caricare il peptide digerito nello strumento LC-MS/MS ed eseguire l'analisi dei campioni e dei dati in base ai parametri descritti in dettaglio altrove⁴².
   3. Analisi dei dati grezzi
      1. Elaborare i dati di spettrometria di massa per identificare le proteine e confrontare le proteine identificate di ogni campione con un pacchetto software proteomico quantitativo utilizzando parametri standard.
      2. Esportare, utilizzando parametri standard, l'elenco delle proteine esclusive e sovrarappresentate da campioni positivi EV in un software che prevede reti proteiche e processi biologici.
      3. Confrontare l'elenco delle proteine identificate nelle frazioni con i primi 100 marcatori EV del database Open Access di Exocarta (vedere la Tabella dei materiali).

4. Analisi degli effetti EV funzionali

1. Ansaggio delle esocre Neurite sulla linea cellulare PC-12
   1. Coltura PC12 linea cellulare in media DMEM completa (2 mM L-glutamine, 10% siero di cavallo fetale (FHS), 5% siero bovino fetale (FBS), 100 UI / mL penicillina, 100 g / mL streptomycin).
      NOT: I sera sono esosomiliberi in tutta la procedura.
   2. Aggiungere un vetro di copertura (tutti i pozzetti) a una piastra di 24 pozzetti; rivestire la piastra con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e seme 260.000 cellule/bene.
   3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂.
   4. Dopo 24 h di incubazione, cambiare il mezzo in dMEM medio (DMEM con 2 mM L-glutamina, 0.1% FHS, 100 UI/mL penicillina, 100g/mL streptomicina) con 1 x 10⁶ microglia EV (dal punto 1.1.2).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di differenziazione.
   5. Al giorno 4 dopo la seeding, caricare tutti i pozze con 100 l di mezzo DMEM completo.
   6. Al giorno 7 dopo la semina, fissare le cellule con 4% PFA per 20 min a RT e risciacquare tre volte (10 min ciascuno) con PBS.
   7. Macchiare le cellule con phalloidinr rhodamina coniugata per 30 min a 4 gradi centigradi e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
   8. Macchiare le cellule con Hoechst 33342 diluito (1:10,000) per 30 min a RT e risciacquare 3 volte (10 min ciascuno) con PBS.
   9. Montare il vetro di copertura su uno scivolo con supporto di montaggio fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
   10. Analizzare la diapositiva con un microscopio confocale, prendere 5 immagini casuali di ogni diapositiva.
   11. Misurare la crescita neurite utilizzando un software di quantificazione automatica (lunghezza totale neurite) come descritto in dettaglio altrove⁴³.
2. Escrescenza di Neurite sui neuroni primari del ratto
   1. Ricoprire un vetrino a 8 pozzetti con poli-D-lysina (0,1 mg/mL) e laminina (20 g/mL).
   2. Coltura ratto neuroni primari commerciali in un mezzo di coltura appropriato (vedi Tabella dei materiali) placcando 50.000 cellule per pozzo e incubando le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂ per 48 h.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
   3. Aggiungere 1 x 10⁶ microglia EV al mezzo di coltura neuronale e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂ per 48 h in più.
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza microglia EV nel mezzo di coltura del neurone.
   4. Seguire i passaggi da 4.1.6 a 4.1.9 per correggere e macchiare le celle.
   5. Seguire i passaggi 4.1.10 e 4.1.11 per analizzare la diapositiva.
3. Invasione della cellula Glioma
   1. Risospendere le cellule del glioma del ratto C6 nel mezzo DMEM completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotici) contenenti il 5% di collagene ad una concentrazione finale di 8.000 cellule in 20.
      NOT: I sera sono esosomiti nell'intera procedura.
   2. Posizionare 5 mL di PBS sul fondo di un piatto di coltura tissutale di 60 mm. Invertire il coperchio e le gocce di deposito di 20 l (8.000 celle) di sospensione cellulare sul fondo del coperchio.
   3. Invertire il coperchio sulla camera inferiore riempita da PBS e incubare la piastra a 37 e 5% DI CO₂ per 72 h fino a formare sferoidi cellulari.
   4. Aggiungere 1 x 10⁸ EV macrofalo (dal punto 1.2.2) a una miscela di collagene da 2,2 mg/mL (2 mL di soluzione di collagene bovino I [3 mg/mL] con 250 x 10x minimo mezzo essenziale (MEM) e 500 - L di 0,1 M di idrossido di sodio).
      NOT: La condizione di controllo viene eseguita senza eV macrofaci nella miscela di collagene.
   5. Distribuire la miscela di collagene contenente eV in una piastra di 24 pozze per incorporare sferoidi cellulari.
   6. Impiantare gli sferoidi cellulari appena formati al centro di ogni pozzo.
   7. Incubare la piastra per 30 min a 37oC e 5% CO₂ per solidificare il gel.
   8. Successivamente, sovrapporre 400 l di mezzo DMEM completo sulla matrice di collagene in ogni pozzo.
   9. Incubare il sistema completo per un totale di 6 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂.
      NOT: L'invasione cellulare fuori dallo sferoide è monitorata dalla fotografia digitale utilizzando un microscopio luminoso invertito utilizzando un obiettivo 4x/0.10 N.A.
   10. Acquisire immagini di ogni pozzo ogni giorno.
   11. Elaborare le immagini e quantificare l'invasione delle aree di sferoidi cellulari utilizzando il software come descritto in precedenza nel dettaglio⁴².
       NOT: Le aree di invasione e sferoide sono state normalizzate per ogni giorno alle aree di invasione e sferoidi misurate il giorno 0.

Risultati

Una delle principali sfide per attribuire gli effetti biologici alle vescicle extracellulari (EV) è la capacità di isolare i veicoli elettrici dall'intero mezzo di coltura. In questo rapporto, presentiamo un metodo che utilizza l'ultracentrifugation (UC) e la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) che è accoppiato all'analisi su larga scala delle firme proteiche per convalidare i marcatori EV e identificare i composti bioattivi. I vela di macrofago o microglia sono stati isolati dal mezzo condizionato rispett...

Discussione

Il sistema nervoso centrale (CNS) è un tessuto complesso in cui la comunicazione da cellula a cellula regola le normali funzioni neuronali necessarie per l'omeostasi³⁰. I veicoli elettrici sono ora ampiamente studiati e descritti come importanti carichi molecolari per la comunicazione da cellula a cellula³¹. Essi forniscono specificamente un cocktail di mediatori alle cellule dei destinatari influenzando così le loro funzioni in condizioni sane e patologiche

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12% Mini-PROTEIFORME Gel proteici prefabbricati TGX	Bio-rad	4561045EDU
Acetonitrile	Fisher Chemicals	A955-1
Filtro centrifugo Amicon 50 kDa	Merck	UFC505024
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich	9830
Anticorpo HSP90 &alfa;/β (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
Supplemento B27 Plus	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Vortex Mixer	Benchmark Scientifico	BV1003
Concentrato di reagenti colorante per il dosaggio delle proteine Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
cellula di glioma di ratto C6	ATCC ATCC	CCL-107
Tubi canonici	Sarstedt	62.554.002
Centrifuga	Eppendorf	5804000010
CO2 incubatore	ThermoFisher
Microscopio confocale LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Vetro di copertura	Marienfeld	111580
Piatto di coltura (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
Cromatografo liquido EASY-nLC 1000	ThermoFisher
Microscopio elettronico JEM-2100	JEOL
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N&primo;-acido tetraacetico	Sigma-Aldrich	03777-10G
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Database FBS ExoCarta impoverito dell'esosoma
(le prime 100 proteine di Evs)			http://www.exocarta.org/
Siero fetale bovino	Gibco	16140071
Siero Fetale di Cavallo	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Fisherbrand  Sonicatore Q500 con sonda	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Mezzo di montaggio a fluorescenza	Agilent	S3023
Acido Formico	Sigma-Aldrich	695076
Griglie in rame rivestite in carbonio Formvar	Agar scientific Ltd	AGS162-3
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldeide	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Microscopio a luce invertita CKX53	Olympus
L-glutammina	Gibco	25030-024
LabTek II 8 pozzetti	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
Software MaxQuant (software di identificazione delle proteine)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polacco	stell Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Metilcellulosa	Sigma-Aldrich	M6385-100G
Acqua MiliQ	Merck Millipore
Latte	Regilait	REGILAIT300
Cella per elettroforesi verticale Mini PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC&	nbsp;
Colonna FPLC MonoP	GE Healthcare		non più disponibile
Nanosight NS300	Malvern Panalitico	NS300
Software NanoSight NTA v3.2	Malvern Panalytical
Pompa a siringa NanoSight	Malvern Panalytical
Gibco	neurobasale	21103-049
membrana in nitrocellulosa	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multipiatto 24 pozzetti	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldeide	Elettromicroscopia Scienza	15713
Linea cellulare PC-12	ATCC ATCC	CRL-1721
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122
Miscela di calibrazione di peptidi	LaserBio Labs	C101
Perossidasi AffiniPura IgG anti-topo di capra (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Software Perseus (Elaborazione di proteine identificate)			https://maxquant.net/perseus/
Coniugato falloidina-tetrametilrodamina	Santa-cruz	sc-362065
Fenilmetansulfonilfluoruro	Sigma-Aldrich	78830
Tampone fosfato Soluzione salina	Invitrogen	14190094	senza calcio, senza magnesio
pluriFiltro M/ 60 µ m	pluriSelect	43-50060
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407
Provette da centrifuga in policarbonato	Beckman Coulter	355651
Inibitore della proteasi	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
Sistemi di celle	PureCol	5005
Spettrometro di massa Q-Exactive	ThermoFisher
spettrometro di massa rapifleX	Brucker
Neuroni corticali di ratto	Applicazioni cellulari	R882N-20	Origine cellulare: Derivato da cortecce cerebrali del giorno 18 embrionale Sprague Dawley cervelli di ratto
Macrofago di ratto & Applicazioni cellulari medie di coltura della microglia		R620K-100	Origine cellulare: Midollo osseo di ratto sano normale
Macrofagi primari di ratto	Applicazioni cellulari	R8818-10a
Microglia primaria di ratto	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Grado di sequenziamento Tripsina modificata	Promega	V5111
Spolverino	per scivoli	100204
Cloruro di sodio	Scharlau	SO0227
Sodio Dodecil Solfato	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Idrossido di sodio	Scharlab	SO0420005P
Pirofosfato di sodio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentratore sottovuoto SpeedVac	ThermoFisher
Software di stringa (reti di associazione proteica funzionale)			https://string-db.org/
Substrato SuperSignal West Dura a durata estesa	ThermoFisher	34075
Siringa 1,0 mL	Terumo	8SS01H1
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glicina	Euromedex	EU0550
Interpolazione 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	A95765
Ultracentrifuga Rotore 70.1 Ti	Beckman Coltro	342184
Acetato di uranile	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Carta da filtro Whatman	Sigma-Aldrich	WHA10347510
&alfa;-Acido ciano-4-idrossicinnamico	Sigma-Aldrich	C2020-25G