Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Характеристика экстраклеточных пузырьков, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального воздействия на клеточную среду

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

В настоящем докладе освещаются хронологические требования к внеклеточной изоляции везикулы (EV) от микроглии или макрофагов крови. Микроглии полученных EVs были оценены как регуляторы неврит нарастания в то время как кровь макрофаг полученных EVs были изучены в контроле C6 глиомы ячейки вторжения в пробирке анализов. Цель состоит в том, чтобы лучше понять эти функции EV в качестве иммунных посредников в конкретных микросредах.

Abstract

Нейровоспалительное состояние центральной нервной системы (ЦНС) играет ключевую роль в физиологических и патологических состояниях. Микроглия, резидентиммунные клетки в головном мозге, а иногда и проникновение макрофагов из костного мозга (BMDMs), регулируют воспалительный профиль их микроокружения в ЦНС. В настоящее время принято, что внеклеточные везикулы (EV) популяций из иммунных клеток выступают в качестве иммунных посредников. Таким образом, их сбор и изоляция имеют важное значение для определения их содержания, но и для оценки их биологического воздействия на клетки-реципиента. В настоящее время данные подчеркивают хронологические требования к изоляции EV от клеток микроглии или макрофагов крови, включая ультрацентрифугацию и хроматографию размеров (SEC). Нецелевой протеомный анализ позволил валидации белковых подписей в качестве маркеров EV и охарактеризовал биологически активное содержание EV. Микроглии полученных EVs были также функционально использованы на первичной культуре нейронов, чтобы оценить их важность в качестве иммунных посредников в неврит роста. Результаты показали, что микроглии полученных EVs способствовать облегчению неврита рост в пробирке. Параллельно, кровь макрофагов полученных EVs были функционально использованы в качестве иммунных посредников в сфероидных культур клеток глиомы C6, результаты, показывающие, что эти ЭВ контролировать вторжение глиомы клеток в пробирке. В настоящем докладе подчеркивается возможность оценки функций иммунных клеток, опосредованных ЕВ, а также понимания молекулярных основ такой связи. Это расшифровка может способствовать использованию природных пузырьков и/или экстракорпорного приготовления терапевтических пузырьков для имитации иммунных свойств в микроокружении патологий ЦНС.

Introduction

Многие нейропатологии связаны с нейровоспалительным состоянием, которое является сложным механизмом, который все чаще рассматривается, но все еще плохо понимается, потому что иммунные процессы разнообразны и зависят от клеточной среды. Действительно, расстройства ЦНС систематически не связаны с теми же сигналами активации и популяциями иммунных клеток, и, таким образом, про- или противовоспалительные реакции трудно оценить как причины или последствия патологий. Мозг резидентов макрофаги называется "микроглии", как представляется, на стыке нервной и иммуннойсистемы 1. Микроглия имеют миелоидное происхождение и являются производными от желток мешок во время примитивных hematopoiesis колонизировать мозг, в то время как периферийные макрофаги являются производными от печени плода во время окончательного hematopoiesis стать периферийных макрофагов2. Клетки микроглии общаются с нейронами и нейронами, полученными глиальными клетками, такими как астроциты и олигодендроциты3. Несколько недавних исследований показали, что микроглии участвуют в нейронной пластичности во время развития ЦНС и взрослых тканей гомеостаза, а также в воспалительном состоянии, связанном с нейродегенеративными заболеваниями4,5. В противном случае, целостность гематоэнцефалического барьера может быть нарушена в других патологиях ЦНС. Иммунные реакции, особенно при мультиформе рака глиобластомы, не поддерживаются только клетками микроглии, так как гематоэнцефалический барьер реорганизуется через ангиогенные процессы и наличие лимфатических сосудов6,,7. Таким образом, большой костного мозга полученных макрофагов (BMDMs) инфильтрация происходит в опухоли головного мозга через опухолевых механизмов ангиогенеза8. Раковые клетки оказывают значительное влияние на проникнутые БМДМ, что приводит к иммуносупрессивным свойствам и росту опухоли9. Таким образом, связь между иммунными клетками и их микроокружения мозга трудно понять, как происхождение клеток и активации сигналы разнообразны10,11. Таким образом, интересно задержать функции иммунных клеток, связанных молекулярных подписей в физиологических условиях. В связи с этим, клеточная связь между иммунными клетками и микроокружением клеток может быть изучена путем высвобождения внеклеточных пузырьков (ЭВ).

EVs изучаются все больше и больше в регуляции иммунных функций в здоровых, а также патологических условиях12,13. Можно принимать во внимание две популяции, экзосомы и микровезички. Они представляют различные биогенеза и диапазоны размеров. Экзосомы представляют собой пузырьки диаметром от 30 до 150 нм и генерируются из эндозомальной системы и выделяются при слиянии многопузырьковых тел (МВБ) с плазменной мембраной. Микровезики около 100-1000 нм в диаметре и генерируются внешним почками из мембраны плазмы клетки14. Поскольку экзосома против микровесикла дискриминации по-прежнему трудно реализовать в соответствии с размером и молекулярными моделями, мы будем использовать только термин EVs в настоящем докладе. EV-ассоциированных связи в ЦНС представляет собой механизм предков, поскольку исследования показали их участие в беспозвоночных видов, включая нематод, насекомых или аннелид15,16. Кроме того, результаты, показывающие, что EVs может общаться с клетками из разных видов, демонстрируют этот механизм, чтобы быть системой блокировки ключей, основанной сначала на распознавании поверхностных молекул между пузырьками и клетками-реципиентами, а затем позволяющим поглощению посредников16,17. Действительно, EVs содержат много молекул, как белки (например, ферменты, трансдукция сигнала, биогенез фактор), липиды (например, керамид, холестерин) или нуклеиновых кислот (например, ДНК, мРНК или miRNAs), действующих в качестве прямых или косвенных регуляторов деятельности клеток-реципиентов14. Именно поэтому были проведены методические исследования на иммунных клетках для изоляции ЭВ и полной характеристики их белковых подписей18,19.

Самые ранние исследования продемонстрировали высвобождение экзосом из первичной культивируемой крысиной микроглии в качестве индуцируемого механизма после wnt3a- или серотонина-зависимой активации20,21. Функционально в ЦНС, микроглии полученных EVs регулируют синаптический везикул релиз пресинаптических терминалов в нейронах, способствующих контролю возбудимости нейронов22,23. Микроглии полученных EVs может также размножаться цитокинов опосредошной воспалительной реакции в больших областях мозга24,25. Важно отметить, что разнообразные лиганды для платных рецепторов семьи может активировать конкретные производства EVs в микроглии26. Например, исследования in vitro показывают, что LPS-активированные микроглии BV2 клеточные линии производят дифференциальное содержание EV, включая провоспалительные цитокины27. Таким образом, функциональное разнообразие субпопуляций иммунных клеток в ЦНС, микроглии и проникновения BMDMs, могут быть оценены через свои собственные популяции EV, включая воздействие EV на клетки-реципиента и идентификации содержимого EV.

Ранее мы описали методы оценки функциональных свойств микроглии и БМДМ полученных EVs после их изоляции16,19. В настоящем докладе мы предлагаем самостоятельно оценить влияние микроглий полученных ЭВ на невритный рост, а также влияние эвакуированных макрофагов на контроль агрегатов клеток глиомы. Это исследование также предлагает широкий протеомный анализ фракций EV для того, чтобы проверить процедуру изоляции EV, а также определить биологически активные подписи белка. Благотворное воздействие и молекулярной расшифровки содержимого EV может помочь их возможные манипуляции и использования в качестве терапевтических агентов в расстройства мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Первичная культура микроглии/макрофагов

  1. Первичная культура микроглии
    1. Культура коммерческих крыс первичной микроглии (2 х 106 клеток) (см. Таблица материалов) в Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) дополнены 10% экзосомы свободной сыворотки, 100 U /mL пенициллина, 100 мкг /мл streptomycin, и 9,0 г / л при 37 c и5%.
    2. Соберите кондиционированную среду после 48 h культуры и перейти к изоляции EVs.
  2. Первичная культура макрофагов
    1. Культура коммерческих крыс первичных макрофагов (1 х 106 клеток) в среде, предоставляемой производителем (см. Таблица материалов) на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2, с экзосомой свободной сыворотки.
    2. Соберите кондиционированную среду после 24 h культуры и перейти к изоляции EVs.

2. Изоляция ЭВ

  1. Предварительная изоляция ЭВ от кондиционированной среды
    1. Перенесите кондиционированную среду культуры из микроглии или макрофагов (шаги 1.1.2 или 1.2.2) в коническую трубку.
    2. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) для гранулы клеток.
    3. Перенесите супернатант в новую коническую трубку. Центрифуга при 1200 х г в течение 20 мин на RT для устранения апоптотических тел.
    4. Перенесите супернатант в поликарбонатную трубку 10,4 мл и перенесите трубку в ротор 70,1 Ti. Ультрацентрифуге при 100 000 х г в течение 90 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы гранулировать ЭВ.
    5. Откажитесь от супернатанта и отдохните гранулы, содержащие ЭВ в 200 л отфильтрованного фосфатного буфера солине (PBS).
  2. Изоляция EVs
    1. Подготовка домашней колонки хроматографии размера (SEC)
      1. Пустая стеклянная хроматографическая колонка (длина: 26 см; диаметр: 0,6 см) (см. таблицу материалов),промойте и стерилизуют его.
      2. Поместите фильтр 60 мкм в нижней части столбца.
      3. Стек колонки с перекрестным связаны агарозный гель фильтрации базы матрицы для создания стационарной фазы диаметром 0,6 см и 20 см высотой.
      4. Промыть фазу 50 мл 0,20 мкм фильтрованных PBS. Храните при 4 градусах По Цельсия, которые будут использоваться позже, если это необходимо.
    2. Поместите повторно ежевику на неподвижной фазе столбца SEC.
    3. Соберите 20 последовательных фракций по 250 л, продолжая добавлять 0,20 мкм отфильтрованного PBS в верхней части стационарной фазы, чтобы предотвратить высыхание столбца. При необходимости храните фракции при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное хранение, чем одна неделя, может быть выполнено при -80 градусах по Цельсию для поддержания целостности EV для молекулярного анализа.
  3. Матрица помогает лазерной ионизации десорбции (MALDI) анализ масс-спектрометрии фракций SEC
    1. Переход к изоляции EV, как описано в разделе 2.2.
    2. Приостановите действие гранул EV с 200 зл пептидным калибровозационным раствором (см. Таблицу Материалов).
    3. Приступить к коллекции EV, как описано в разделах 2.2.1 до 2.2.3.
    4. Полностью высушите фракцию с вакуумным концентратором.
    5. Восстановите фракции с 10 зл и 0,1% трифтороацетической кислоты (TFA).
    6. Смешайте 1 зл и восстановленную фракцию с 1 qL из матрицы q-cyano-4-гидроксициннамической кислоты (HCCA) на полированной стальной целевой пластине MALDI.
    7. Проанализируйте все фракции с помощью масс-спектрометра MALDI.
    8. Анализ генерируемых спектров с помощью специального программного обеспечения (см. Таблицу Материалов).

3. Характеристика ЭВ

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Анализ NTA выполняется с помощью инструмента анализа наночастиц (см. таблицу материалов)и автоматизированного шприца насоса.
    1. Сделайте разбавление (диапазон от 1:50 до 1:500) каждой фракции SEC от шага 2.2.3 с 0.20 мкм фильтруемых PBS.
    2. Vortex решение для устранения EV агрегатов.
    3. Положите разбавленный раствор в шприц 1 мл и поместите его в автоматический шприц насос.
    4. Отрегулируйте настройку камеры до уровня увеличения экрана (3) и уровня камеры (13).
    5. Нажмите на Run и запустите следующий сценарий.
      1. Загрузите образец в камеру анализа (скорость инфузии: 1000 на 15 с).
      2. Уменьшение и стабилизация скоростного потока для видеозаписи (скорость вливания: 25 на 15 с). Захват три последовательных 60 s видео потока частиц.
      3. Отрегулируйте уровень камеры (13) и порог обнаружения (3) перед анализом видео. Нажмите на настройки Ok, чтобы начать анализ и нажмите на экспорт, когда анализ сделан.
    6. Между каждым анализом фракции, мыть с 1 мл 0,20 мкм фильтруется PBS.
  2. Анализ электронной микроскопии (EM)
    1. Изолировать ЭВ, как описано в разделе 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные условия не требуются.
    2. Повторите раздел 3.1 для количественной оценки ЭВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только положительные фракции будут использоваться для анализа EM.
    3. Используйте центробежный фильтр 50 kDa (см. Таблицу Материалов),чтобы сконцентрировать ev-содержащие фракции SEC.
    4. Приостановить концентрированные ЭВ в 30 Л к 2% параформальдегида (PFA).
    5. Загрузите 10 зл образца на медную сетку с углеродным покрытием.
    6. Инкубировать в течение 20 минут во влажной среде.
    7. Повторите шаги 3.2.5 и 3.2.6 для хорошего поглощения образца на сетке.
    8. Передача сетки в падение 1% глютаральдегида в PBS в течение 5 минут на RT.
    9. Вымойте образец ультрачистой водой несколько раз.
    10. Сравните образец в течение 10 минут на льду со смесью 4% уранил ацетата и 2% метилцеллюлозы (1:9, v/v). Удалите избыток смеси с помощью фильтровальной бумаги.
    11. Высушите образец и наблюдайте его под трансмиссионным электронным микроскопом при 200 кВ (см. таблицу материалов).
  3. Западный анализ пометки
    1. Экстракция белка
      1. Повторите шаги 3.2.1 до 3.2.3, чтобы изолировать и сконцентрировать ЭВ.
      2. Смешайте 50 л буфера RIPA (150 мм хлорида натрия ,NaCl), 50 мМ Трис, 5 мм этилен гликоль-бис (2-аминоэтилетхер)-N,N,N,N,-тетраацетической кислоты «EGTA», 2 мМ этилэндиамин-тетраацетика Фтор натрия 100 мМ (NAF), 10 мм пирофосфат натрия, 1% Нонидет Р-40, 1 мМ фенилметанесульфонил фторид «PMSF», 1x ингибитор протеазы) с протеизором EV (25 мл в результате концентрации EV на фильтре) на 5 минут на льду для экстрактов.
      3. Соникат на 5 с (амплитуда: 500 Вт; частота: 20 кГц), 3 раза на льду.
      4. Удалите везикулярный мусор центрифугированием при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
      5. Соберите супернатант и измерьте концентрацию белка методом протеинового ассирования Брэдфорда.
    2. Натрий додецил сульфат полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAGE) и западного blotting
      1. Смешайте экстракты белка (30 мкг) с 5c буфером образца Laemmli (v/v).
      2. Загрузите белковую смесь на 12% полиакриламидный гель.
      3. Мигрируйте белки в гель с буфером TGS (25 мм Tris pH 8.5, 192 mM Глицин, и 0.1% SDS), при 70 V за 15 мин и 120 В в течение 45 мин.
      4. Перенесите белки на мембрану нитроцеллюлозы с полусухой системой при 230 В в течение 30 мин.
      5. Насыщенный мембраны в течение 1 ч на RT с блокирующим буфером (0.05% Tween 20 w/v, 5% сухого молока w/v в 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. Инкубировать мембрану на ночь при температуре 4 градусов С с помощью мыши моноклонального античеловеческого теплошокового белка 90 (HSP90) антитела, разбавленного в блокирующем буфере (1:100).
      7. Вымойте мембрану три раза с PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) в течение 15 мин.
      8. Инкубировать мембрану в течение 1 ч на RT с козьим хреном пероксидаза-конъюгированных анти-мыш IgG вторичного антитела разбавленной в блокирующем буфере (1:10,000).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль выполняется с использованием вторичных антител в одиночку.
      9. Повторите шаг стирки (шаг 3.3.2.7).
      10. Выявить мембрану с усиленной химилюминесценции (ECL) западный набор поместья субстрата (см. Таблица материалов).
  4. Протеомный анализ
    1. Экстракция белка и переваривание в геле
      1. Повторите шаги 3.2.1 до 3.2.3, чтобы изолировать и сконцентрировать EVs. Повторите шаг 3.3.1 для экстракции белка EV.
      2. Выполните белковую миграцию в укладке геля 12% полиакриламидного геля.
      3. Зафиксировать белки в геле с coomassie синий в течение 20 мин на RT.
      4. Акциз каждый цветной кусок геля и разрезать его на мелкие кусочки 1 мм3.
      5. Вымойте кусочки геля последовательно с 300 зл и l каждого раствора: ультрачистая вода в течение 15 мин, 100% ацетонитрил (ACN) на 15 мин, 100 мМ аммоний бикарбонат (NH4HCO3) за 15 мин, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин, и 100% ACN в течение 5 минут с непрерывным перемешиванием.
      6. Высушите полностью гелевые кусочки с вакуумным концентратором.
      7. Выполните сокращение белка с 100 мм NH4HCO3, содержащим 10 мМ дитиотрейтол на 1 ч при 56 градусах Цельсия.
      8. Выполните алкилирование белка с 100 мкм 100 мм NH4HCO3, содержащим 50 мМ йодоацетамида в течение 45 минут в темноте на RT.
      9. Вымойте гель кусочки последовательно с 300 мл каждого раствора: 100 мМ NH4HCO3 для 15 мин, ACN:20 мМ NH4HCO3 (1:1, v/v) в течение 15 мин, и 100% ACN в течение 5 минут с непрерывным перемешиванием.
      10. Полностью высушите кусочки геля вакуумным концентратором.
      11. Выполните переваривание белка с 50 зл трипсина (12,5 мкг/мл) в 20 мМ NH4HCO3 ночь при 37 градусах Цельсия.
      12. Извлекайте переваренные белки из геля с 50 qL 100% ACN в течение 30 минут при 37 градусах По Цельсию, а затем 15 мин на RT с непрерывным перемешиванием.
      13. Повторите следующие процедуры экстракции дважды: 50 л 5% TFA в 20 мМ NH4HCO3 раствор для 20 минут с непрерывным перемешиванием.
      14. Добавьте 100 л 100% ACN в течение 10 минут с непрерывным перемешиванием.
      15. Сухие переваренные белки с вакуумным концентратором и повторно применяемые в 20 Л л 0,1% TFA.
      16. Осальт образец с помощью 10 л пипетки отзыв с C18 обратной фазы средств для опреснения и концентрации пептидов (см. Таблица материалов) и elute пептидов с ACN:0.1% для меновой кислоты (FA) (80:20, v/v).
      17. Полностью высушите образец с вакуумным концентратором и повторно приостановите в 20 ЗЛ ACN:0.1% FA (2:98, v/v) для жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS).
    2. Анализ LC-MS/MS
      1. Загрузите переваренный пептид в инструмент LC-MS/MS и выполните анализ проб и данных в соответствии с параметрами, подробно описанными в другом месте42.
    3. Анализ необработанных данных
      1. Обработка данных масс-спектрометрии для идентификации белков и сравнения идентифицированных белков каждого образца с пакетом программного обеспечения количественной протеомики с использованием стандартных параметров.
      2. Экспорт, используя стандартные параметры, список эксклюзивных и чрезмерно представленных белков из положительных образцов EV в программном обеспечении, предсказывая белковые сети и биологические процессы.
      3. Сравните список идентифицированных белков в фракциях с 100 верхними маркерами EV из базы данных открытого доступа Exocarta (см. Таблицу Материалов).

4. Функциональные EVs Эффекты Асса

  1. Нейритный рост на линии ячейки PC-12
    1. Культура PC12 клеточной линии в полной среде DMEM (2 мМ L-глютамин, 10% фетальной сыворотки лошади (FHS), 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 UI/mL пенициллин, 100 мкг/мл streptomycin).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера экзосомы бесплатно в целом процедуры.
    2. Добавьте крышку (все колодцы) в 24-хорошую тарелку; покрыть тарелку поли-D-лизином (0,1 мг/мл) и семенами 260 000 клеток/хорошо.
    3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
    4. После 24 ч инкубации, изменить среднюю среду дифференциации DMEM (DMEM с 2 мМ L-глютамин, 0,1% FHS, 100 UI/mL пенициллин, 100 мкг/мЛ стрептомицин) с 1 х 106 микроглии EVs (от шага 1.1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние управления выполняется без микроглии EVs в среде дифференциации.
    5. На 4-й день после посева загрузите все скважины 100 л полного средства DMEM.
    6. На 7-й день после посева, исправить клетки с 4% PFA в течение 20 минут на RT и промыть три раза (10 мин каждый) с PBS.
    7. Пятно клеток с родамин-конъюгированный фаллоидин в течение 30 мин при 4 КС и промыть 3 раза (10 мин каждый) с PBS.
    8. Пятно клеток с разбавленной Hoechst 33342 (1:10000) в течение 30 минут на RT и промыть 3 раза (10 мин каждый) с PBS.
    9. Установите крышку стекла на слайд с флуоресцентной средой крепления (см. Таблица материалов).
    10. Проанализируйте слайд с помощью конфокального микроскопа, возьмите 5 случайных изображений каждого слайда.
    11. Измерьте невритный рост с помощью автоматизированного программного обеспечения количественной оценки (общая длина неврита), как подробно описано в другом месте43.
  2. Нейритный рост на крысических первичных нейронах
    1. Пальто 8-хорошо стеклянная горка с поли-D-лизин (0,1 мг/мл) и ламинин (20 мкг/мл).
    2. Культура крысы коммерческих первичных нейронов в соответствующей среде культуры (см. Таблица материалов) путем покрытия 50000 клеток на хорошо и инкубации клеток при 37 КС под 5% CO2 для 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера без экзосомного во всей процедуре.
    3. Добавьте 1 x 106 микроглии EVs к среде культуры нейрона и инкубировать на 37 c под 5% CO2 для 48 h больше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние управления выполняется без микроглии EVs в нейронной культуры среды.
    4. Выполните шаги 4.1.6 до 4.1.9, чтобы исправить и испачкать клетки.
    5. Выполните шаги 4.1.10 и 4.1.11 для анализа слайда.
  3. Вторжение клеток глиомы
    1. Resuspend C6 клетки глиомы крысы в полной среде DMEM (DMEM с 10% FBS, 2 мМ L-глютамин, 1x антибиотики), содержащие 5% коллагена при окончательной концентрации 8000 клеток в 20 Л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сера без экзосомного во всей процедуре.
    2. Поместите 5 мл PBS на дно 60 мм ткани культуры блюдо. Переворачивать крышку и депозитные капли в размере 20 кЛ (8000 клеток) клеточной суспензии на дно крышки.
    3. Переворачивать крышку на заполненную PBS нижнюю камеру и инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 72 ч до образования клеточных сфероидов.
    4. Добавьте 1 х 108 эва-макрофагов (от шага 1.2.2) к коллагеновой смеси 2,2 мг/мл (2 мл раствора коллагена i крупного рогатого скота( 3 мг/мл) с 250 л из 10-х минимальных основных средств (MEM) и 500 мл коллагена 0,1 М гидроксида натрия).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние контроля осуществляется без макрофагов EVs в коллагеновой смеси.
    5. Распределите коллагеновые смеси, содержащие ЭВ, в 24-хорошую пластину для встраивания клеточных сфероидов.
    6. Имплантация вновь образованных клеточных сфероидов в центре каждого колодца.
    7. Инкубировать пластину в течение 30 мин при 37 и 5% CO2, чтобы затвердеть гель.
    8. После этого, наложение 400 л полной среде DMEM на коллагеновой матрицы в каждой скважине.
    9. Инкубировать полную систему в общей сложности 6 дней при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторжение клеток из сфероида контролируется цифровой фотографией с помощью перевернутого светового микроскопа с помощью цели 4x/0.10 N.A.
    10. Приобретайте изображения каждого колодца каждый день.
    11. Обработка изображений и количественно вторжения клеток сфероидных областях с помощью программного обеспечения, как ранее описано в деталях42.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторжение и сфероидных областях были нормализованы за каждый день вторжения и сфероидных областях измеряется на день 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одной из основных проблем, связанных с приписыванием биологических эффектов внеклеточным пузырьками (ЭВ), является способность изолировать ЭВ от всей среды культуры. В этом отчете мы представляем метод с использованием ультрацентрифюгации (UC) и хроматографии для исключения размера (SEC), который связан с крупномасштабным анализом белковых подписей для проверки маркеров EV и выявления биологически активных соединений. Макрофаг- или микроглии полученных EVs были изолированы от условного среды после 24 ч или 48 ч культуры соответственно(Рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Стратегии сбора и изоляции внеклеточной системы Vesicle (EV). Апоптотические тела и клеточный мусор были отделены от микроглии или макрофагов-кондиционированной среды последовательными шагами центрифугации. От супернатанта, EVs были изолированы ультрацентррифегированием (UC). Гранулы UC, содержащие ЭВ, были загружены на колонку и разделены хроматографией (SEC) в 20 различных элетизированных фракциях. Как показано на дальнейших шагах (электронная микроскопия, анализ наночастиц слежения и протеомный анализ), фракции SEC были объединены и организованы в 1F-EV-, 2F-EV и 3F-EV-. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Метод следовал последовательным шагам центрифугирования: первый для удаления клеток, а второй для удаления клеточного мусора и апоптотических тел. Затем супернатант был переведен в новую трубку для выполнения ультрацентрифугирования при 100 000 х г в течение 90 мин. Пузырьки были собраны вместе с белковыми агрегатами в финальной грануле UC. Колонка SEC была использована для разделения соединений в зависимости от их размера и удаления агрегатов(рисунок 1). Для того, чтобы подтвердить изоляцию ЭВ, каждая фракция SEC следовала анализу отслеживания наночастиц(рисунок 2A).

Figure 2
Рисунок 2: Анализ фракций SEC. (A) Анализ отслеживания наночастиц (NTA) фракций SEC. Общее количество частиц в каждой фракции SEC представлено барными диаграммами. На оранжевых диаграммах баров показаны три последовательных фракции Ev (F5-F7). (B, C) Снимки экрана камеры NTA показывают значительные различия в потоке частиц между фракциями SEC. (D) Дополнительный анализ масс-спектрометрии MALDI. Из другого UC гранулы, содержащие EVs, стандартный контроль пептид набор был добавлен до разделения SEC для того, чтобы проверить выполнение стратегии SEC. Каждая фракция SEC была проанализирована с помощью матричной лазерной ионизации лазерной десорбции - время полета (MALDI-TOF) для определения стандартно-положительных фракций. В девяти первых спектрах (фракциях от 1 до 9) сигнала не наблюдалось. Обнаружение этих свободных стандартов стало возможным в следующих фракциях (фракциях от 10 до 20), подтверждающих способность процедуры SEC отделять EVs (F5-F7) от растворимых компонентов (F10-F20). (E) Западный анализ помарка фракций SEC как предварительный анализ маркера EV. Фракции Ev (F5-F7) были объединены в качестве одного образца (2F-VE), в то время как ev-фракции (F1-F4 и F8-F20 соответственно) были объединены в двух других образцах, называемых 1F-EV- и 3F-EV-. Результаты показали наличие тепло-шокового белка 90 (HSP90) (положительный маркер EV) в 2F-EV, а также в клеточном лисате как положительный контроль, по сравнению с другими фракциями (1F-EV- и 3F-EV-). (F, G) Электронный микроскопия анализа положительного образца EV (2F-EV). Наблюдение при двух последовательных увеличениях выявило наличие ЭВ в диапазоне размеров около 100 нм (белые стрелки) и около 400 нм (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Число частиц было значительно выше в фракциях 5, 6 и 7, чем в предыдущих (F1-F4) и следующих (F8-F20). В этих фракциях можно было увидеть поток частиц, даже если несколько частиц были замечены в следующих фракциях(рисунок 2B,C). Это разделение не предотвращает возможность того, что фракции, кроме F5-F7 может содержать небольшое количество пузырьков, или даже, что EV богатых фракций F5 до F7 может содержать молекулярные загрязняющие вещества. Чтобы, по крайней мере, обеспечить, чтобы фракции F5-F7 были свободны от загрязняющих молекул совместного унижающего, необходимо было следить за elution различных соединений в процедуре SEC. Для этого к аналогичному пнуле UC, который использовался ранее, были добавлены стандарты пептида контроля. Этот препарат был вновь отделен с помощью процедуры SEC. Затем, матрицы помощь лазерной ионизации лазерной - время полета (MALDI) масс-спектрометрии анализ был выполнен для того, чтобы определить SEC фракций, в которых стандарты были eluted(Рисунок 2D). Из-за массового диапазона, только ионизированные продукты из пептидных стандартов были соблюдены в этом анализе. Результаты показали, что эти продукты были обнаружены в фракциях от 10 до 20, демонстрируя, что любой растворимый белок не может быть уличен в тех же фракциях, что и EVs (F5-F7). Эти результаты подтвердили заинтересованность такого подхода в разделении ЭВ от компонентов, не связанных с EV. Даже если предположить, что фракции F8-F20 могут содержать остаточную долю ЭВ, мы решили в следующих экспериментах объединить положительные фракции EV (F5-F7) в одном образце под названием 2F-EV. Мы также объединили другие фракции SEC в два образца, называемые 1F-EV- (F1-F4) и 3F-EV- (F8-F20). Мы сгруппированы в три образца по нескольким причинам. Во-первых, количество фракций SEC увеличит время молекулярных анализов, но и функциональные исследования в пробирке. EV-положительные фракции SEC отдельно демонстрируют более низкие числа частиц, а также ставят под угрозу обнаружение молекулярных соединений. Таким же образом, было сочтено более разумным группировать фракции F8-F20, чтобы сконцентрировать, при необходимости, остаточные пузырьки и проверить их присутствие предварительным западным анализом помарка против HSP90, маркера EV. Интересно, что положительный сигнал для HSP90 был обнаружен в фракции 2F-EV, также в клеточном lysate как положительный контроль, но не в образцах 1F-EV- и 3F-EV -(Рисунок 2E и Дополнительная рисунок S1 как контроль). Этот анализ подтверждает интерес только 2F-EV и правильное управление предыдущими фракциями SEC. Чтобы подтвердить изоляцию EV, дополнительный эксперимент с использованием электронной микроскопии проанализировал только 2F-EV и позволил наблюдение EVs с типичной морфологией и неоднородностью размера между 100 и 400 нм(Рисунок 2F,G).

Другим ключевым шагом в проверке был протеомный анализ(рисунок 3). Мы разработали весь анализ масс-спектрометрии с несколькими целями: (i) подтвердить изоляцию ЭВ с обнаружением большого количества маркеров EV в 2F-EV, (ii) в конечном итоге определить загрязняющих белков в отрицательных образцах EV (1F-EV- и 3F-EV-) и (iii) характеризуют содержание белка EVs, поддерживающих их биологическую деятельность.

Figure 3
Рисунок 3: Протеомный анализ EV-положительных и EV-отрицательных образцов. (A) После трех независимых изоляций EV от аналогичных препаратов микроглии клеток, образцы 1F-EV-, 2F-EV и 3F-EV- были загружены для натрия dodecyl сульфат полиакриламидгель электрофорез (SDS-PAGE) и мигрировали до укладки гель, чтобы сконцентрировать белки для того, чтобы реализовать их в гель пищеварения. Полученные пептиды были затем проанализированы с помощью жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) для определения соответствующих белков. (B) Сравнение идентифицированных белков между образцами 1F-EV- и 2F-EV, показывающими общие белки в обеих фракциях (19) и белками, исключительно обнаруженными в фракции 2F-EV (522). Тепловая карта показывает относительное представление, где все распространенные белки между 1F-EV- и 2F-EV' триплетатами были перепредставлены (красный) в образцах 2F-EV. (C) Сравнение идентифицированных белков между фракциями 2F-EV и 3F-EV- показывая общие белки между трипликатами (113) и исключительно представленными белками (428 в 2F-EV и 11 в 3F-EV-). Тепловая карта показывает относительное представление в двух кластерах. Один (кластер А) представляет 5 перепредставленных белков в образце 3F-EV- и второй (кластер B) представляет 108 чрезмерно представленных белков в 2F-EV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Из клеточных носителей, UC и SEC процедура привела к трем образцам 1F-EV-, 2F-EV и 3F-EV-. Соответствующие белки были извлечены и сконцентрированы натрием dodecyl сульфат полиакриламида гель электрофоресис (SDS-PAGE). После короткой миграции в укладке геля, образцы были собраны группы иссечения, переданы в различных трубах, чтобы быть в гель переваривается. Продукты были разделены онлайн обратной фазы хроматографии непосредственно в сочетании с масс-спектрометр для анализа(Рисунок 3A).

Следующие результаты, как пример всей процедуры, были получены от микроглии-кондиционированной среды после культуры 48 h. Необработанные данные были представлены в базу данных крысиного белка. Идентифицированные белки были сопоставлены между образцами 1F-EV- и 2F-EV(рисунок 3B)и между образцами 2F-EV и 3F-EV-(рисунок 3C). В первом сравнении диаграмма Венна показала 19 распространенных белков в обеих фракциях и 522 белка, исключительно обнаруженных в фракции 2F-EV. Анализ с использованием программного обеспечения количественной протеомики позволил определить относительную представленность общих белков. Результаты показали тепловую карту, где все распространенные белки между 1F-EV- и 2F-EV' триплетаты были перепредставлены (красный) в образцах 2F-EV. Во втором сравнении фракций 2F-EV и 3F-EV-, 113 общих белков были выявлены между триплики. Кроме того, 428 белков были обнаружены исключительно в 2F-EV и 11 белков были обнаружены исключительно в 3F-EV-. После количественного анализа представление тепловой карты 113 распространенных белков выявило два кластера, в которых кластер А представил пять перепредставленных белков в образце 3F-EV, а кластер B представил 108 перепредставленных белков в 2F-EV.

428 белков, представленных исключительно, и 108 белков, перепредставленных в 2F-EV, были представлены в базу данных открытого доступа Exocarta для обнаружения связанных с EV молекул. Анализ 100 лучших маркеров EV в Exocarta показал наличие 86 связанных с EV белков в 2F-EV(рисунок 4A).

Figure 4
Рисунок 4: Анализ белков из образца 2F-EV. (A) Бассейн из 536 белков (428 эксклюзивных и 108 перепредставленных белков) был представлен в базу данных Exocarta для обнаружения связанных с EV молекул. Молекулярные символы 86 связанных с EV белков, обнаруженных в 100 лучших маркерах EV из базы данных Exocarta. (B) Прогнозирование белковых взаимодействий и их связи с выбранными биологическими процессами показали иммунные и нейропротекторные пути в образце 2F-EV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Интересно, что анализ 5 распространенных белков в кластере А и 11 белков, представленных исключительно в 3F-EV-, не был связан ни с каким маркером EV (данные не показаны). Наконец, предсказание белковых взаимодействий и их связь с отдельными биологическими процессами показали наличие в фракции 2F-EV, иммунных посредников (21%) иногда участвует в контроле воспалительной реакции (4.1%) (Рисунок 4B). Содержимое EV в 2F-EV также были связаны с развитием нейронов (16,8%), дифференциацией нейронов (5%) и контроль смертности нейронов (3,8%) который в соответствии со следующим невритом роста.

Таким образом, выбранная мы стратегия делает возможным доступ ко всем данным и позволяет прогнозировать функции, опосредованные EV, до биологических анализов, которые мы затем выполнили(рисунок 5).

Figure 5
Рисунок 5: EV-зависимых f некционных анализов. Эффекты микроглии полученных EVs были оценены на неврит ный рост (верхний кадр) и эффекты макрофагов полученных EVs были оценены на вторжение глиомы клеток (нижняя рамка). (A, B) Длина неврита измерялась на клетках PC-12 (Панель А была изменена из Раффо-Ромеро и др.16 с разрешения) или крысиных первичных нейронов (B). Результаты показали значительное увеличение роста по EVs (Я ЭВ) по сравнению с контролем (Ctrl). Шкала бар No 20 мкм. (C, D) Время курса C6 сфероид C6 сфероид вторжения в коллаген в присутствии крыс первичного макрофага полученных EVs (C6 и EVs) или транспортного средства (C6 управления). Сфероид c6 3D вторжение в коллаген был проверен и количественно до 6 дней. Количественная оценка вторжения опухолевых клеток показана в 1, 2, 3 или 6 дней (C), как это наблюдается на репрезентативных изображениях (D). Шкала бар 500 мкм. Для анализов неврита, значение было рассчитано непарированным тестом студента (p slt; 0.05, p slt; 0.01 и p slt; 0.001). Для анализа вторжения значение было рассчитано односторонней ANOVA, за которой последовал пост-специальный тест Туки. Бары ошибок указывают на относительную стандартную ошибку трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таким образом, нейротрофические функции микроглии полученных EVs были изучены на PC-12 клеточной линии и крыс первичных нейронов. Результаты показали положительное влияние на невритный рост(рисунок 5A,B). Присутствие ЭВ, соответственно, увеличилось примерно в 6 и 1,5 раза невритовой сети в длину и / или в количестве в PC-12 и первичных нейронов по сравнению с условием контроля. В другом контексте, мы также изучали влияние макрофагов полученных EVs на вторжение опухоли головного мозга(Рисунок 5C,D). Он был оценен с помощью 3D опухолевых сфероидов, встроенных в матрицу коллагена. Сфероиды, генерируемые клетками глиомы Крысы C6, культивировались в течение 6 дней в коллагеновой матрице, содержащей (или не содержащей) ЭВ, очищенных от среды культуры макрофагов крыс. Коллагеновая матрица обеспечивает структуру, в которую опухолевые клетки могут вторгаться и распространяться из сфероида. ЭВ с макрофагов, полученные от макрофагов, нарушили рост и вторжение сфероидов глиомы. После 6-дневной культуры, 50% снижение вторжения наблюдается в EV-обработанных сфероидов по сравнению с контролем. Этот результат показал, что макрофаги могут производить EVs с противоопухолевыми и/или антиинвазивными факторами, влияющими на рост глиомы.

Supplementary Figure S1
Дополнительная рисунок S1: Изображения мембраны, используемые для эксперимента по западному блоттингу. (A) Оригинальное изображение западного помарка с рисунка 2E (против HSP90 EV маркер). (B) Понсо окрашивающее изображение той же мембраны, показывающей правильную загрузку белковых экстрактов из образцов 1F-EV-, 2F-EV и 3F-EV-. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Центральная нервная система (ЦНС) представляет собой сложную ткань, в которой связь от клеток к клетке регулирует нормальные нейронные функции, необходимые для гомеостаза30. EVs в настоящее время широко изучены и описаны как важные молекулярные грузы для клеточной связи31. Они специально доставить коктейль посредников в клетки-реципиента тем самым влияя на их функции в здоровых и патологических условиях32. Недавние исследования показывают, что EVs играют решающую роль в ЦНС24,33,34 и особенно те из иммунных клеток мозга35,36. Баланс между про- и противовоспалительными иммунными реакциями имеет решающее значение и позволяет поддерживать целостность мозга во время синаптического развития и нейронной деятельности на протяжении всей жизни. В этом исследовании обсуждались две различные ситуации иммунной реакции: связь (i) между микроглией и нейронами и (ii) между проникающими макрофагами и клетками глиомы. Во-первых, микроглии являются резидентами макрофагов в ткани мозга, где они играют ключевую иммунную роль в управлении изменения микросреды в целях обеспечения нейронной деятельности. Но чрезмерные провоспалительные механизмы могут быть поддержаны чрезмерно активированной микроглией и привести к нейродегенеративным расстройствам37,,38. В отличие от этого, высококачественные глиомы требуют противовоспалительных профилей и включают опухолевые макрофаги (TAMs), набранные в месте опухоли. Макрофаги костного мозга (ММДМ) представляют большую популяцию этих TAMs, тесно связанных с клетками глиомы. Под влиянием опухоли, BMDMs экспонат в vivo противовоспалительные и про-опухолевые профили39. Как эти BMDMs может контролировать in vitro вторжения опухолевых клеток является одним из важнейших вопросов в этом докладе. Вот почему, макрофаг полученных EVs были использованы только в глиома сфероид вторжения анализ. Вместе в совместной культуре, клетки глиомы повлияли бы макрофаги для того чтобы произвести другие населенности EV с противовоспалительными профилями. Прямое использование иммунных ЭВ может быть гораздо лучше, как противоопухолевые средства. Следовательно, иммунные клетки поддерживают связь от клетки к клетке в определенных микросредах, где воспалительный баланс сильно зависит от внешних сигналов40,41. Понимание Е.В. опосредованные иммунные реакции представляет собой большую проблему для ограничения патогенеза многих расстройств. Идентификация биологически активного содержимого EV является одним из ключей к пониманию дисрегулируемых воспалительных процессов и предложить новые терапевтические стратегии42,43.

В этом исследовании мы представляем методологию, состоящую в дифференциальном процессе ультрацентрифирования в качестве первого шага для устранения клеточного мусора, апоптотических тел и растворимых молекул, в сочетании с хроматографией исключения размера для изоляции ЭВ от молекулярных агрегатов. Когда популяции EV оцениваются в биологических анализах, крайне важно дискриминировать содержимое EV от других совместно изолированных материалов. Вот почему мы улучшили изоляцию для того, чтобы отделить EV- от не связанных EV соединений. Добавив стандартные белки в контрольные образцы, представленные на процедуру SEC, мы смогли локализовать их фракции elution MALDI-TOF. Поскольку стандарты являются свободными молекулами, они глобально соприкасаются с молекулярными агрегатами, связанными с образцами, связанными с не ev-материалами. Таким образом, фракции EV из экспериментальных образцов были проверены в надежной процедуре изоляции. Кроме того, мы разработали стратегию двойного протеомического анализа. За исключением использования анти-HSP90 антитела западного blotting как EV маркер предварительного обнаружения, мы решили проверить правильное EV фракционирования нецелевое обнаружение EV-связанных подписей белка. Действительно, нынешний подход не был намеренно сосредоточен на обнаружении нескольких известных маркеров EV из-за недостаточной специфичности и чувствительности некоторых антител. Вариабельность и обилие некоторых маркеров EV на поверхности субпопуляций EV все еще состязательны в процедурах изоляции. Кроме того, антитела на основе методологии может представлять собой предел в большое число организмов из-за отсутствия коммерческих антител в то время как исследования EV в настоящее время горячая тема в биологии. Этот нецелевой анализ позволил выявить большее количество молекул, которые уже описаны как маркеры EV (86 белков в топ-100 EV маркеров из базы данных Exocarta). Наконец, этот подход может быть очень полезным для проверки EV изоляции от плохо описанных организмов при условии, что обнаруженные белки могут представлять значительные омологии известных маркеров EV. Как недавно описано, крупномасштабный протеомный анализ может быть альтернативой использованию лишь нескольких произвольных маркеров43. Это позволит улучшить дискриминацию фракций ЭВЗ и определить их активное содержание до использования в биологических анализах.

Действительно, необходимо усваить характеристику содержимого EV с эффектами, которые наблюдались в биологических анализах. Действительно, биологическое воздействие ЭВ на клетки-реципиенты предполагает участие везикулярных посредников или эффекторов. Опять же, тот же нецелевой анализ позволяет идентифицировать биологически активные молекулы. Возможная оптимизация в этом анализе касается типов молекул, которые можно идентифицировать. Наша стратегия была основана на крупномасштабном анализе белковых подписей и привела к прогностическим биологическим путям, связанным с иммунным ответом и выживанием нейронов. Важно учитывать другие молекулы семейства, включая липиды, мРНК и микроРНК, например. Наши текущие исследования связывают эти дополнительные идентификации с подписями белка для того, чтобы получить глобальные знания об этой EV-зависимой связи.

В предстоящие годы предусмотрено много терапевтических подходов. Учитывая, что ЭВ способны легко пересечь гематоэнцефалический барьер и достичь патологических тканей, эти молекулярные грузы могут быть использованы по-разному. Хотя это исследование не выделить EV молекул поверхности, их идентификация по-прежнему необходимо для того, чтобы лучше понять процесс адресации к клеткам-мишеням и тканям. Протеомный анализ в нашей методологии дает доступ к этим данным. В противном случае, в этом докладе, мы представили в пробирке производства EVs в качестве полезных коктейлей. Мы не оптимизировали лучшие условия, чтобы премьер или активировать иммунные клетки заранее. Этот момент имеет решающее значение, потому что, в тканях, микроокружение имеет непосредственное влияние на иммунные клетки и в конечном итоге способствует формированию биогенеза их EVs. В случае глиобластомы, например, было установлено, что раковые клетки производят свои собственные EVs, тем самым способствуя ориентировать соседние TAMs в сторону противовоспалительных профилей и их местного иммуносупрессии44,45. Это причина, почему макрофаг полученных EVs в среде глиомы отличаются от тех, которые производятся в одной культуры макрофагов. Таким образом, мы непосредственно использовали эВ-факторы, полученные из макрофагов, отдельно произведенные из единой культуры макрофагов, для контроля вторжения сфероидов глиомы, потому что ко-культура макрофаго-глиомы не имеет контроля над ростом опухоли. Дальнейшие терапевтические стратегии могут предотвратить это in vivo иммуносупрессии с помощью провоспалительных и противоопухолевых ЭВ производится в пробирке от активированных макрофагов. Аналогичная стратегия может быть использована в контексте нейродегенеративных заболеваний с помощью ЭВ, полученных из микроглии должным образом предупредил производить нейропротекторных и противовоспалительных ответ в пользу выживания нейронов. В заключение, исследования EV-опосредованной связи между иммунными клетками и in vivo микроокружения являются ключом к обеспечению лучшего понимания патогенеза и разработке инновационных терапевтических подходов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Представленная работа была поддержана Национальным министерством образования, де Л'Энсеньмент-Супьерии и ИНСЕРМ. Мы с благодарностью отмечаем BICeL- Кампус Научный городской фонд за доступ к инструментам и техническим консультациям. Мы с благодарностью признательны за помощь в масс-спектрометрии, в которой были с благодарностью юан-Паскаль Химено, Сулейман Абулуар и Изабель Фурнье. Мы с благодарностью признательны Танине Араб, Кристель ван Камп, Франсуазе ле Мартрек-Крок, Якопо Визиоли и Пьеру-Эрику Сотьеру за их значительный вклад в научно-технические разработки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Нейронаука Выпуск 160 Иммунные функции микроглии макрофаги нейроны клетки глиомы внеклеточные пузырьки
Характеристика экстраклеточных пузырьков, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального воздействия на клеточную среду
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter