Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Het onderhavige rapport belicht chronologische eisen voor extracellulaire vesicle (EV) isolatie van microglia of bloedmacrofagen. Microglia-afgeleide EV's werden geëvalueerd als regelgevers van de neurite uitgroei, terwijl bloed macrofaag-afgeleide EV's werden bestudeerd in de controle van C6 glioom cel invasie in in vitro testen. Het doel is om deze EV-functies als immuunbemiddelaars in specifieke micro-omgevingen beter te begrijpen.

Abstract

De neuro-inflammatoire toestand van het centrale zenuwstelsel (CNS) speelt een belangrijke rol in fysiologische en pathologische omstandigheden. Microglia, de inwonende immuuncellen in de hersenen, en soms de infiltrerende beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs), reguleren het ontstekingsprofiel van hun micro-omgeving in het CNS. Men aanvaardt nu dat de extracellulaire vesicle (EV) populaties uit immuuncellen fungeren als immuunbemiddelaars. Zo zijn hun verzameling en isolatie belangrijk om hun inhoud te identificeren, maar ook hun biologische effecten op ontvangende cellen te evalueren. De huidige gegevens benadrukken chronologische vereisten voor EV-isolatie van microgliacellen of bloedmacrofagen, waaronder de ultracentrifugatie en grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) stappen. Een niet-gerichte proteomische analyse liet de validatie van eiwithandtekeningen als EV-markers toe en karakteriseerde de biologisch actieve EV-inhoud. Microglia-afgeleide EV's werden ook functioneel gebruikt op de primaire cultuur van neuronen om hun belang als immuunbemiddelaars in de neurite uitgroei te beoordelen. De resultaten toonden aan dat microglia-afgeleide EV's bijdragen aan het vergemakkelijken van de neurite uitgroei in vitro. Tegelijkertijd werden bloed macrofaag-afgeleide EV's functioneel gebruikt als immuunbemiddelaars in sferoïde culturen van C6 glioomcellen, de resultaten waaruit blijkt dat deze EV's de gliomacelinvasie in vitro controleren. Dit rapport belicht de mogelijkheid om de EV-gemedieerde immuuncelfuncties te evalueren, maar ook de moleculaire basis van een dergelijke communicatie te begrijpen. Deze ontcijfering kan het gebruik van natuurlijke vikjes en/of de in vitro voorbereiding van therapeutische vikjes bevorderen om immuuneigenschappen in de micro-omgeving van CNS-pathologieën na te bootsen.

Introduction

Veel neuropathologieën zijn gerelateerd aan de neuro-inflammatoire toestand die een complex mechanisme is dat steeds meer wordt overwogen, maar nog steeds slecht begrepen omdat de immuunprocessen divers zijn en afhankelijk zijn van de celomgeving. De CNS-aandoeningen hebben immers niet systematisch dezelfde activeringssignalen en immuuncelpopulaties en dus zijn de pro- of ontstekingsremmende reacties moeilijk te beoordelen als oorzaken of gevolgen van pathologieën. De hersenen resident macrofagen genaamd "microglia" lijken te zijn op de interface tussen het zenuwstelsel en het immuunsysteem1. Microglia hebben een myeloïde oorsprong en zijn afgeleid van de dooier zak tijdens primitieve hematopoiesis om de hersenen te koloniseren, terwijl perifere macrofagen zijn afgeleid van de foetale lever tijdens definitieve hematopoiesis te worden perifere macrofagen2. De microglia cellen communiceren met neuronen en neuron-afgeleide gliacellen zoals astrocyten en oligodendrocyten3. Verschillende recente studies hebben aangetoond dat microglia betrokken zijn bij neuronale plasticiteit tijdens cns-ontwikkeling en adult tissue homeostase, en ook in de ontstekingstoestand geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten4,5. Anders kan de integriteit van de bloedhersenbarrière worden aangetast in andere CNS-pathologieën. De immuunresponsen, vooral bij de glioblastoom multiforme kanker, worden niet alleen ondersteund door microgliacellen omdat de bloedhersenbarrière wordt gereorganiseerd door angiogene processen en de aanwezigheid van lymfevaten6,7. Daarom vindt een grote beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) infiltratie plaats in de hersentumor gedurende tumorafhankelijke angiogenese mechanismen8. De kankercellen oefenen een aanzienlijke invloed uit op geïnfiltreerde BMDMs wat leidt tot immunosuppressieve eigenschappen en tumorgroei9. Zo is de communicatie tussen de immuuncellen en hun hersenen micro-omgeving is moeilijk te begrijpen als de cel oorsprong en activering signalen zijn divers10,11. Het is dus interessant om de functies van immuuncel-geassocieerde moleculaire handtekeningen in fysiologische omstandigheden te vatten. In dit verband kan de celcelcommunicatie tussen immuuncellen en celmicro-omgeving worden bestudeerd door het vrijkomen van extracellulaire adereilanden (EV's).

De EV's worden meer en meer bestudeerd in de regulatie van immuunfuncties in gezonde en pathologische aandoeningen12,13. Er kan rekening worden gehouden met twee populaties, exosomen en microvesicles. Ze presenteren verschillende biogenese en grootte bereiken. De exosomen zijn vesicles van ~ 30-150 nm diameter en worden gegenereerd uit het endosomale systeem en uitgescheiden tijdens de fusie van multivesiculaire lichamen (MVBs) met het plasmamembraan. De microvesicles zijn ongeveer 100-1.000 nm in diameter en worden gegenereerd door een naar buiten ontluikende uit de cel plasma membraan14. Omdat de exosoom versus microvesicle discriminatie is nog steeds moeilijk te realiseren op basis van de grootte en moleculaire patronen, zullen we alleen gebruik maken van de term EV's in het huidige rapport. De ev-geassocieerde communicatie in het CNS vertegenwoordigt een voorouderlijk mechanisme sinds studies hun betrokkenheid bij ongewervelde soorten, waaronder aaltjes, insecten of annelids15,16. Bovendien tonen de resultaten waaruit blijkt dat EV's kunnen communiceren met cellen van verschillende soorten, dat dit mechanisme een sleutelslotsysteem is, dat eerst gebaseerd is op oppervlaktemolecuulherkenning tussen vesicles en ontvangende cellen en vervolgens de opname van bemiddelaars16,17. De EV's bevatten namelijk veel moleculen zoals eiwitten (bijvoorbeeld enzymen, signaaltransductie, biogenesefactor), lipiden (bijvoorbeeld ceramide, cholesterol) of nucleïnezuren (bijvoorbeeld DNA, mRNA of miRNAs) die fungeren als directe of indirecte regelgevers van de ontvangende celactiviteiten14. Daarom werden ook methodologische studies uitgevoerd op immuuncellen om EV's te isoleren en hun eiwithandtekeningen volledig te karakteriseren18,19.

De vroegste studies toonden het vrijkomen van exosomen uit primaire gekweekte rat microglia als een induceerbaar mechanisme na een Wnt3a- of serotonine-afhankelijke activering20,21. Functioneel in het CNS, microglia-afgeleide EV's reguleren de synaptische blaasjes release door presynaptische terminals in neuronen bij te dragen aan de controle van de neuronale prikkelbaarheid22,23. Microglia-afgeleide EV's kunnen ook cytokines-gemedieerde ontstekingsrespons verspreiden in grote hersengebieden24,25. Belangrijk is dat de diverse ligands voor tol-achtige receptor familie specifieke producties van EV's in de microglia26kan activeren. Bijvoorbeeld, in vitro studies tonen aan dat LPS-geactiveerde microglia BV2 cellijnen differentiële EV-inhoud produceren, waaronder pro-inflammatoire cytokines27. Daarom kan de functionele diversiteit van immuuncelsubpopulaties in de CNS, microglia en het infiltreren van BMDMs, worden geëvalueerd door middel van hun eigen EV-populaties, waaronder de EV-impact op de ontvangende cellen en de identificatie van EV-inhoud.

We beschreven eerder methoden om de functionele eigenschappen van microglia- en BMDM-afgeleide EV's te evalueren na hun isolatie16,19. In dit rapport stellen we voor om onafhankelijk het effect van microglia-afgeleide EV's op neuritische uitgroei en het effect van macrofaag-afgeleide EV's op de controle van glioomcelaggregaten te evalueren. Deze studie stelt ook een brede proteomische analyse van de EV-breuken voor om de EV-isolatieprocedure te valideren en de biologisch actieve eiwithandtekeningen te identificeren. De gunstige effecten en het moleculair ontcijferen van EV-inhoud kunnen helpen hun mogelijke manipulatie en gebruik als therapeutische middelen in hersenaandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primaire cultuur van Microglia/Macrofagen

  1. Primaire cultuur van microglia
    1. Kweek commerciële rat primaire microglia (2 x 106 cellen) (zie de tabel van materialen) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% exosoomvrij serum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycin en 9,0 g/L bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Verzamel het geconditioneerde medium na een cultuur van 48 uur en ga door naar de isolatie van EV's.
  2. Primaire cultuur van macrofagen
    1. Kweek commerciële rat primaire macrofagen (1 x 106 cellen) in het medium dat door de fabrikant (zie de tabel van materialen)bij 37 °C en 5% CO2, met exosoom-vrij serum.
    2. Verzamel het geconditioneerde medium na een cultuur van 24 uur en ga door naar het isolement van EV's.

2. Isolatie van EV's

  1. Pre-isolatie van EV's van geconditioneerd medium
    1. Breng het geconditioneerde kweekmedium van microglia- of macrofaagculturen (stap 1.1.2 of 1.2.2) over in een conische buis.
    2. Centrifuge bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de cellen te pelleteren.
    3. Breng de supernatant in een nieuwe conische buis. Centrifuge op 1.200 x g gedurende 20 minuten op RT om apoptotische lichamen te elimineren.
    4. Breng de supernatant over in een polycarbonaatbuis van 10,4 mL en breng de buis over in een 70.1 Ti rotor. Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 90 min bij 4 °C om de EV's te pelleteren.
    5. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet met EV's in 200 μL van 0,20 μm gefilterde fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
  2. Isolatie van EV's
    1. Voorbereiding van de zelfgemaakte grootte uitsluiting chromatografie kolom (SEC)
      1. Leeg een glazen chromatografiekolom (lengte: 26 cm; diameter: 0,6 cm) (zie de tabel met materialen),was en steriliseer deze.
      2. Plaats een filter van 60 μm onder aan de kolom.
      3. Stapel de kolom met cross-linked agarose gel filtratie base matrix om een stationaire fase van een diameter van 0,6 cm en een hoogte van 20 cm te creëren.
      4. Spoel de fase af met 50 mL van 0,20 μm gefilterde PBS. Bewaar op 4 °C om later te worden gebruikt indien nodig.
    2. Plaats de geresuspended EV pellet op de top van de stationaire fase van de SEC kolom.
    3. Verzamel 20 opeenvolgende fracties van 250 μL terwijl u 0,20 μm gefilterde PBS aan de bovenkant van de stationaire fase blijft toevoegen om het drogen van de kolom te voorkomen. Bewaar de fracties indien nodig op -20 °C.
      LET OP: Een langere opslag dan een week kan worden uitgevoerd bij -80 °C om de EV-integriteit voor moleculaire analyse te behouden.
  3. Matrix assisted laser desorption ionisatie (MALDI) massaspectrometrie analyse van de SEC fracties
    1. Ga naar de EV isolatie zoals beschreven in punt 2.2.
    2. Resuspend de EV pellet met 200 μL peptide kalibratie mix oplossing (zie de tabel van materialen).
    3. Ga naar EV collectie zoals beschreven in de punten 2.2.1 tot en met 2.2.3.
    4. Droog de fractie volledig af met een vacuümconcentrator.
    5. Reconstrueren van de fracties met 10 μL van 0,1% trifluoroacetisch zuur (TFA).
    6. Meng 1 μL gereconstitueerde fractie met 1 μL α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix op een MALDI gepolijste stalen doelplaat.
    7. Analyseer alle breuken met een MALDI massaspectrometer.
    8. Analyseer gegenereerde spectra met speciale software (zie Tabel van Materialen).

3. Karakterisering van EV's

  1. Nanoparticle tracking analyse (NTA)
    OPMERKING:     De NTA-analyse wordt uitgevoerd met een nanodeeltjestrackinganalyse-instrument (zie de tabel van materialen)en een geautomatiseerde spuitpomp.
    1. Maak een verdunning (bereik van 1:50 tot 1:500) van elke SEC-fractie van stap 2.2.3 met 0,20 μm gefilterde PBS.
    2. Vortex is de oplossing om EV-aggregaten te elimineren.
    3. Doe de verdunde oplossing in een spuit van 1 mL en plaats deze in de geautomatiseerde spuitpomp.
    4. De camera-instelling aanpassen aan schermver versterkingsniveau (3) en cameraniveau (13).
    5. Klik op Uitvoeren en start het volgende script.
      1. Laad het monster in de analysekamer (infusiesnelheid: 1.000 voor 15 s).
      2. Verlaag en stabiliseer de snelheid voor video-opname (infusiesnelheid: 25 voor 15 s). Leg drie opeenvolgende 60 s video's van de deeltjesstroom vast.
      3. Pas het cameraniveau (13) en de detectiedrempel (3) aan voordat video's worden geanalyseerd. Klik op Instellingen| Ok om de analyse te starten en klik op Exporteren wanneer de analyse is gedaan.
    6. Tussen elke fractieanalyse door, was met 1 mL van 0,20 μm gefilterde PBS.
  2. Elektronenmicroscopie (EM) analyse
    1. Ev's isoleren zoals beschreven in sectie 2.
      LET OP: Steriele omstandigheden zijn niet vereist.
    2. Herhaal punt 3.1 om EV's te kwantificeren.
      LET OP: Alleen positieve breuken worden gebruikt voor EM-analyse.
    3. Gebruik een 50 kDa centrifugaalfilter (zie Tabel van materialen)om EV-bevattende SEC-fracties te concentreren.
    4. Resuspend geconcentreerde EV's in 30 μL van 2% paraformaldehyde (PFA).
    5. Laad 10 μL van het monster op een koperen raster met koolstofcoating.
    6. Incubeer gedurende 20 minuten in een natte omgeving.
    7. Herhaal stap 3.2.5 en 3.2.6 voor een goede absorptie van het monster op het rooster.
    8. Breng het rooster in een druppel van 1% glutaraldehyde in PBS gedurende 5 minuten bij RT.
    9. Was het monster meerdere malen met ultrazuiver water.
    10. Contrasteer het monster gedurende 10 minuten op ijs met een mengsel van 4% uranylacetaat en 2% methylcellulose (1:9, v/v). Verwijder overtollige van het mengsel met behulp van een filterpapier.
    11. Droog het monster en observeer het onder een transmissieelektronenmicroscoop bij 200 kV (zie de tabel van materialen).
  3. Westerse vlekanalyse
    1. Eiwitextractie
      1. Herhaal de stappen 3.2.1 tot en met 3.2.3 om EV's te isoleren en te concentreren.
      2. Meng 50 μL RIPA-buffer (150 mM natriumchloride [NaCl], 50 mM Tris, 5 m Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetisch zuur [EGTA], 2 mM Ethyleediamine-tetraatisch zuur [EDTA], 100 mM natriumfluoride [NaF], 10 mM natriumcafofosfaat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Fenylmethanesulfonylfluoride [PMSF], 1x proteaseremmer) met het EV-monster (25 μL als gevolg van de EV-concentratie op filter) gedurende 5 min op ijs om eiwitten te extraheren.
      3. Sonicaat voor 5 s (amplitude: 500 W; frequentie: 20 kHz), 3 keer op ijs.
      4. Verwijder vesiculaire resten door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 °C.
      5. Verzamel de supernatant en meet de eiwitconcentratie met bradford eiwittestmethode.
    2. Natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) en western blotting
      1. Meng eiwitextracten (30 μg) met 5c Laemmli monsterbuffer (v/v).
      2. Laad de eiwitmix op een 12% polyacrylamide gel.
      3. Trek de eiwitten in de gel met TGS-buffer (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine en 0,1% SDS), bij 70 V voor 15 min en 120 V gedurende 45 min.
      4. Breng de eiwitten met een halfdroog systeem met 230 V gedurende 30 minuten over op het nitrocellulosemembraan.
      5. Verzadig het membraan voor 1 uur bij RT met blokkeerbuffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% melkpoeder w/v in 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incubeer het membraan 's nachts bij 4 °C met muis monoklonale anti-menselijke warmteschok eiwit 90 (HSP90) antilichaam verdund in blokkeerbuffer (1:100).
      7. Was het membraan drie keer met PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) gedurende 15 minuten.
      8. Het membraan 1 uur bij RT incuren met geit mierikswortel peroxidase-gevoegde antimuisig IgG secundair antilichaam verdund in blokkeringsbuffer (1:10.000).
        LET OP: Een negatieve controle wordt uitgevoerd met behulp van secundaire antilichaam alleen.
      9. Herhaal de wasstap (stap 3.3.2.7).
      10. Onthul het membraan met verbeterde chemiluminescentie (ECL) westelijke blotting substraat kit (zie Tabel van materialen).
  4. Proteomische analyse
    1. Eiwitextractie en in-gel spijsvertering
      1. Herhaal de stappen 3.2.1 tot en met 3.2.3 om de EV's te isoleren en te concentreren. Herhaal stap 3.3.1 voor EV-eiwitextractie.
      2. Voer eiwitmigratie uit in de stapelgel van een 12% polyacrylamidegel.
      3. Bevestig de eiwitten in de gel met coomassie blauw gedurende 20 minuten op RT.
      4. Snijd elk gekleurd gelstuk weg en snijd het in kleine stukjes van 1 mm3.
      5. Was de gelstukken achtereenvolgens met 300 μL van elke oplossing: ultrazuiver water gedurende 15 minuten, 100% acetonitril (ACN) gedurende 15 min, 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) gedurende 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) gedurende 15 min en 100% ACN gedurende 5 min met roer continuering.
      6. Droog volledig gel stukken met vacuüm concentrator.
      7. Voer eiwitreductie uit met 100 μL van 100 mM NH4HCO3 met 10 mM dithiothreitol gedurende 1 uur bij 56°C.
      8. Voer eiwitalkylering uit met 100 μL van 100 mM NH4HCO3 met 50 mM iodoacetamide gedurende 45 minuten in het donker bij RT.
      9. Was de gelstukken achtereenvolgens met 300 μL van elke oplossing: 100 mM NH4HCO3 gedurende 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) gedurende 15 min en 100% ACN gedurende 5 minuten met continu roeren.
      10. Droog de gelstukken volledig af met een vacuümconcentrator.
      11. Voer eiwitvertering uit met 50 μL trypsine (12,5 μg/mL) in 20 mM NH4HCO3 's nachts bij 37 °C.
      12. Haal de verteerde eiwitten uit de gel met 50 μL van 100% ACN gedurende 30 minuten bij 37 °C en vervolgens 15 minuten bij RT met continu roeren.
      13. Herhaal de volgende extractieprocedures tweemaal: 50 μL van 5% TFA in 20 mM NH4HCO3-oplossing voor 20 minuten met continu roeren.
      14. Voeg 100 μL van 100% ACN toe gedurende 10 minuten met continu roeren.
      15. Droge verteerde eiwitten met een vacuümconcentrator en opnieuw te besteden in 20 μL van 0,1% TFA.
      16. Desalt het monster met behulp van een 10 μL pipettip met C18 reverse phase media voor het ontzalteren en concentreren van peptiden (zie de tabel van materialen)en elute peptiden met ACN:0,1% mierenzuur (FA) (80:20, v/v).
      17. Droog het monster volledig met een vacuümconcentrator en opnieuw op te hangen in 20 μL ACN:0,1% FA (2:98, v/v) voor vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS-analyse
      1. Laad het verteerde peptide in het LC-MS/MS-instrument en voer monster- en data-analyse uit volgens parameters die elders in detail zijn beschreven42.
    3. Ruwe gegevensanalyse
      1. Verwerk massaspectrometriegegevens om eiwitten te identificeren en identificeerde eiwitten van elk monster te vergelijken met een kwantitatief proteomics-softwarepakket met behulp van standaardparameters.
      2. Exporteer, met behulp van standaardparameters, de lijst van exclusieve en oververtegenwoordigde eiwitten uit EV-positieve monsters in een software die eiwitnetwerken en biologische processen voorspelt.
      3. Vergelijk de lijst van geïdentificeerde eiwitten in de breuken met de top 100 EV markers uit de Exocarta open access database (zie de tabel van materialen).

4. Functionele EV's Effecten Test

  1. Neurite uitgroei test op PC-12 cel lijn
    1. Kweek PC12-cellijn in volledig DMEM-medium (2 mM L-glutamine, 10% foetale paardenserum (FHS), 5% foetale runderserum (FBS), 100 UI/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine).
      LET OP: De sera zijn exosoom vrij in de hele procedure.
    2. Voeg een afdekglas (alle putten) toe aan een 24-put plaat; bestrijk de plaat met poly-D-lysine (0,1 mg/mL) en zaad 260.000 cellen/put.
    3. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2.
    4. Na 24 uur incubatie, verander het medium naar DMEM differentiatiemedium (DMEM met 2 mM L-glutamine, 0,1% FHS, 100 UI/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine) met 1 x 106 microglia EV's (vanaf stap 1.1.2).
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder microglia EV's in de differentiatie medium.
    5. Laad op dag 4 na het zaaien alle putten met 100 μL van volledig DMEM-medium.
    6. Bevestig op dag 7 na het zaaien de cellen met 4% PFA gedurende 20 minuten bij RT en spoel drie keer (10 min per stuk) met PBS.
    7. Bevlek de cellen met rhodamine-geconjugeerde phalloïden gedurende 30 minuten bij 4 °C en spoel 3 keer (10 min per stuk) met PBS.
    8. Vlek de cellen met verdunde Hoechst 33342 (1:10.000) gedurende 30 minuten bij RT en spoel 3 keer (10 min per stuk) met PBS.
    9. Monteer het afdekglas op een glijbaan met tl-montagemedium (zie Tabel van Materialen).
    10. Analyseer de dia met een confocale microscoop, neem 5 willekeurige beelden van elke dia.
    11. Meet neurite outgrowth met behulp van een geautomatiseerde kwantificeringssoftware (totale neurietlengte) zoals beschreven in detail elders43.
  2. Neurite uitgroei op rat primaire neuronen
    1. Bekleed een 8-well glazen schuif met poly-D-lysine (0,1 mg/mL) en laminine (20 μg/mL).
    2. Kweekrat commerciële primaire neuronen in geschikte kweekmedium (zie Tabel van Materialen)door 50.000 cellen per put te platgeneren en de cellen bij 37 °C onder 5% CO2 voor 48 h te verminderen.
      LET OP: De sera zijn exosoomvrij in de hele procedure.
    3. Voeg 1 x 106 microglia EV's toe aan neuron kweekmedium en incubaal bij 37 °C onder 5% CO2 voor 48 uur meer.
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder microglia EV's in neuron cultuur medium.
    4. Volg de stappen 4.1.6 tot en met 4.1.9 om de cellen op te lossen en te bevlekken.
    5. Volg de stappen 4.1.10 en 4.1.11 om de dia te analyseren.
  3. Glioma celinvasie
    1. Resuspend C6 rat glioma cellen in complete DMEM medium (DMEM met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotica) met 5% collageen bij een uiteindelijke concentratie van 8.000 cellen in 20 μL.
      LET OP: De sera zijn exosoomvrij in de hele procedure.
    2. Plaats 5 mL PBS AAN de onderkant van een 60 mm weefselkweekschotel. Omkeert het deksel en deponeert druppels van 20 μL (8.000 cellen) van celsuspensie op de bodem van het deksel.
    3. Keer het deksel om op de met PBS gevulde bodemkamer en ontcubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 72 uur totdat celsferoïden zijn gevormd.
    4. Voeg 1 x 108 macrofaag-EV's (van stap 1.2.2) toe aan een 2,2 mg/mL collageenmengsel (2 mL van de oplossing van rundercollageen type I [3 mg/mL] met 250 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM) en 500 μL natriumhydroxide).
      LET OP: Controle voorwaarde wordt uitgevoerd zonder macrofaag EV's in het collageen mengsel.
    5. Verdeel het collageenmengsel met EV's in een 24-putplaat voor het inbedden van celsferoïden.
    6. Implanteren de nieuw gevormde celferoïden in het midden van elke put.
    7. Broed de plaat 30 min bij 37°C en 5% CO2 om de gel te stollen.
    8. Daarna, overlay 400 μL van volledige DMEM medium op de collageen matrix in elke put.
    9. Het volledige systeem incubeer maken gedurende in totaal 6 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
      LET OP: Celinvasie uit de sferoïde wordt gecontroleerd door digitale fotografie met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 4x/0.10 N.A. doelstelling.
    10. Elke dag beelden van elke put verwerven.
    11. Verwerkt afbeeldingen en kwantificeer invasie van celsferoïde gebieden met behulp van de software zoals eerder beschreven in detail42.
      LET OP: Invasie en sferoïde gebieden werden genormaliseerd voor elke dag aan de invasie en sferoïde gebieden gemeten op dag 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een van de belangrijkste uitdagingen voor het toeschrijven van biologische effecten aan extracellulaire vesicles (EV's) is de mogelijkheid om de EV's te isoleren van het hele cultuurmedium. In dit rapport presenteren we een methode met behulp van ultracentrifugatie (UC) en size-exclusion chromatografie (SEC) die is gekoppeld aan de grootschalige analyse van eiwithandtekeningen om EV-markers te valideren en bioactieve verbindingen te identificeren. De macrofaag- of microglia-afgeleide EV's werden geïsoleerd van het geconditioneerde medium na respectievelijk een cultuur van 24 uur of 48 uur (figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: Extracellulaire Vesicle (EV) collectie- en isolatiestrategieën. De apoptotische lichamen en het celpuin werden gescheiden van het microglia- of macrofaaggeconditioneerde medium door opeenvolgende centrifugatiestappen. Vanaf de supernatant werden EV's geïsoleerd door ultracentrifugatie (UC). De UC pellet met EV's werd geladen op kolom en gescheiden door size-exclusion chromatografie (SEC) in 20 verschillende geëutteerde fracties. Zoals blijkt uit de verdere stappen (elektronenmicroscopie, nanodeeltjes tracking analyse en proteomische analyse), de SEC fracties werden gebundeld en georganiseerd in 1F-EV-, 2F-EV + en 3F-EV-. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De methode volgde opeenvolgende centrifugatiestappen: de eerste om de cellen te verwijderen en de tweede om cellulair puin en apoptotische lichamen te verwijderen. Vervolgens werd de supernatant overgebracht naar een nieuwe buis om een ultracentrifugatie uit te voeren op 100.000 x g gedurende 90 minuten. De akeltjes werden samen met de eiwitaggregaten verzameld in de uiteindelijke UC-pellet. Een SEC-kolom werd gebruikt om de verbindingen te scheiden op basis van hun grootte en de aggregaten te verwijderen (figuur 1). Om de isolatie van EV's te bevestigen, volgde elke SEC-fractie een nanodeeltjestrackinganalyse(figuur 2A).

Figure 2
Figuur 2: Analyse van de SEC-fracties. (A) Nanoparticle tracking analyse (NTA) van SEC fracties. Het totale aantal deeltjes in elke SEC-fractie wordt weergegeven met staafdiagrammen. De oranje staafdiagrammen tonen de drie opeenvolgende EV+ breuken (F5–F7). (B, C) Schermopnames van NTA-kamer tonen aanzienlijke verschillen in deeltjesstroom tussen SEC-fracties. (D) Aanvullende MALDI massaspectrometrie analyse. Van een andere UC pellet met EV's, een standaard controle peptide set werd toegevoegd voor SEC scheiding om de prestaties van de SEC-strategie te valideren. Elke SEC-fractie werd geanalyseerd met matrixondersteunde laserdesorptie-ionisatie - time of flight (MALDI-TOF) om standaardpositieve breuken te bepalen. In de negen eerste spectra (fracties 1 tot en met 9) werd geen signaal waargenomen. De detectie van deze vrije normen was mogelijk in de volgende breuken (fracties 10 tot 20) die het vermogen van de SEC-procedure bevestigen om EV's (F5–F7) te scheiden van oplosbare componenten (F10-F20). (E) Westerse vlek analyse van SEC fracties als een EV marker voorlopige analyse. De EV+ fracties (F5–F7) werden samengevoegd als één monster (2F-VE+), terwijl de EV-fracties (respectievelijk F1–F4 en F8–F20) werden samengevoegd in twee andere monsters genaamd 1F-EV- en 3F-EV-. De resultaten toonden de aanwezigheid van een Heat-Shock Protein 90 (HSP90) (EV positieve marker) signaal in 2F-EV +, en ook in cell lysate als positieve controle, in vergelijking met de andere fracties (1F-EV- en 3F-EV-). (F, G) Elektronenmicroscopieanalyse van het EV positieve monster (2F-EV+). De waarneming onder twee opeenvolgende vergrotingen toonde de aanwezigheid van EV's in een grootte bereik rond 100 nm (witte pijlen) en ongeveer 400 nm (pijlpunt). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Het deeltjesgetal was aanzienlijk hoger in de fracties 5, 6 en 7 dan in de vorige (F1–F4) en volgende (F8–F20). Het was mogelijk om een deeltjesstroom in deze breuken te zien, zelfs als een paar deeltjes werden waargenomen in de volgende fracties(figuur 2B,C). Deze scheiding belet niet dat andere fracties dan F5-F7 een kleine hoeveelheid vesikjes kunnen bevatten, of zelfs dat EV-rijke fracties F5 tot F7 moleculaire verontreinigingen kunnen bevatten. Om er op zijn minst voor te zorgen dat de F5-F7-fracties vrij zijn van vervuilende co-eluting moleculen, was het noodzakelijk om de tijd-cursus elutie van de verschillende verbindingen in de SEC-procedure te volgen. Om dit te doen, controle peptide normen werden toegevoegd aan een soortgelijke UC pellet als eerder gebruikt. Deze voorbereiding werd opnieuw gescheiden gebruikend de procedure van SEC. Vervolgens werd een matrix assisted laser desorption ionisatie - time of flight (MALDI) massaspectrometrie analyse uitgevoerd om de SEC-fracties waarin normen werden eluted (Figuur 2D) te identificeren. Vanwege het massabereik werden in deze analyse alleen geïoniseerde producten uit peptidenormen gevolgd. De resultaten toonden aan dat deze producten detecteerbaar waren in de fracties 10 tot 20, waaruit bleek dat elk oplosbaar eiwit niet in dezelfde fracties kan worden ontweken als de EV's (F5–F7). Deze resultaten bevestigden de belangstelling van deze aanpak voor de scheiding van EV's van niet-EV-componenten. Zelfs in de veronderstelling dat de F8-F20 fracties een restfractie van EV's konden bevatten, hebben we in de volgende experimenten besloten om de EV-positieve fracties (F5-F7) te combineren in een enkele steekproef genaamd 2F-EV+. We hebben ook de andere SEC-fracties gecombineerd in twee monsters genaamd 1F-EV- (F1–F4) en 3F-EV- (F8–F20). We gegroepeerd in drie monsters om verschillende redenen. Ten eerste zou het aantal SEC-fracties de tijd van moleculaire analyses verhogen, maar ook functionele in vitrostudies. De EV-positieve SEC-fracties vertonen afzonderlijk lagere deeltjesaantallen en brengen ook de detectie van moleculaire verbindingen in gevaar. Op dezelfde manier werd het als verstandiger beschouwd om de fracties F8–F20 te groeperen om, indien nodig, de resterende vesikels te concentreren en hun aanwezigheid te controleren door middel van een voorlopige western blot-analyse tegen HSP90, een EV-marker. Interessant is dat een positief signaal voor HSP90 werd gedetecteerd in de fractie 2F-EV+, ook in de cel lysate als positieve controle, maar niet in 1F-EV- en 3F-EV-monsters (Figuur 2E en Aanvullende Figuur S1 als controle). Deze analyse bevestigt alleen de interesse van 2F-EV+ en het juiste beheer van de vorige SEC-fracties. Om ev-isolatie te bevestigen, analyseerde een extra experiment met elektronenmicroscopie alleen het 2F-EV+ monster en liet het de observatie toe van EV's met een typische morfologie en grootte heterogeniteit tussen 100 en 400 nm (figuur 2F,G).

Een andere belangrijke stap in de validatie was proteomische analyse(figuur 3). We ontwikkelden een hele massaspectrometrieanalyse met meerdere doelstellingen: (i) de isolatie van EV's bevestigen met de detectie van een groot aantal EV-markers in 2F-EV+, (ii) uiteindelijk verontreinigingseiwitten identificeren in de EV-negatieve monsters (1F-EV- en 3F-EV-) en (iii) het eiwitgehalte van EV's die hun biologische activiteiten ondersteunen.

Figure 3
Figuur 3: Proteomische analyse van EV-positieve en EV-negatieve monsters. (A) Na drie onafhankelijke EV-isolaties van vergelijkbare microgliacelpreparaten, werden de monsters 1F-EV-, 2F-EV+ en 3F-EV- geladen voor natriumdolfum-sulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) en gemigreerd tot de stapelgel om eiwitten te concentreren om hun in-gel spijsvertering te realiseren. De resulterende peptiden werden vervolgens geanalyseerd door vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) om de overeenkomstige eiwitten te identificeren. (B) Vergelijking van geïdentificeerde eiwitten tussen monsters 1F-EV- en 2F-EV+ met gemeenschappelijke eiwitten in beide fracties (19) en eiwitten die uitsluitend in de 2F-EV+ fractie (522) worden aangetroffen. De heatmap toont de relatieve weergave waar alle gemeenschappelijke eiwitten tussen 1F-EV- en 2F-EV+ driefasige waren oververtegenwoordigd (rood) in de 2F-EV + monsters. (C) Vergelijking van geïdentificeerde eiwitten tussen fracties 2F-EV+ en 3F-EV- met gemeenschappelijke eiwitten tussen drievouden (113) en uitsluitend vertegenwoordigde eiwitten (428 in 2F-EV+ en 11 in 3F-EV-). De heatmap toont de relatieve weergave in twee clusters. Eén (cluster A) presenteert 5 oververtegenwoordigde eiwitten in 3F-EV-monster en een tweede (cluster B) presenteert 108 oververtegenwoordigde eiwitten in 2F-EV+. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Van cel-geconditioneerde media, de UC en SEC procedure leidde tot drie monsters 1F-EV-, 2F-EV + en 3F-EV-. De overeenkomstige eiwitten werden geëxtraheerd en geconcentreerd door natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE). Na een korte migratie in de stapelgel werden de monsters verzameld door een bandexcisie, overgebracht in verschillende buizen om in-gel verteerd te worden. De producten werden gescheiden door online reversed-phase chromatografie direct gekoppeld aan een massaspectrometer voor analyse (Figuur 3A).

De volgende resultaten, als voorbeeld van de gehele procedure, werden verkregen van microglia-geconditioneerd middel na een 48 h cultuur. De ruwe gegevens werden voorgelegd aan een Rat eiwit database. De geïdentificeerde eiwitten werden vergeleken tussen monsters 1F-EV- en 2F-EV+(figuur 3B) en tussen monsters 2F-EV+ en 3F-EV- (Figuur 3C). In de eerste vergelijking toonde het Venn-diagram 19 gemeenschappelijke eiwitten in zowel fracties als 522 eiwitten die uitsluitend in de 2F-EV+ fractie werden gedetecteerd. De analyse met behulp van een kwantitatieve proteomics software toegestaan de identificatie van de relatieve vertegenwoordiging van de gemeenschappelijke eiwitten. De resultaten toonden een heatmap waar alle gangbare eiwitten tussen 1F-EV- en 2F-EV+ drievouden oververtegenwoordigd waren (rood) in de 2F-EV+ samples. In de tweede vergelijking tussen fracties 2F-EV+ en 3F-EV-, werden 113 gemeenschappelijke eiwitten geïdentificeerd tussen drievouden. Bovendien werden 428 eiwitten uitsluitend aangetroffen in 2F-EV+ en werden 11 eiwitten uitsluitend aangetroffen in 3F-EV-. Na de kwantitatieve analyse, de heatmap vertegenwoordiging van de 113 gemeenschappelijke eiwitten gewezen op twee clusters waar de cluster A presenteerde vijf oververtegenwoordigde eiwitten in 3F-EV-monster en het cluster B presenteerde 108 oververtegenwoordigde eiwitten in 2F-EV +.

De 428 eiwitten die uitsluitend vertegenwoordigd waren en de 108 eiwitten die in 2F-EV+ werden oververtegenwoordigd, werden voorgelegd aan de Open Access database van Exocarta om EV-geassocieerde moleculen te detecteren. De analyse van de top 100 EV markers in Exocarta benadrukte de aanwezigheid van 86 EV-geassocieerde eiwitten in 2F-EV+(figuur 4A).

Figure 4
Figuur 4: Analyse van eiwitten uit het 2F-EV+ monster. AA) Een pool van 536 eiwitten (428 exclusieve en 108 oververtegenwoordigde eiwitten) werd aan de Exocarta-databank voorgelegd om ev-geassocieerde moleculen op te sporen. Molecule symbolen van de 86 EV-geassocieerde eiwitten gedetecteerd in de top 100 EV markers van Exocarta database. (B) De voorspelling van eiwitinteracties en hun associatie met geselecteerde biologische processen toonde immuun- en neuroprotectieve trajecten in het 2F-EV+ monster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Interessant is dat de analyse van de 5 gemeenschappelijke eiwitten in het cluster A en de 11 eiwitten die uitsluitend in 3F-EV waren vertegenwoordigd, niet geassocieerd waren met een EV-marker (niet getoonde gegevens). Ten slotte toonde de voorspelling van eiwitinteracties en hun associatie met geselecteerde biologische processen de aanwezigheid in de 2F-EV+ fractie van immuunbemiddelaars (21%) soms betrokken bij de bestrijding van de ontstekingsreactie (4,1%) (Figuur 4B). De EV-inhoud in 2F-EV+ werd ook geassocieerd met de neuronale ontwikkeling (16,8%), neuron differentiatie (5%) en de controle van neuronale dood (3,8%) die in overeenstemming is met de volgende neurite uitgroeitest.

Zo maakt de door ons gekozen strategie de toegang van alle gegevens mogelijk en kan een voorspelling van de ev-gemedieerde functies voorafgaand aan de biologische tests die we vervolgens uitvoeren (figuur 5).

Figure 5
Figuur 5: EV-afhankelijke f unctional assays. De effecten van microglia-afgeleide EV's werden geëvalueerd op neurite uitgroei (bovenste frame) en de effecten van macrofaag-afgeleide EV's werden geëvalueerd op glioom cel invasie (onderste frame). (A, B) De neurietlengte werd gemeten op PC-12 cellen (Paneel A werd gewijzigd van Raffo-Romero et al.16 met toestemming) of rat primaire neuronen (B). De resultaten toonden een aanzienlijke groei stijging onder EV's (+ EV's) in vergelijking met controle (Ctrl). Schaalbalk = 20 μm. (C, D) Tijdsloop van C6 glioom sferoïde invasie in collageen in aanwezigheid van rat primaire macrofaag-afgeleide EV's (C6 + EV's) of voertuig (C6 controle). De C6 sferoïde 3D invasie in collageen werd gecontroleerd en gekwantificeerd tot 6 dagen. Kwantificering van tumorcelinvasie wordt getoond op 1, 2, 3 of 6 dagen (C) zoals waargenomen op representatieve beelden (D). Schaalbalk = 500 μm. Voor neurite outgrowth testen werd de betekenis berekend door de niet-gepaarde Student's t-test(* p < 0,05, ** p < 0,01 en *** p < 0,001). Voor invasie test, werd de betekenis berekend door one-way ANOVA gevolgd door tukey's post hoc test. De foutbalken geven een relatieve standaardfout van drie onafhankelijke experimenten aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Op deze manier werden de neurotrofe functies van microglia-afgeleide EV's bestudeerd op PC-12 cellijn en rat primaire neuronen. De resultaten toonden een positief effect op de neurite uitgroei (figuur 5A,B). De aanwezigheid van EV's respectievelijk toegenomen ongeveer 6 en 1,5 keer het neurite netwerk in lengte en / of in aantal in PC-12 en primaire neuronen in vergelijking met een controle voorwaarde. In een andere context bestudeerden we ook de effecten van macrofaag-afgeleide EV's op een hersentumor invasie(figuur 5C,D). Het werd beoordeeld met behulp van 3D-tumor sferoïden ingebed in een matrix van collageen. Sferoïden gegenereerd met C6 rat glioom cellen werden gekweekt voor 6 dagen in een collageen matrix met (of niet met) EV's gezuiverd uit rat macrofagen cultuur medium. De collageenmatrix biedt een structuur waarin tumorcellen kunnen binnenvallen en zich kunnen verspreiden uit de sferoïde. De macrofaag-afgeleide EV's schaadden de groei en invasie van de glioom sferoïden. Na een 6-daagse cultuur werd een afname van 50% van de invasie waargenomen bij met EV behandelde sferoïden in vergelijking met de controle. Dit resultaat toonde aan dat macrofagen EV's kunnen produceren met anti-tumorale en/of anti-invasieve factoren die de glioomgroei beïnvloeden.

Supplementary Figure S1
Aanvullende figuur S1: Afbeeldingen van membraan gebruikt voor western-blotting experiment. (A) Originele afbeelding van de westelijke vlek van figuur 2E (tegen HSP90 EV marker). (B) Ponceau kleuring beeld van hetzelfde membraan met de juiste belasting van eiwit extracten uit 1F-EV-, 2F-EV + en 3F-EV-monsters. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het centrale zenuwstelsel (CNS) is een complex weefsel waarin cel-naar-cel communicatie normale neuronale functies reguleert die nodig zijn voor homeostase30. EV's worden nu op grote schaal bestudeerd en beschreven als belangrijke moleculaire ladingen voor cel-naar-cel communicatie31. Ze leveren specifiek een cocktail van bemiddelaars aan ontvangende cellen waardoor hun functies in gezonde en pathologische omstandighedenbeïnvloeden 32. Recente studies tonen aan dat EV's een cruciale rol spelen in deCNS 24,33,34 en vooral die van hersentun immune cellen35,36. De balans tussen pro- en ontstekingsremmende immuunreacties is cruciaal en maakt het mogelijk om de integriteit van de hersenen tijdens de synaptische ontwikkeling en de neuronale activiteiten gedurende het hele leven te behouden. Twee verschillende situaties van immuunreacties werden in deze studie besproken: de relatie (i) tussen microglia en neuronen en (ii) tussen het infiltreren van macrofagen en glioomcellen. Ten eerste, microglia zijn de resident macrofagen in het hersenweefsel waar ze een belangrijke immuunrol spelen in het beheer van de micro-omgeving veranderingen om de neuronale activiteiten te waarborgen. Maar overmatige pro-inflammatoire mechanismen kunnen worden ondersteund door over-geactiveerde microglia en leiden tot neurodegeneratieve aandoeningen37,38. Daarentegen vereisen de hoogwaardige glinomen ontstekingsremmende profielen en betrekken tumorgerelateerde macrofagen (TAC's) die in de tumorsite worden aangeworven. De beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) vertegenwoordigen een grote populatie van deze TAC's in nauwe relatie met glioomcellen. Onder invloed van de tumor vertonen BMDMs in vivo ontstekingsremmende en pro-tumorprofielen39. Hoe deze BMDMs in vitro tumorale celinvasie konden beheersen is een cruciale vraag in dit rapport. Dat is de reden waarom, de macrofaag-afgeleide EV's werden alleen gebruikt in de glioma sferoïde invasie test. Samen in de co-cultuur zouden de glioomcellen de macrofagen hebben beïnvloed om andere EV-populaties met ontstekingsremmende profielen te produceren. Het directe gebruik van immuun-EV's kan veel beter zijn als anti-tumorale agent. Bijgevolg handhaven immuuncellen cel-tot-celcommunicatie in specifieke micro-omgevingen waar het ontstekingsevenwicht sterk wordt beïnvloed door externe signalen40,41. Het begrip van de EV-gemedieerde immuunresponsen vormt een grote uitdaging om de pathogenese van vele aandoeningen te beperken. De identificatie van biologisch actieve EV-inhoud is een sleutel om gedysreguleerde ontstekingsprocessen te begrijpen en nieuwe therapeutische strategieën voor te stellen42,43.

In deze studie presenteren we een methodologie die bestaat uit een differentiaal ultracentrifugatieproces als eerste stap om het celpuin, de apoptotische lichamen en de oplosbare moleculen te elimineren, gecombineerd met grootteuitsluitingschromatografie om EV's te isoleren van moleculaire aggregaten. Wanneer de EV-populaties worden geëvalueerd in biologische tests, is het van cruciaal belang om de EV-inhoud te onderscheiden van andere co-geïsoleerde materialen. Daarom hebben we de isolatie verbeterd om EV-geassocieerde verbindingen te scheiden. Door standaardeiwitten toe te voegen aan controlemonsters die aan de SEC-procedure werden voorgelegd, konden we hun elutiefracties lokaliseren door MALDI-TOF. Omdat de normen vrije moleculen zijn, werken ze wereldwijd samen met monstergerelateerde moleculaire aggregaten die gerelateerd zijn aan niet-EV-materialen. Zo werden de EV-fracties van experimentele monsters gevalideerd in een betrouwbare isolatieprocedure. Daarnaast ontwikkelden we een dubbele proteomische analysestrategie. Behalve het gebruik van het anti-HSP90-antilichaam door western blotting als een EV marker voorlopige detectie, hebben we besloten om de juiste EV-fractionatie te valideren door een niet-gerichte detectie van EV-geassocieerde eiwithandtekeningen. De huidige aanpak was immers niet opzettelijk gericht op de detectie van meerdere bekende EV-markers vanwege de onvoldoende specificiteit en gevoeligheid van bepaalde antilichamen. De variabiliteit en de overvloed van sommige EV markers aan het oppervlak van EV subpopulaties zijn nog steeds controversieel in de isolatie procedures. Bovendien zou een op antilichamen gebaseerde methodologie een limiet kunnen vertegenwoordigen in een groot aantal organismen als gevolg van een gebrek aan commerciële antilichamen, terwijl de EV-studies nu een hot topic zijn in de biologie. Deze niet-gerichte analyse maakte het mogelijk om een hoger aantal moleculen te identificeren die al worden omschreven als EV-markers (86 eiwitten in de top 100 EV-markers uit de Exocarta-database). Ten slotte kan deze aanpak echt nuttig zijn om de EV-isolatie van slecht beschreven organismen te valideren, op voorwaarde dat de gedetecteerde eiwitten significante homologieën kunnen presenteren aan bekende EV-markers. Zoals onlangs beschreven, een grootschalige proteomische analyse kan een alternatief zijn voor het gebruik van slechts een paar willekeurige markers43. Dit zou de discriminatie van EV+ breuken en de identificatie van hun werkzame inhoud verbeteren voordat ze in biologische tests worden gebruikt.

Het is inderdaad noodzakelijk om de karakterisering van EV-inhoud te koppelen aan de effecten die werden waargenomen in biologische tests. De biologische impact van EV's op ontvangende cellen suggereert namelijk dat er vesiculaire bemiddelaars of effectoren bij betrokken zijn. Nogmaals, dezelfde niet-gerichte analyse maakt de identificatie van biologisch actieve moleculen mogelijk. Een mogelijke optimalisatie in deze analyse betreft de soorten moleculen die het mogelijk is te identificeren. Onze strategie was gebaseerd op de grootschalige analyse van eiwithandtekeningen en leidde tot voorspellende biologische paden in verband met immuunrespons en neuron overleving. Het is essentieel om rekening te houden met de andere molecule families, waaronder lipiden, mRNA en microRNAs bijvoorbeeld. Onze huidige studies associëren deze aanvullende identificaties met de eiwithandtekeningen om een wereldwijde kennis van deze EV-afhankelijke communicatie te krijgen.

De komende jaren worden veel therapeutische benaderingen overwogen. Gezien het feit dat de EV's in staat zijn om gemakkelijk de bloed-hersenbarrière te passeren en de pathologische weefsels te bereiken, kunnen deze moleculaire ladingen op verschillende manieren worden gebruikt. Hoewel deze studie de EV-oppervlaktemoleculen niet benadrukte, is hun identificatie nog steeds noodzakelijk om het adresseringsproces naar doelcellen en weefsels beter te begrijpen. De proteomische analyse in onze methodologie geeft toegang tot deze gegevens. Anders hebben we in dit verslag de in vitro productie van EV's gepresenteerd als nuttige cocktails. We hebben niet de beste omstandigheden geoptimaliseerd om de immuuncellen vooraf te primen of te activeren. Dit punt is van cruciaal belang omdat, in de weefsels, de micro-omgeving een directe impact heeft op de immuuncellen en uiteindelijk bijdraagt aan het vormgeven van de biogenese van hun EV's. In het geval van glioblastoom bijvoorbeeld, is gebleken dat de kankercellen hun eigen EV's produceren, waardoor zij bijdragen aan het oriënteren van de naburige TAC's naar ontstekingsremmende profielen en hun lokale immunosuppressie44,45. Dit is de reden waarom de macrofaag-afgeleide EV's in de glioom omgeving verschillen van die geproduceerd in een enkele macrofaag cultuur. Zo gebruikten we direct macrofaag-afgeleide EV's, afzonderlijk geproduceerd uit een enkele macrofaagcultuur, om de glioom sferoïde invasie te controleren omdat een macrofaag-glioom co-cultuur geen controle heeft op de tumorgroei. Verdere therapeutische strategieën kunnen dit in vivo immunosuppressie voorkomen door gebruik te maken van pro-inflammatoire en anti-tumorale EV's geproduceerd in vitro van geactiveerde macrofagen. Een soortgelijke strategie kan worden gebruikt in de context van neurodegeneratieve ziekten door het gebruik van EV's afgeleid van microglia goed gewaarschuwd voor een neuroprotectieve en ontstekingsremmende reactie ten gunste van de neuronale overleving te produceren. Concluderend zijn de studies van de ev-gemedieerde communicatie tussen immuuncellen en de in vivo micro-omgeving essentieel om een beter begrip van pathogenese mogelijk te maken en innovatieve therapeutische benaderingen te ontwerpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het gepresenteerde werk werd ondersteund door de Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche en INSERM. We erkennen dankbaar de BICeL- Campus Scientific City Facility voor toegang tot instrumenten en technische adviezen. Wij erkennen jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard en Isabelle Fournier dankbaar voor de mass spectrometrie hulp. Wij erkennen met dank aan Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli en Pierre-Eric Sautière voor hun sterke bijdrage aan de wetenschappelijke en technische ontwikkelingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Neurowetenschappen Immuunfuncties microglia macrofagen neuronen glioomcellen extracellulaire adereilanden
Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter