Summary
Här beskriver och validerar vi en metod för att konsekvent generera robusta humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter och karakterisera deras funktion. Dessa tekniker kan bidra till att utveckla mekanistisk insikt i signalering vägar, ge en plattform för storskalig Drug screening, och tillförlitligt modell hjärtsjukdomar.
Abstract
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) ger en värdefull mänsklig källa för att studera den grundläggande vetenskapen om kalcium (ca2 +) hantering och signalering vägar samt hög genomströmning Drug screening och toxicitetsanalyser. Häri ger vi en detaljerad beskrivning av de metoder som används för att generera högkvalitativa iPSC-CMs som konsekvent kan reproducera molekylära och funktionella egenskaper mellan olika cellinjer. Dessutom beskrivs en metod för att tillförlitligt bedöma deras funktionella karaktärisering genom utvärderingen av ca2 + hanteringsegenskaper. Låg syre (O2) villkor, laktat urval, och långvarig tid i kulturen producera hög renhet och högkvalitativa ventrikulär-liknande kardiomyocyter. Liknar isolerade vuxna råtta kardiomyocyter (ARCMs), 3-månaders-gamla iPSC-CMs uppvisar högre ca2 + amplitud, snabbare ca2 + återupptaget (Decay-Tau), och en positiv lusitropic svar på β-adrenerga stimulering jämfört med dag 30 IPSC-CMS. Strategin är tekniskt enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar. Det ger en robust plattform för att modellera hjärtsjukdom och för storskalig läkemedels screening för att rikta ca2 + hantera proteiner.
Introduction
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (IPSC-CMS) är en attraktiv Human-baserad plattform för att modellera en stor variation av hjärtsjukdomar in vitro-1,2,3,4,5,6,7,8. Dessutom kan IPSC-CMS användas för förutsägelse av patientens svar på nya eller befintliga läkemedel, att Screen träff föreningar, och utveckla nya personliga droger9,10. Men trots betydande framsteg, flera begränsningar och utmaningar måste övervägas när du använder iPSC-CMs11. Följaktligen, metoder för att förbättra hjärt differentiering protokoll, för att förbättra IPSC-CMS effektivitet och mognad, och för att generera specifika kardiomyocyte subtyper (ventrikulär, förmaksflimmer, och nodal) har intensivt studerats och redan lett till många kultur strategier för att övervinna dessa hinder12,13,14,15.
Oaktat robustheten hos dessa protokoll är ett stort bekymmer för användningen av iPSC-CMs reproducerbarheten av långa och komplicerade förfaranden för att erhålla högkvalitativa kardiomyocyter som kan säkerställa samma prestanda och reproducerbara resultat. Reproducerbarhet är kritisk inte bara när man jämför cellinjer med olika genetiska bakgrunder, men också när man upprepar cellulära och molekylära jämförelser av samma cell linje. Cell variation, såsom väl till väl skillnader i iPSCs densitet, kan påverka hjärt differentiering, genererar en låg avkastning och dålig kvalitet kardiomyocyter. Dessa celler kan fortfarande användas för att utföra experiment som inte kräver en ren population av CMs (t. ex. vid utförande av ca2 + transienta mätningar). Faktum är att när du utför elektrofysiologiska analys, icke-CMs kommer inte att slå, varken spontant eller under elektrisk stimulering, så det kommer att bli lätt att utesluta dem från analysen. Men på grund av dålig kvalitet, iPSC-CMs kan visa förändrade elektrofysiologiska egenskaper (t. ex., oregelbunden ca2 + övergående, låg ca2 + amplitud) som inte beror på deras genetiska makeup. Därför, särskilt när du använder iPSC-CMs för att modellera hjärtsjukdom, det är viktigt att inte förväxla resultat från en dålig kvalitet CM med sjukdomen fenotyp. Noggranna screening-och uteslutnings processer krävs innan man går vidare till elektrofysiologiska studier.
Denna metod innehåller optimerade protokoll för att generera hög renhet och högkvalitativa kardiomyocyter och för att bedöma deras funktion genom att utföra ca2 + transienta mätningar med hjälp av ett kalcium och kontraktilitet förvärvs-och analyssystem. Denna teknik är en enkel, men ändå kraftfull, sätt att skilja mellan hög verkningsgrad och låg verkningsgrad iPSC-CM preparat och ge en mer fysiologiskt relevant karakterisering av mänskliga iPSC-CMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som använder vuxna råtta kardiomyocyter i denna studie genomfördes med godkända institutionella djuromsorg och användning kommitté (IACUC) protokoll från Icahn School of Medicine vid berget Sinai. Den vuxna råtta kardiomyocyter isolerades från Sprague Dawley råtta hjärtan av Langendorff-baserade metoden som tidigare beskrivits16.
1. beredning av media
- Förbered hiPSC media.
- Och det basala mediet till rumstemperatur (RT). Se till att tillägget har tinat helt. Blanda 400 mL av det basala mediet och 100 mL av tillägget och filtrera med ett vakuumdrivet filter på 0,22 μm. Förvaras vid 4 ° c och jämvikt till RT före användning.
- Förbered RPMI + B27.
- Equilibrate den B27 tillägg och basal medium (RPMI 1640) till RT. se till att tillägget har tinat helt. Blanda 490 mL av basal mediet och 10 mL av 50x tillägg och filter med ett 0,22 μm vakuum driven filter. Förvaras vid 4 ° c och jämvikt till RT före användning.
- Förbered RPMI + B27 (-) insulin.
- Equilibrate den B27 (-) insulin tillägg och basal mediet (RPMI 1640) till RT. se till att tillägget har tinat helt. Blanda 490 mL av basal mediet och 10 mL av 50x tillägg och filter med ett 0,22 μm vakuum driven filter. Förvaras vid 4 ° c och jämvikt till RT före användning.
- Förbered urvals mediet (RPMI (-) glukos + B27 + laktat).
- Equilibrate den B27 tillägg och basala mediet (RPMI 1640 (-) glukos) till RT. se till att tillägget har tinat helt. Blanda 490 mL av det basala mediet och 10 mL av 50x-tillägget, tillsätt 4 mM natriumlaktat i sterilt vatten och filtrera med ett vakuumdrivet filter på 0,22 μm. Förvaras vid 4 ° c och jämvikt till RT före användning.
- Förbered RPMI 20.
- Equilibrate det basala mediet (RPMI 1640) till RT. Blanda foster bovint serum (FBS) (20% slutkoncentration) och RPMI. Filtrera med ett vakuumdrivet 0,22 μm-filter och förvara vid 4 ° c. Till RT före användning.
- Förbered passaging Media genom att lägga till Rho-associerade, lindad-spole som innehåller proteinkinas (ROCK) inhibitor (2 μM slutkoncentration) till hiPSC media.
- Förbered D0-Media genom att tillsätta GSK-3-hämmare, CHIR 99021 till RPMI + B27 (-) insulin media (10 μM Final).
- Förbered D3-och D4-medierna genom att blanda RPMI + B27 (-) insulin media med IWR-1 (5 μM Final).
Anmärkning: D1-och D5-Media utgörs av RPMI + B27 (-) insulin. D7 Media utgörs av RPMI + B27. - Förbered blockeringsbuffert (2% bovint serumalbumin [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 i fosfatbuffrad saltlösning [PBS]): i en 50 mL koniskt rör, tillsätt 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS och 250 μL av NP-40. Blanda tills den är helt upplöst.
2. beredning av Human embryonala stamceller (hESC)-kvalificerade Matrisbelagda plattor och täckglas
Anmärkning: utför alla steg under en steriliserad vävnad kultur huva.
- Tina hESC-kvalificerad matrisstock lösning över natten på is vid 4 ° c. Se produkt Specifikations bladet för att fastställa lämpliga alikvot volymer, eftersom detta kan variera beroende på beståndet. Förvara dessa alikvoter vid-20 ° c i 1,5 mL microcentrifug rör.
- För att använda matrisen för beläggning av plattor eller glas täckplåtar, Tina först en alikvot av hESC-kvalificerad matris vid 4 ° c i 30 min.
- Aliquot 24 mL av kallt Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM): näringsämne blandning F-12 (DMEM/F: 12) media i en 50 mL koniskt rör.
- Blanda den kalla DMEM/F: 12-mediet med en 2 mL glaspipett för att kyla ner ytan på pipetten.
- Använd samma pipett och ta upp cirka 500 − 700 μL kallt DMEM/F: 12 och blanda med den hESC-kvalificerade matrisen alikvot inom själva microcentrifugeröret.
- När den är ordentligt blandad, överför lösningen till 50 mL koniska röret som innehåller den kalla DMEM/F: 12 och blanda igen.
- För en standard 6 väl plattan, tillsätt 1 mL av denna blandning till varje brunn. Se till att brunnen är helt täckt. Lämna plåtarna vid RT under vävnads odlings huven i minst 30 minuter. Om så önskas, förvara vid 4 ° c omedelbart efter plätering i upp till 1 vecka och jämvikt till RT för 30 min före användning.
- För att använda plattorna, aspirera matrisen och Ersätt med lämpliga medier. Använd omedelbart.
- Förvara glaset täckglas i en steril miljö (t. ex. inuti en steril vävnad kultur huva).
- Före beläggning, torka varje enskild täckslip med 70% etanol. När täckplattan är torr, placera den inuti en brunn av en steril 6 väl tallrik.
- Ta 250 − 300 μL av den hESC-kvalificerade mat ris lösningen och fördela den försiktigt direkt på glas täckglasets mitt. Lämna täckglas vid RT under vävnaden Culture Hood i minst 30 min före användning.
3. beredning av små molekyler
Anmärkning: rekonstruera alla små molekyler och WNT modulatorer i DMSO om inte annat anges.
- Bered 10 mM alikvoter på 25 μL vardera av IWR-1 och CHIR 99021 och förvara vid-20 ° c.
- Bered 10 mM alikvoter på 50 μL vardera av Tiazovivin (berg hämmare) och förvara vid-20 ° c.
4. underhåll och Passaging av iPSCs
Anmärkning: utför alla följande steg under en steril vävnad kultur huva.
- Underhålla iPSCs i standard 6 väl tallrikar och utföra alla steg under sterila förhållanden. Underhålla cellerna med 2 mL hiPSC Media per brunn. Byt Media varannan dag. Håll cellerna vid 37 ° c, 6% O2,5% Co2. Passage cellerna när de är mellan 70 − 80% confluent.
- Och equilibrate PBS utan ca2 + och mg2 + till RT.
- För att starta passaging processen, tillsätt 1 mL PBS utan ca2 + och mg2 + till brunnen som behöver passaged. Inkubera vid RT för 7 − 10 min. Kontrollera cellerna under mikroskopet för att säkerställa att PBS-behandling inte har resulterat i fullständig dissociation av monolayer.
- Ta bort PBS och Ersätt med 1 mL passaging media. Använd en cell lyftare att försiktigt skrapa och lyfta cellerna från ytan av brunnen.
- Separera cellerna mekaniskt med en steril 2 mL glaspipett. Upprepa tills cellerna är väl separerade jämnt i små kolonier när observeras under ett mikroskop.
- När cellerna har tillräckligt dissocierats, tillsätt 5 mL passaging media för att dela upp cellerna 1:6. Justera mängden passaging media som ska läggas till för att matcha önskat delningsförhållande.
- Aspirera den hESC-kvalificerade matrisen från hESC-kvalificerade Matrix-belagda plattan och Ersätt med 1 mL passaging Media per brunn. Tillsätt 1 mL dissocierade celler per brunn.
5. kardiomyocytdifferentiering
- Använd hiPSC-linjer som är väletablerade (mer än 20 passager) och uppvisar en homogen morfologi innan hjärt differentiering påbörjas.
- Se till att iPSCs är runt 70 − 80% confluent.
- Tvätta cellerna 1x i PBS utan ca2 + och mg2 +.
- Tillsätt 2 mL D0-media (steg 1,7) per brunn och överför tillbaka cellerna till inkubatorn.
- Efter 24 h, Ersätt med 3 mL D1-Media per brunn för 48 h.
- På dag 3 ersätter du mediet med 2 mL D3-Media per brunn. Upprepa med D4-media på dag 4.
- På dag 5 ersätter du mediet med 3 mL D5-Media per brunn.
- På dag 7 ersätter du mediet med 3 mL D7-Media per brunn och överför till en inkubator med 37 ° c, 5% CO2och normal O2 -koncentration. Byt ut D7 (RPMI + B27)-mediet var 2: e dag.
6. urvalsförfarande och iPSC-CM dissociation
- Tio dagar innan du utför ca2 + transienta mätningar eller någon funktionell analys, Ersätt RPMI + B27-mediet med 3 ml urvals medium per brunn för 48 h.
- Ersätt mediet med 3 mL markerings medium för en annan 48 h.
- Byt ut mediet mot 2 mL RPMI + B27 Media per brunn i 24 timmar.
- Coat standard 6 plattor som beskrivs i avsnitt 2.
- Tillsätt 1 mL steril 0,25% trypsin med EDTA till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° c i 5 min.
- Använd en 1 000 μL pipett och separera cellerna mekaniskt så att enstaka celler kan ses när de observeras i Mikroskop.
- Överför cellerna till ett sterilt 15 mL koniskt rör och tillsätt 2 mL RPMI 20-Media per brunn. Centrifugera i 5 min vid 800 x g.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna i RPMI + B27 media. Aspirera den hESC-kvalificerade matrisen från plattorna och Ersätt med 1 mL RPMI + B27-media.
- Med hjälp av en 1 000 mL pipett spetsen, separera mekaniskt cellpelleten tills lösningen verkar homogen.
- Överför ungefär 500 000 celler till varje brunn. Överföring till inkubator för 24 h.
- Byt ut mediet mot 3 mL markerings medium per brunn för 48 h.
- Byt ut mediet med 3 mL RPMI + B27 per brunn. Behåll celler i D7 media (RPMI + B2 ändra Media varje 2 dagar tills den är klar för funktionell analys.
7. beredning av iPSC-CMs för flödescytometri
- När cellerna är av önskad ålder och har genomgått metabolisk selektion (avsnitt 6), tvätta cellerna med PBS utan ca2 + och mg2 +.
- Tillsätt 1 mL per brunn av trypsin 0,25% och inkubera i 5 − 7 min vid 37 ° c.
- Pipettera blandningen 5 − 10X med en P1000 spets för att singularisera cellerna och överför till en 15 mL tub innehållande 2 mL RPMI 20.
- Snurra cellerna på 600 x g i 5 min.
- Tillsätt 100 μL Fixeringslösning (4% PFA) till cellpelleten. Tillsätt lösningen droppvis med kontinuerlig, mild vortexa och sedan på is i 15 min.
- Tillsätt 1,5 mL PBS. Samla cellerna genom centrifugering och Aspirera supernatanten.
- För varje experiment, inkludera en obefläckade kontroll per fixering/permeabilization villkor.
- Omsuspendera cellerna i 500 μL blockerande lösning (2% FBS/2% BSA i PBS med 0,1% NP-40) i 30 minuter vid RT.
- Utan att ta bort blockeringslösningen, tillsätt den primära antikroppen MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) och inkubera 45 min vid RT.
- Tvätta med blockeringsbuffert. Samla celler genom centrifugering och aspirera lösning.
- Lägg till sekundär antikropp Alexa fluor 555/488 (1:750) utspädd i blockeringsbufferten för 45 min vid RT eller över natten vid 4 ° c.
- Tillsätt 1,5 mL PBS. Samla celler genom centrifugering och aspirera lösning.
- Omsuspendera cellerna i 250 − 300 μL PBS. Använd en P1000 pipett för att disaggregera cellerna.
- Förbered runda botten rör med en 35 μm nylon mesh cell SIL mössa. Pre-våt cellen SIL med 50 μL av PBS och ställa in röret på is.
- Överför lösningen med disaggregerade celler till de runda botten rören med cell SIL CAPS. Låt cellen lösningen rinna av naturligt eller knacka på botten av röret mot en plan yta, vid behov, för att säkerställa fullständig dränering och insamling av cellerna i röret. Se till att ställa tillbaka röret på isen så snart som möjligt.
- Skölj cellen SIL med 250 μL PBS att återvinna eventuella kvarvarande celler.
- Underhålla rören på is och täck med aluminiumfolie tills flödescytometri analys.
8. plätering Kardiomyocyter på glas täckplåtar
Anmärkning: utför alla steg i en steril miljö.
- Förbered de glastäckglas som beskrivs i steg 2,10 och 2,11.
- När iPSC-CMs har valts och är av önskad ålder, Följ steg 6.5 − 6.7 att separera iPSC-CMs.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna i en tillräcklig mängd av RPMI 20 media för att ha ungefär 300 000 celler per 250 μL.
- Med hjälp av en 2 mL glaspipett, separerar den mekaniskt cell pelleten tills lösningen verkar homogen.
- Aspirera hESC-kvalificerad matris från täckglas.
- Med en 1000 μL pipett, blanda och dra 250 μL av lösningen från det koniska 15 mL-röret.
- Dispensera långsamt 250 μL av lösningen på glas täckglasen, och var extra försiktig så att du bara lägger till det område där den hESC-kvalificerade mat ris beläggningen finns.
- Överför försiktigt till inkubatorn och lämna över natten, var noga med att inte skaka eller sprida cellerna på täckglas. Nästa morgon, tillsätt försiktigt 2 mL D7 (RPMI + B27) media till varje brunn med täckslip. Ändra media efter 24 h och var 2 dagar efter det.
9. fixering av celler
- Säkerställ att en adekvat mängd PBS med ca2 + och mg2 + jämställas med 4 ° c.
- Bered en 4% paraformaldehydlösning (PFA) utspädd i PBS med ca2 + och mg2 + och jämvikt till 4 ° c.
- När iPSC-CMs är av lämplig ålder, har genomgått metabolisk selektion (avsnitt 6), och har pläterats på täckglas (avsnitt 8), tvätta cellerna 3x med 1 mL kallt PBS med ca2 + och mg2 + per brunn.
- Tillsätt 1 mL kallt 4% PFA och lämna cellerna vid RT under huven i 15 min.
- Tvätta cellerna med kallt PBS för att avlägsna överflödig PFA.
- Tillsätt 2 mL PBS med ca2 + och mg2 + och förvara vid 4 ° c.
10. färgning av immunofluorescensteknik
- Ta bort PBS från de fasta cellerna och tillsätt 1 mL blockeringsbuffert. Inkubera i 1 h vid RT.
- Ta bort blockeringsbuffert och tillsätt den primära antikroppen (5 mg/mL) utspädd i blockeringsbuffert. Inkubera över natten vid 4 ° c.
- Tvätta 3x i PBS med ca2 + och mg2 + för 5 min vardera.
- Tillsätt sekundär antikropp utspädd i blockeringsbuffert 1:1000.
- Täck plattan med aluminiumfolie för att skydda den från ljus och inkubera för 45 min vid RT. Förvara aluminiumfolie för följande steg.
- Tvätta 3x i PBS med ca2 + och mg2 +, 5 min vardera.
- Lägg till en tillräcklig mängd DAPI-arbetslösning för att helt täcka cellerna och inkubera vid RT i 10 minuter.
- Tvätta provet noggrant med PBS med ca2 + och mg2 + för att ta bort överflödig DAPI.
- Ta nya glas bilder och Lägg till en droppe monteringsmedel i mitten. Använd pipetten för att fördela monterings mediet jämnt. Sätt täckglas med cellerna med framsidan nedåt på bilderna.
ANMÄRKNINGAR: celler kan lagras i 30 dagar om de skyddas från ljus.
11. bedömning av intracellulära ca2 + transienter
- När iPSC-CMs är minst 3 månader gammal, har genomgått metabolisk selektion (avsnitt 6), och har pläterats på täckglas, behandla dem med 2 μL av fura-2, AM (slutkoncentration: 1 μM) och inkubera vid 37 ° c i 10 min.
Obs: fura-2 är ljuskänsligt. Utför alla lastnings procedurer och experiment i mörker. - Förbered systemet för förvärv och analys av kalcium och kontraktilitet.
- Strömsystemet säkerställer att ljusbågen initieras (figur 1B).
- Placera kammaren på systemet och Anslut rören från pumpen till lämpliga inlopp och utlopp och den elektriska kabeln från stimulatorn till kammaren som visas i figur 1C.
- Fyll den perfusion röret som går genom fluidic inline värmare med 37 ° c föruppvärmd tyrodes lösning.
- Justera kamera-och ram öppningens dimensioner för att minimera bakgrundsområdet.
- Montera en glastäckslip med iPSC-CMs i kammaren och fäst.
- Tillsätt 500 μL Tyrodes lösning direkt ovanpå det fästa glas täckglaset försiktigt och börja parfymera kammaren (1,5 mL/min) med Tyrodes lösning.
- Pace iPSC-CMs med 1 Hz fältstimulering med hjälp av den elektriska stimulatorn (10 V, 4 MS).
- Inkubera iPSC-CMs i kammaren med stimulering i minst 3 − 5 min för cellerna att tvätta fura-2 färgämne och anpassa sig till miljön och att tvätta ut fluorescerande färgämne.
- Justera visningsfönstret till den vänstra övre delen av glas täckglaset.
- Börja spela in.
- När du har samlat in en konsekvent ström av 5 − 10 toppar klickar du på pausa för att tillfälligt stoppa inspelningen.
- Se till att varken fokus eller dimensioner av visningsfönstret ändras, flytta mikroskopet scenen till angränsande område, rör sig mot den motsatta änden, och återuppta inspelningen.
- Upprepa steg 11,9 och 11,10 för att skanna över täckbladet, inledningsvis flytta till vänster, sedan nedåt i en Zig-Zag sätt att täcka hela täckmantel området. Detta består av 80 − 100 mätningar per täckslip.
Obs: begränsa den totala mätningstiden till 10 minuter som sekundära faktorer orsakar en minskning av ca2 + övergående. - När ca2 + transienter förvärvas analyserar du data med analysprogram varan fluorescens traces enligt tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs i figur 1A genererade mycket ren kardiomyocyter som förvärvar en ventrikulär/vuxen-liknande fenotyp med tid i kulturen. Enligt bedömning av immunofluorescensfärgning för förmaks-och ventrikulär myosin-regulatoriska ljus kedjan 2 ISO Forms (MLC2A respektive MLC2V), var majoriteten av de celler som genereras av detta protokoll MLC2A-positiva vid dag 30 efter induktion av hjärt differentiering, medan MLC2V uttrycktes i mycket lägre mängder vid samma tidpunkt (figur 2A, övre paneler). Allteftersom tiden i kulturen ökade (dag 60 och 90) observerades en fullständig växling av MLC2 isoformer (MLC2A till MLC2V) (figur 2a, botten paneler). För att kvantifiera de MLC2A-och MLC2V-positiva cellerna utfördes flödescytometrianalys. I enlighet med resultaten av immunofluorescensresultatet visade flödescytometridata tidigt stadium (dag 30) iPSC-CMs mest uttryckt MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1,9% MLC2V +) (se figur 2b, vänster panel), jämfört med sent skede (dag 90) IPSC-CMS, som mestadels uttryckte MLC2V (41,3% MLC2V + jämfört med 16,7% MLC2A +) (se figur 2b, höger panel). Eftersom uttrycket mönstret av MLC2A och MLC2V är känt för att vara ett kännetecken för hjärt differentiering och mognad, dessa resultat tyder på att långvarig kultur tid ökar mogningen av iPSC-CMs och att majoriteten av cellerna verkar vara engagerade i ventrikulär fenotyp. Vi bedömde sedan tids beroendet för ca2 + hanterings mogningen. Ca2 + övergående mättes i IPSC-CMS vid de tre differentierings tiderna (dag 30, 60 och 90), och jämfört med isolerade vuxna råtta kardiomyocyter (arcms). Ca2 + amplitud ökade signifikant i IPSC-CMS på dag 90 och liknade arcms (figur 3A, B). Graden av ca2 + återupptaget (Decay-Tau) på dag 90 var betydligt snabbare jämfört med dag 30 IPSC-CMS, och närmare Arcms (figur 3C). Effekten av β-adrenerga stimulering på ca2 + transienter utvärderades ytterligare genom att behandla cellerna med 10 nm isoproterenol (ISO) i 10 min vid 37 ° c. Som observerats i ARCMs, ISO signifikant ökade ca2 + övergående och accelererade graden av ca2 + återupptaget i dag 90 IPSC-CMS. Inga förändringar observerades i dag 30 iPSC-CMs (figur 3D-F). Intressant, dag 90 iPSC-CMs kunde följa ökande elektrisk stimulering (från 0.5 − 3 Hz), på ett liknande sätt som observerats i ARCMs (figur 4B). Sammantaget, dessa resultat visar att iPSC-CMs härrör från denna metod har liknande egenskaper som de som ses i native CMs, särskilt ventrikulär-liknande fenotyper, mogna ca2 + hantering egenskaper, och positiva β-adrenerga svar.
Kontaminerande icke-kardiella celler kan påverka den funktionella mogningen av humant iPSC-CMs under differentiering17. Figur 4a visar en jämförelse mellan 3 månader gamla celler som erhålls från högeffektiva differentieringar (topp paneler, video 1), uttrycker robust den specifika ventrikulär markör (MLC2V), och 3-månaders-gamla celler som erhållits från låg effektivitet differentieringar (botten paneler, video 2), visar IPSC-CMS blandas med alfa-Smooth muskel aktin (αsma)-positiva celler. Intressant, funktionell analys visat förändrat ca2 + transienter i blandade IPSC-CMS/icke-CMS förberedelse jämfört med IPSC-CMS från hög effektivitet differentiering. Särskilt de celler som erhållits från låg verkningsgrad differentieringar uppvisade mycket liten ca2 + amplitud och automaticitet(figur 4b, mitten panel) jämfört med ren IPSC-CMS (figur 4b, övre panelen) och arvcs (figur 4b, bottenpanelen). Dessutom presenterade celler från lågeffektiva differentieringar arytmiska mönster (figur 4C).
Det är viktigt att notera att iPSC-CMs visas i den övre panelen i figur 4A också genomgick metabola urvalet, vilket är ett viktigt steg för att ytterligare berika en population av IPSC-CMS som redan härrör från en mycket effektiv differentiering. Dessa data tyder på att hög effektivitet hjärt differentiering protokoll som genererar högkvalitativa CMs är nödvändiga för att exakt recapitulate en hjärt fenotyp in vitro-.
Figur 5 visar ca2 + amplitud variation i olika områden av CMS monolayer, plottas över en tidsperiod på 1 200 s. Ca2 + amplituderna mätta i början av en stimulering frekvens av 1 Hz (200 s) var mycket varierande och blev mer konsekvent som stimulering fortsatte (200 − 900 s). Efter en tidsperiod på 900 s minskade dock ca2 + amplituden avsevärt. Dessa data indikerar att, vid inspelning av ca2 + transienter i IPSC-CMS, är det nödvändigt att låta cellerna stabiliseras vid 37 ° c under konstant stimulering i minst 200 s. Dessutom måste inspelningar begränsas till ett specifikt tidsfönster (200 − 900 s) för att säkerställa reproducerbara resultat.
Figur 1: övergripande schematiska av iPCS-CMs beredning och ca2 + transienta instrument. (A) Schematisk av kardiell differentiering protokoll som visar utvecklingsstadier av differentierande iPSCs. Skalstapel = 50 μm. B) systemet för förvärv och analys av kalcium och kontraktilitet. a) peristalitic pump b) inverterad Mikroskop c) strömkälla för digitalkameran d) elektrisk stimulator e) fluorescenssystem interface f) filter hjul styrenhet (c) system kammare. a) system kammar kroppen. b) vätske intag. c) vätske utlopp. d) fluidic inline lösning värmare. f) elektroder som förbinder system kammaren med den elektriska stimulatorn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: jämförelse av MLC2A och MLC2V uttryck i iPSC-CMS vid olika dagar av differentiering. A) immunofluorescensfärgning av IPSC-CMS vid dag 30, 60 och 90 efter differentierings induktion för MLC2A och MLC2V. Skalstapel = 20 μm. (B) flödescytometri analys av IPSC-CMS för MLC2V och MLC2A vid 1 månad och 3 månader efter differentiering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av iPSC-CMS egenskaper vid olika dagar av differentiering. A) representativa ca2 + transienta spår vid olika dagar av differentiering. (B-C) Genomsnittlig ca2 + amplitud och ca2 + förfall framkallade under stimulering vid 1 Hz. (D-F) effekten av isoproterenol (ISO, 10 nm) behandling i IPSC-CMS vid olika dagar av differentiering. ARCMs indikerar isolerade råtta vuxna kardiomyocyter. N = 70 − 100 områden; * p < 0,05; p < 0,001, som bestäms av Students t-test. Data representeras som medelvärde ± S.E.M. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse mellan hög verkningsgrad och låg effektivitets differentiering av iPSC-CMS. A) immunofluorescenscfärgning av IPSC-CMS för αsma och MLC2V. Skalstapel = 20 μm. B) representativa spår som visar ca2 + transienter från hög verkningsgrad (ovan) och låg verkningsgrad (mellersta), och isolerade råtta vuxna kardiomyocyter (nedan). Den myocyter stimulerades vid 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz, och 3 Hz.C) representativa spår som visar ett arytmiskt mönster från en dålig differentiering. Pilarna indikerar punkt tempo. ARCMs indikerar isolerade råtta vuxna kardiomyocyter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tidsberoende ca2 + amplitud från en enda täckslip. Ca2 + amplituder från olika områden i en täckslip plottas på ett tidsberoende sätt. Icke-rekommenderade tidsperioder för att mäta ca2 + övergående indikeras i de streckade områdena (< 200 s eller > 900 s). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: representativ video som visar ett exempel på en hög effektivitets differentiering. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2: representativ video som visar ett exempel på en låg verkningsgrad differentiering. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 3: representativ video som visar ett exempel på en homogen enskiktslager distribution av IPSC-CMS på ett glas Coverslip. Den här videon visar den rekommenderade CELLTÄTHETEN som ska användas för funktionell analys. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 4: representativ video som visar ett exempel på celler från en låg verkningsgrad differentiering klädd på en glastäckslip. Cellerna i videon erhölls från en låg verkningsgrad differentiering. Celler från sådana differentieringar är vanligtvis inte distribueras homogent över täckslip och det är svårt att konsekvent hitta slå celler. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg för att använda humant iPSC-CMs som experimentella modeller är: 1) generera högkvalitativa kardiomyocyter (CMs) som kan säkerställa konsekvent prestanda och reproducerbara resultat; 2) tillåta cellerna att mogna i kulturen under minst 90 dagar för att på ett adekvat sätt bedöma deras fenotyp; 3) utföra elektrofysiologiska studier, t ex kalcium (ca2 +) transienta mätningar, för att ge en fysiologiskt relevant funktionell karakterisering av humant IPSC-CMS. Vi utvecklade en monolayer-baserad differentiering metod som producerar högkvalitativa ventrikulär-liknande iPSC-CMs. Vår metod bygger på flera avgörande faktorer och är en variant av befintliga protokoll14,18. Till skillnad från andra protokoll, använder denna en låg syreförhållanden (5% O2) för iPSCs underhåll samt under den första veckan av deras differentiering till CMS. låga nivåer av syre härma miljötillståndet under embryonal-och foster hjärt utveckling19. Hypoxiska villkor har också visat sig öka iPSCs proliferation och deras efterföljande differentiering till CMs20. Sådd densitet och korrekt iPSCs passaging är också kritiska faktorer för en lyckad hjärt differentiering. Hög differentierings effektivitet observeras när 70 − 80% konfluenta iPSCs separeras i små cell aggregat med hjälp av en enzymfri lösning, och seedas vid en delnings kvot på 1:6. Hjärt differentiering kan inledas när cellerna når en sammanlänkning av 70 − 80%, förväntas cirka 4 dagar efter uppdelningen. CHIR99021 (10 μM) behandling i början av differentieringen kommer att orsaka betydande celldöd. Cellproliferation observeras dock när CHIR99021 tas bort från kulturen följande dag. En korrekt balans mellan celldöd och spridning är avgörande för att bevara en enskiktslager kultur genom differentiering, vilket är en annan viktig faktor för en lyckad differentiering. Om iPSC-tätheten är antingen för låg eller för hög, kommer den efterföljande differentieringen att vara en låg verkningsgrad hjärt differentiering (figur 4a, video 2). Figur 4A visar ett sådant exempel på en låg verkningsgrad differentiering, där kardiomyocyter som härrör från en hälsosam donator blandas med andra celltyper, såsom α-glatt muskel Actin-positiva celler. Viktigt är att ca2 + transienter inspelade från sådana preparat visade förändrade egenskaper, såsom låg ca2 + amplitud och arytmiska mönster, som lätt kan misstolkas som biologisk variation. En lyckad och högeffektiv differentiering från samma cellinjer, istället, genererade en ren population av ventrikulär-liknande kardiomyocyter (figur 4a, video 1) tillsammans med regelbundna ca2 + transienter (figur 4B, övre panelen). Således spelar kvaliteten på differentieringen en viktig roll i den totala magnituden, form, regelbundenhet och frekvens för en ca2 + övergående.
En annan viktig aspekt av en framgångsrik och effektiv differentiering är att få en berikad population av kardiomyocyter. Medan odifferentierade stamceller och andra iPSC-härledda celltyper använder glukos som energikälla, kan CMs använda laktat effektivt för ATP och glutamat produktion21. Således, för att få en ännu renare population av CMs, cellerna odlas i laktat-kompletterat och glukos-utarmat kultur medium. Odling iPSC-CMs i detta välja media under en lång tid, dock, kan leda till funktionsnedsättning. Därför, för att rena iPSC-CMs och fortfarande bevara sin funktion, metaboliskt urval utförs endast för 10 dagar, från dagar 80 − 90 sedan differentiering induktion. Efter denna period ersätts urvals mediet och cellerna upprätthålls i RPMI/B27-media. Medan urvals protokollet kan genomföras mycket tidigare22 (t. ex., runt dag 15), är det tillrådligt att vänta till dag 80, eftersom detta kan förhindra kvarvarande iPSCs eller andra celltyper från prolifererande med den tid som cellerna är redo för funktionella studier (dag 90). Det är därför viktigt att alla ovan nämnda faktorer beaktas för en lyckad, effektiv och robust hjärt differentiering.
Förutom robustheten och effektiviteten av hjärt differentiering protokoll, mognad och celltyp specifikation (t. ex., förmaks-och ventrikulär celltyper) också utgöra en stor utmaning för att använda iPSC-CMs för att modellera hjärtsjukdom. Under de senaste åren, många lovande mogning strategier har rapporterats, inklusive elektrisk stimulering, mekanisk stretch, och substrat styvhet23. Emellertid, långvarig in vitro-kultur av IPSC-CMS fortsätter att vara en enkel och praktisk metod för att generera vuxna-liknande kardiomyocyter24,25.
I överensstämmelse med andra publicerade rapporter12, IPSC-CMS som genereras av detta in vitro differentiering protokoll visar robust uttryck för ventrikeln-specifika MLC2V och mycket lägre nivåer av MLC2A på dag 90 (figur 2a, B). Medan fetal CMs innehåller både MLC2A och MLC2V isoformer, Adult ventrikulär CMs innehåller endast MLC2V. Denna växel i MLC isoform prevalensen sker under neonatal stadiet26.
Kardiomyocyter som genereras genom detta protokoll Express ventrikulär specifik markör, såsom MLC2V, som successivt ökar i överflöd som cellerna hålls i kulturen längre (figur 2A, B). Detta indikerar att en långvarig in vitro-kultur förbättrar mogningen av CMs som verkar vara åtagit sig att den ventrikulär fenotyp.
Tid i kulturen påverkar också i hög grad ca2 + hantering mognad24,25. Tidigare rapporter beskrev att efter 20 dagar av differentieringen induktion, det fanns inga större förändringar i Calc ca2 + transienter som cellerna växte äldre25. Men de kardiomyocyter som genereras från protokollet beskrivs här visar progressiva förändringar i ca2 + amplitud och ca2 + förfall över de tre tidspunkter utvärderas (30, 60, och 90 dagar efter induktion av hjärt differentiering) (figur 3A-C). Intressant, dessa data visar att ca2 + övergående parametrar, såsom ca2 + amplitud och ca2 + förfall, mätt i dag 90 IPSC-CMS liknade dem som mäts i isolerade råtta vuxna Kardiomyocyter (arcms). Dessutom var den 90 dagar gamla iPSC-CMs också kunna följa olika elektriska stimuleringar som sträcker sig från 0,5 Hz till 3 Hz konsekvent, liknande ARCMs (figur 4B). I det framtida arbetet skulle det vara intressant att se hur en ännu längre tid i kulturen påverkar de funktionella egenskaperna hos dessa iPSC-CMs jämfört med ARCMs.
Dessutom, eftersom β-adrenerga receptorn signalering visar en distinkt tidsberoende mognande mönster efter hjärt induktion27, effekten av isoproterenol på ca2 + övergående i IPSC-CMS som genereras genom detta protokoll testades. Stimulering med isoproterenol ledde till ett positivt lusitropiskt svar i dag 90 iPSC-CMs, liknande det som observeras i ARCMs (figur 3D-F).
De funktionella bedömningarna av iPSC-CMs som utfördes i denna studie har vissa skillnader och begränsningar jämfört med isolerade vuxna CMs. Den vuxna CMs har väl utvecklade och välarrangerade sarkomeres. Detta möjliggör kontraktilitet mätningar genom detektion av sarcomere rörelse. Eftersom ingen av de nuvarande protokollen generera helt mognat, vuxen-liknande iPSC-CMs, kontraktilitet mätningar genom sarcomere upptäckt är inte genomförbart. Även om det är möjligt att upptäcka förflyttning av cellens kanter när cellen kontrakt, är det betydligt mer utmanande att spåra dessa rörelser på ett exakt sätt i iPSC-CMs. Från och med nu, tekniska framsteg behövs för att möjliggöra noggranna bedömningar av kontraktilitet i dessa celler. Å andra sidan är det möjligt att mäta ca2 + transienter av IPSC-CMS med hjälp av en ca2 + indikator som fura-2. Till skillnad från vuxen CMs, dock iPSC-CMs är grupperade och inte har en väldefinierad kant. Därför representerar den inspelade ca2 + transienterna vanligtvis inte en enda cell, utan snarare en grupp celler i ett visst område. Även om det är möjligt att justera områdes storleken är det oerhört utmanande att spela in ca2 + transienter från en enda cell. Det är viktigt att när CMS är klädd på täckglas, tätheten är sådan att de uppnår en homogen enskiktslager distribution (video 3), som gör det möjligt att konsekvent hitta områden med celler. Om cellerna inte distribueras som en enskiktslager på täckslip (Video 4), kommer det att finnas områden utan celler, och om täckslip screenas speciellt för områden med slog celler för att utföra mätningarna, kan detta leda till en "val bias". Istället för att välja ett specifikt område för att slå celler, är det rekommenderat att samla in data från flera områden i hela täckglas, vilket endast är möjligt när cellerna distribueras som en homogen monolayer. Mätningar från 100 sådana olika områden, som tar ca 10 min, är tillräckliga för att ge tillförlitliga funktionella egenskaper hos cellerna. Slutligen, som visas i figur 5, IPSC-CMS behöver tid att anpassa sig till mätförhållandena. För pålitliga mätningar rekommenderas att cellerna stabiliseras vid mätförhållandena under minst 3 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av AHA vetenskapsman Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award för klinisk och translationell forskarkarriär utveckling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 och AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
References
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J.
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
