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Genetics

ग्लियोब्लास्टोमा में कार्यात्मक रूप से एसोसिएटेड miRNAs की विशेषता और जीन थेरेपी के लिए कृत्रिम क्लस्टर में उनकी इंजीनियरिंग

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60215
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

Summary

यहाँ वर्णित जैविक synergistic miRNAs और लघु transgenes, जो जीन चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक साथ overexpression की अनुमति देता है में उनके विधानसभा के मॉड्यूल की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल है.

Abstract

स्वास्थ्य और रोग में माइक्रोआरएन (मिरना) की जैविक प्रासंगिकता एक ही miRNA की कार्रवाई के बजाय कई एक साथ नियंत्रणमुक्त miRNAs के विशिष्ट संयोजनों पर निर्भर करता है। इन विशिष्ट miRNAs मॉड्यूल की विशेषता चिकित्सा में उनके उपयोग को अधिकतम करने में एक मौलिक कदम है. यह अत्यंत प्रासंगिक है क्योंकि उनके संयोजी विशेषताओं का व्यावहारिक रूप से शोषण किया जा सकता है। यहाँ वर्णित ग्लियोब्लास्टोमा में oncogenic क्रोमैटिन दमनकारी के नियंत्रण के लिए प्रासंगिक एक विशिष्ट miRNA हस्ताक्षर को परिभाषित करने के लिए एक विधि है। दृष्टिकोण पहले सामान्य ऊतक की तुलना में ट्यूमर में अविनियमित कर रहे हैं कि miRNAs के एक सामान्य समूह को परिभाषित करता है. विश्लेषण आगे अंतर संस्कृति की स्थिति द्वारा परिष्कृत है, miRNAs के एक उपसमूह है कि सह विशिष्ट सेलुलर राज्यों के दौरान एक साथ व्यक्त कर रहे हैं underscoring. अंत में, miRNAs कि इन फिल्टर को संतुष्ट एक कृत्रिम polycistronic transgenes, जो स्वाभाविक रूप से मौजूदा miRNA समूहों जीन के एक पाड़ पर आधारित है में संयुक्त कर रहे हैं, तो कोशिकाओं को प्राप्त करने में इन miRNA मॉड्यूल के overexpression के लिए इस्तेमाल किया.

Introduction

मिराना कई रोगों के लिए एक व्यापक जीन चिकित्सा दृष्टिकोण के विकास के लिए एक बेजोड़ अवसर प्रदान करते हैं1,2,3, कैंसर 4 सहित,5. यह इन जैविक अणुओं की अनेक विशिष्ट विशेषताओं पर आधारित है , जिनमें उनके छोटे आकार6, सरल जीवजनन7और सहयोग8में कार्य करने की स्वाभाविक प्रवृत्ति शामिल है . कई रोगों विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न है, जो अक्सर जटिल जैविक कार्यों9के विनियमन पर एकाग्र द्वारा विशेषता है. इस विधि का उद्देश्य पहले miRNAs के समूहों है कि synergically विशिष्ट सेलुलर कार्यों के लिए प्रासंगिक हैं की पहचान करने के लिए एक रणनीति को परिभाषित करने के लिए है. परिणामस्वरूप, यह डाउनस्ट्रीम अध्ययनों और अनुप्रयोगों में ऐसे मिरना संयोजनों की पुन स्थापना के लिए एक कार्यनीति प्रदान करता है।

इस विधि में एक बार में कई miRNAs के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, MRNAs की एक बड़ी संख्या के अपने एक साथ लक्ष्यीकरण पर लाभ, इस प्रकार रोगों के जटिल परिदृश्य recapitulating. इस दृष्टिकोण को हाल ही में तीन miRNAs के एक समूह को परिभाषित करने के लिए नियोजित किया गया है कि 1) एक साथ मस्तिष्क कैंसर में downregulated रहे हैं और 2) तंत्रिका भेदभाव के दौरान एक मजबूत सह अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकिरण या एक द्वारा जीनोटॉक्सिक तनाव के जवाब में डीएनए ऐल्किलेटिंग एजेंट. क्लस्टरिंग विधि द्वारा तीन miRNAs के इस मॉड्यूल के combinatorial पुनः अभिव्यक्ति कैंसर कोशिकाओं के जीव विज्ञान के साथ गहरा हस्तक्षेप में परिणाम है और आसानी से पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक जीन थेरेपी रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताहै 10. इस प्रोटोकॉल miRNA अनुसंधान और उसके translational अनुप्रयोगों में शामिल लोगों के लिए विशेष रुचि का हो सकता है.

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Protocol

1. ग्लियोब्लास्टोमा में कार्यात्मक रूप से संबद्ध मिर्ना की विशेषता

  1. ग्लियोब्लास्टोमा बनाम मस्तिष्क में व्यापक अंतर miRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण
    1. सबसे पहले, ट्यूमर में सबसे महत्वपूर्ण नियंत्रणमुक्त miRNAs निर्धारित करते हैं। यह कम से कम तीन अलग अलग तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है:
      1. मेरा कैंसर जीनोम एटलस, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga में पाया, अनुक्रमण डेटा11के लिए .
      2. एक नए ऑपरेटिव नमूने12से microarray विश्लेषण प्रदर्शन .
      3. पहले प्रकाशित डेटासेट13का उपयोग करें.
        नोट: जो भी विधि चुना जाता है, उत्पादन miRNAs जिसका अभिव्यक्ति सांख्यिकीय सहसंबद्ध है की एक थोक सेट प्रदान करता है (या तो सीधे या व्युत्क्रम) ट्यूमर जीव विज्ञान के साथ. इस प्रारंभिक समूह miRNAs के पूल का गठन किया है कि आगे miRNAs के एक सबसेट की पहचान के लिए विश्लेषण कर रहे हैं अभिव्यक्ति परिवर्तन का एक और अधिक गतिशील विश्लेषण प्रदर्शन करके सबसे कड़े कार्यात्मक संघ प्रदर्शित, के रूप में नीचे चर्चा की.
  2. शर्त-विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. सेल विभेद नकरने का प्रेरण:
      1. मोनोलेयर संस्कृति के गठन के पक्ष में पूर्व लेपित पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) प्लास्टिक के व्यंजन का उपयोग करें। डिश कोटिंग के लिए, पानी में PDL भंग 100 g/mL की एकाग्रता पर. 25 बउ2 सतह पर 1 एमएल घोल का उपयोग करें। PDL समाधान के आवेदन के बाद पीबीएस 6 एच के साथ 2x कुल्ला।
      2. प्लेट मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बराबर मात्रा में (100,000 कोशिकाओं/5 एमएल) या तो स्टेम सेल माध्यम में (न्यूरोबेसल मध्यम + B27 पूरक + 20 ng/mL EGF/FGF), एस्ट्रोसाइटिक भेदभाव माध्यम (DMEM + 10% FBS), या न्यूरॉन अंतर मध्यम (neurobasal मध्यम + B27 पूरक, + 2 $M रेटिनोइक एसिड)14| प्रोटोकॉल oligodendrocyte भेदभाव के लिए IGF-1 (200 ng/mL) के बाद EGF/FGF हटाने14,15के अलावा की आवश्यकता है.
      3. सेल चढ़ाना के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 1 सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में जगह है।
    2. आरएनए निष्कर्षण:
      1. 7 दिनों के बाद, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और माध्यम को हटा दें।
      2. पीबीएस (5 एमएल) से कोशिकाओं को धो लें। फिर, कोशिकाओं को lyse करने के लिए 1 एमएल lysis अभिकर्मक जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और कोशिकाओं को सेल खुरचनी का उपयोग करके 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में परिमार्जन करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर lysed कोशिकाओं युक्त ट्यूब रखें.
      3. निर्माता के निर्देशों के बाद कुल आरएनए अलगाव के लिए आगे बढ़ें।
    3. miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण:
      1. वास्तविक समय पीसीआर द्वारा तीन भेदभाव पैटर्न के बीच चरण 1.1 में पहचान की विशिष्ट miRNAs के अंतर अभिव्यक्ति की मात्रा, TakMan जांच का उपयोग कर और रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर प्रवर्धन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ( चित्र 1) .
  3. तनाव-विशिष्ट चुनौतियों द्वारा miRNA समूहों का सत्यापन
    1. संस्कृति G34 ग्लियोब्लास्टोमा न्यूरोबेसल मध्यम + B27 पूरक + 20 ng/mL EGF/FGF में स्टेम की तरह कोशिकाओं. एक 25 सेमी2 कम लगाव फ्लास्क में 5 एमएल में 1 x 106 कोशिकाओं के साथ शुरू करो।
    2. चढ़ाना के बाद 48 एच शुरू, डीएनए alkylating एजेंट temozolomide (टीएमजेड) हर 5 दिनों के दोहरीकरण सांद्रता जोड़ने के रूप में, इस प्रकार है:
      1. 5 दिनों के लिए 5 डिग्री सेल्सियस के साथ शुरू करो. 5 दिनों के बाद, मध्यम को हटा दें और टेमोज़ोलोमाइड के बिना नए माध्यम से बदलें, जीवित कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति दें। 48 ज के बाद, 10 डिग्री सेल्सियस TM$ जोड़ें और एक और 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. 1.3.2.1 दोहराएँ, टीएमजेड एकाग्रता हर बार दोहरीकरण, जब तक कम से कम 100 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता तक पहुँच जाता है और कोशिकाओं को दवा के लिए प्रतिरोधी हो10.
    3. एक समानांतर प्रयोग में, G34 कोशिकाओं को निम्नानुसार विकिरणित करें:
      1. एक 25 सेमी2 कम लगाव फ्लास्क में 5 एमएल में 1 x 106 कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 48 एच शुरू, ऊर्जा के 2 Gy के साथ कोशिकाओं विकिरण (किसी भी विकिरणफोटन उत्सर्जन प्रदान करने के लिए स्वीकार्य है)। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर पर वापस लौटें और परेशान न हों। 48 ज के बाद, कोशिकाओं को फिर से ऊर्जा के अतिरिक्त 2 Gy के साथ विकिरण.
      2. 1-3-1 4x को तब तक दोहराएँ जब तक ऊर्जा का कुल 10 ज्ञ प्रशासित न हो।
      3. इनक्यूबेटर पर कोशिकाओं को वापस करें और उन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से पहले कम से कम 5 दिनों के लिए नए माध्यम में पुनर्प्राप्त करने दें।
    4. प्रतिरोध के प्रेरण के बाद, lysis अभिकर्मक का उपयोग कर lyse कोशिकाओं और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कुल आरएनए निकालने.
    5. 1-1-1-2 खंड में पहचाने गए विशिष्ट मिर्ना ओंत-य अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-त अि-तअि-यअि-त अि
  4. संकुल miRNAs के कार्यात्मक अभिसरण की विशेषता
    1. 1-2-1.3 अनुभागों में परिभाषित प्रत्येक miRNAs के अनुमानित targetome प्राप्त करें miRNA लक्ष्यीकरण पूर्वानुमान उपकरण का उपयोग कर प्राप्त करें।
      नोट: हम आम तौर पर TargetScan का सहारा, के रूप में अपने एल्गोरिथ्म समय समय पर अद्यतन किया जाता है16. अतिरिक्त भविष्यवाणी उपकरण हैं miRanda17, miRDB18, और DIANA-miRPath19. इन सभी कार्यक्रमों के लिए स्वतंत्र हैं, वेब आधारित अनुप्रयोगों.
      1. Targetscan के सामने पृष्ठ से, पूर्व आबादी ड्रॉप-डाउन मेनू से ब्याज की miRNA का चयन करें. सबमिट करें बटन क्लिक करें.
      2. डाउनलोड तालिका लिंक(पूरक चित्र 1)का उपयोग करके स्प्रेडशीट के रूप में लक्ष्यों की परिणामी सूची डाउनलोड करें.
      3. झूठी सकारात्मक भविष्यवाणियों की संभावना को कम करने के लिए, डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों में संरक्षित साइटों कॉलम के भीतर केवल लक्ष्य शामिल करें। इसके अलावा, आगे stringency अतिरिक्त miRNA भविष्यवाणी कार्यक्रमों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है (ऊपर देखें) और केवल लक्ष्य है कि सभी एल्गोरिदम के लिए आम हैं सहित.
    2. प्रत्येक miRNA के लिए आम हैं कि रास्ते के संवर्धन के लिए मूल्यांकन करने के लिए ToppGene सुइट20 का उपयोग जीन आंटलजी श्रेणियों के अनुसार जिसके परिणामस्वरूप targetomes वर्गीकृत.
      1. प्रविष्टि प्रकार के रूप में HGNC प्रतीक का उपयोग करते हुए, "प्रशिक्षण जीन सेट" विंडो में चरण 1.4.1 से प्राप्त लक्ष्यों की सूची चिपकाएँ. सबमिट करें क्लिक करें gt; प्रारंभ करेंक्लिक करें. कार्यक्रम जीन के प्रवेश सूची के लिए सबसे महत्वपूर्ण "जाओ" श्रेणियों दिखा एक उत्पादन तालिका प्रदान करेगा (पूरक चित्र 2).
    3. अंत में एक आम मार्ग या सेलुलर प्रक्रिया के विनियमन के लिए प्रत्येक miRNA के योगदान की स्थापना करने के लिए (इस मामले में, क्रोमैटिन विनियमन), प्रत्येक targetome विशिष्ट सेलुलर प्रक्रिया में शामिल जीन की पूरी सूची के खिलाफ चरण 1.4.1 में प्राप्त की जाँच करें ( अर्थात, क्रोमैटिन विनियमन), वेन आरेख समारोह का उपयोग कर Bioinformatics और विकासवादी जीनोमिक्स वेबसाइट http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn में प्रदान की.
      नोट: यह प्रोग्राम एक ही समय में एकाधिक समूहों के प्रतिच्छेदन की अनुमति देता है (चित्र 3) . प्रत्येक miRNA द्वारा प्रदान की विशिष्ट अद्वितीय लक्ष्य तो एनोटेट और downstream कार्यात्मक प्रयोगों के लिए चयनित कर रहे हैं.
      1. कार्यक्रम के सामने पृष्ठ में, अपलोड करें या कॉपी / पेस्ट सूची यदि प्रत्येक miRNA या संबंधित खिड़कियों में ब्याज के लिए लक्ष्य mRNAs. प्रत्येक सूची को एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ नाम दें.
      2. सबमिटकरें क्लिक करें. कार्यक्रम प्रत्येक क्षेत्र में जीन की संख्या के साथ एक वेन आरेख के एक दृश्य उत्पादन प्रदान करेगा, साथ ही प्रत्येक सबसेट और चौराहे संयोजन के लिए mRNAs की एक पूरी सूची.

2. एक Polycistronic ट्रांसजेनिक क्लस्टर में miRNA मॉड्यूल की विधानसभा

  1. miR-17-92 क्लस्टर लोकपथ के आधार पर ट्रांसजेनिक पाड़ की तैयारी
    1. Ensembl जीनोम ब्राउज़र21से miR-17-92 क्लस्टर के न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम प्राप्त करें। का चयन करें $800 आधार जोड़ी "कोर" अनुक्रम टिड्डी के सभी छह एनकोडेड miRNA hairpins और कम से कम 200-न्यूक्लिओटाइड flanking अनुक्रम दोनों अपस्ट्रीम (5') और बहाव (3') कोर अनुक्रम के शामिल.
    2. ऊपर किसी भी शब्द संपादन प्रोग्राम में ऊपर अनुक्रम चिपकाएँ.
    3. मिराबेस22में पुन: प्राप्त करके छः देशी हेयरपिनों में से प्रत्येक के अनुक्रम को परिभाषित कीजिए। पहले से पहचाने गए "कोर" अनुक्रम की अवधि के भीतर इन दृश्यों में से हर एक को चिह्नित करें। प्रत्येक हेयरपिन के बीच कोई भी दृश्य स्पेसर दृश्यों का प्रतिनिधित्व करता है, जो ट्रांसजीन के सही प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    4. "कोर" अनुक्रम से देशी हेअरपिन दृश्यों को निकालें, प्रत्येक हेयरपिन के 5'और 3' सिरों पर 3-5 न्यूक्लिओटाइड के अपवाद के साथ, जो नए हेयरपिन के लिए एक स्वीकारकर्ता के रूप में काम करेगा।
  2. पसंद के कई miRNAs एन्कोडिंग एक नया transgene का निर्माण
    1. miRBase से transgene में overexpressed किया जा करने के लिए इरादा miRNAs के हेयरपिन दृश्यों प्राप्त करें। ध्यान से विशिष्ट न्यूक्लिओटाइड है कि माइक्रोप्रोसेसर दरार के स्थलों रहे हैं ध्यान से ध्यान दें.
    2. हटाए गए हेयरपिन को बदलें (चरण 2.1.4) चरण 2.2.1 में प्राप्त वांछित miRNAs के हेयरपिन दृश्यों के साथ.
    3. पसंद के वितरण सदिशों में subcloning की सुविधा के लिए transgene के दोनों flanking क्षेत्रों में वांछित प्रतिबंध दृश्यों जोड़ें. सत्यापित करें कि चुना प्रतिबंध अनुक्रम अनुक्रम में ही मौजूद नहीं हैं।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्रत्येक परिपक्व miRNA के प्राकृतिक 20-न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम को प्रतिस्थापित करने के लिए 20-न्यूक्लिओटाइड अनुक्रमों का उपयोग करें। https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence जैसे एक ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर इन तले हुए दृश्यों जनरेट करें।
  3. ट्रांसजीन की द्वि-आयामी संरचना का सत्यापन करना
    1. आरएनए संरचना भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर प्रोग्राम RNAweb गुना23में पूर्ण ट्रांसजेनिक अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएँ।
    2. मानक प्रोग्राम सेटिंग्स का उपयोग करके, आगे बढ़ेंक्लिक करें.
    3. चित्रमय उत्पादन का विश्लेषण करें, विशेष रूप से अच्छी तरह से परिभाषित hairpins की उपस्थिति और डबल-स्ट्रेंड स्टेम संरचनाओं की उपस्थिति के लिए कम से कम 11 न्यूक्लिओटाइड माइक्रोप्रोसेसर दरार साइट के निकट. साथ ही, हेयरपिन अनुक्रमों के भीतर शाखा बिंदुओं की अनुपस्थिति देखें (चित्र 4)।

3. डीएनए संश्लेषण द्वारा Transgenes प्राप्त करना

  1. डिजाइन और झंकार miRNA क्लस्टर के silico सत्यापन में के बाद, वाणिज्यिक विक्रेताओं से डीएनए संश्लेषण का उपयोग कर काम अनुक्रम प्राप्त24 और वेक्टर और ट्रांसजीन वितरण में डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग के साथ आगे बढ़ना. हमने इन विट्रो डिलीवरी10 और एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के लिए विवो इंट्राक्रैनियल डिलीवरी25के लिए मसूरीवायरल वेक्टर्स का उपयोग किया है।

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Representative Results

इस विधि की अनुमति दी तीन miRNAs के एक मॉड्यूल है कि लगातार मस्तिष्क ट्यूमर में downregulated रहे हैं की विशेषता है, जो सह न्यूरोनल भेदभाव के दौरान विशेष रूप से expressed रहे हैं (चित्र 1) और ट्यूमर अस्तित्व प्रतिक्रिया में शामिल के बाद चिकित्सा (चित्र 2)। यह एक जटिल oncogenic क्रोमैटिन दमनकारी मार्ग को विनियमित करने के द्वारा पूरा किया है. इस सह-अभिव्यक्ति पद्धति ने इन तीन मिर्नेस(चित्र 3)के बीच एक प्रबल सह-क्रिया-विज्ञानात्मक क्रिया का सुझाव दिया। नतीजतन, छोटे आकार और miRNAs के सरल जीवजनन का लाभ उठाते हुए, इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के लिए एक transgene डिजाइन किया गया था (चित्र 4) कि एक साथ ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में तीन miRNAs की अभिव्यक्ति recapitulate सकता है, दोनों इन विट्रो और विवो में, ट्यूमर जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण हस्तक्षेप और होनहार अनुवाद प्रयोज्यता के साथ (चित्र 5ए, बी, सी)10. इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया था कि ट्रांसजेनिक क्लस्टर स्तन कैंसर मॉडल में भी कार्यात्मक है(चित्र 5D,E)।

Figure 1
चित्र 1: ग्लियोब्लास्टोमा में एक कार्यात्मक miRNA मॉड्यूल की विशेषता. (क) ज्वालामुखी साजिश मानव ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों में अंतर व्यक्त miRNAs का प्रतिनिधित्व (एन जेड 516) बनाम सामान्य मस्तिष्क (एन जेड 10) टीसीजीए से प्राप्त. हरे रंग में 4 गुना अंतर के साथ miRNAs हैं. लाल वृत्त ग्लियोब्लास्टोमा में 10 सबसे अधिक कम विनियमित miRNAs का प्रतिनिधित्व करता है। (ख) तंत्रिका तने कोशिकाओं में विभिन्न विभेदन पथों को शामिल करने के दौरान (क) में चयनित 10 मिआरएन की सापेक्ष अभिव्यक्ति, तंत्रिका विभेदन को शामिल करने के दौरान मिआर-124, मिआर-128 और एम आई आर-137 मॉड्यूलों का स्पष्ट विनियमन दर्शाता है। मतलब - तीन जैविक प्रतिकृति से एसडी (* पी और lt; 0.05; **p और lt; 0.01; **p और lt; 0.001; * * * पी और lt; 0.0001; छात्र की टी-टेस्ट, दो पूंछ)। यह आंकड़ा संदर्भ10से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जीनोटॉक्सिक तनाव के दौरान miRNA मॉड्यूल के सह-अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि। कई ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और सेल लाइनों में चित्र 1 में परिभाषित तीन miRNAs के सापेक्ष अभिव्यक्ति (G62-mesenchymal; MGG4-प्रोनेरल; U251, U87 समर्थक तंत्रिका की तरह है, और T98G mesenchymal की तरह ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों) temozolomide के लिए प्रतिरोध के प्रेरण के बाद (टीएमजेड, गुलाबी सलाखों) या ionizing विकिरण (आरटी, हरी सलाखों). रिपोर्ट दो स्वतंत्र प्रतिकृति से एसडी के साथ मतलब है. यह आंकड़ा संदर्भ10से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सह-एक्सप्रेस्ड मिरानए के लक्ष्य के कार्यात्मक अभिसरण का विश्लेषण। Bioinformatics और विकासवादी जीनोमिक्स वेबसाइट से वेन आरेख उत्पादन, एक साथ MRNAs ब्याज की एक जाओ श्रेणी का गठन के साथ लेबल miRNAs के targetome पार (इस मामले में, क्रोमैटिन दमनकारी). एम आर एन ए को एकल मिरानए द्वारा विशिष्ट रूप से लक्षित किया गया था और आगे डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक अध्ययन के लिए चुना गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक इंजीनियर miRNA अनुक्रम के 2 डी संरचना तीन miRNAs क्लस्टर एन्कोडिंग. RNAweb गुना कार्यक्रम से ग्राफिकल उत्पादन. तीन अच्छी तरह से परिभाषित स्टेम पाश संरचनाओं जो प्रत्येक संबंधित miRNA के hairpins का प्रतिनिधित्व की उपस्थिति नोट (miR-124, miR-128, miR-137) transgene द्वारा इनकोडिंग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ट्रांसजीन प्रसंस्करण और इसके डाउनस्ट्रीम जैविक प्रभाव का साक्ष्य। (ए) ट्रांसजेनिक मिरना क्लस्टर (क्लस्टर 3) या नकारात्मक नियंत्रण (Ctrl) के साथ G34 ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मसूरारेअल-मध्यस्थ ट्रांसडक्शन के बाद miRNA अभिव्यक्ति के सापेक्ष परिमाणीकरण। रिपोर्ट किए गए तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है - एसडी (बी) जी 34 ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप चित्रों को नकारात्मक नियंत्रण ट्रांसजीन बनाम क्लस्टर 3 ट्रांसजीन व्यक्त करते हैं। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (सी) इंट्राक्रैनियल मानव जी 34 सेल एक्सोग्रैफ्ट्स के विवो विकास में या तो नियंत्रण या क्लस्टर 3 ट्रांसजेंस व्यक्त करता है। स्केल बार - 1 मिमी. यह आंकड़ाअनुमति 10के साथ पुनरुत्पादित किया गया है . (घ)एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के ट्रांसजेनिक मिरना क्लस्टर (क्लस्टर 3) या नकारात्मक नियंत्रण (Ctrl) के lentiviral-मध्यस्थ-मध्यस्थ transduction के बाद miRNA अभिव्यक्ति के सापेक्ष परिमाणीकरण। (ई) एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप छवियों नकारात्मक नियंत्रण ट्रांसजीन बनाम क्लस्टर 3 ट्रांसजीन व्यक्त। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. सभी प्रयोग ट्रिपीकेट्स (*p और lt; 0.05; *p और lt; 0.01; छात्र की टी-परीक्षण, दो पूंछ, कई तुलना). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: TargetScan वर्कफ़्लो| (एक)मुख पृष्ठ स्क्रीनशॉट, miRNA खोज के लिए चयन विकल्प दिखा. (बी)miR-137 के लिए प्रतिनिधि खोज परिणाम. लक्ष्य जीनों की सूची बाएँ स्तंभ में है। लाल बॉक्स संरक्षित लक्ष्यीकरण साइटों के साथ जीन को दर्शाता है (वास्तविक लक्ष्यीकरण के उच्च विश्वास का सुझाव). कृपया इस आंकड़े को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

अनुपूरक चित्र 2: ToppGene सुइट वर्कफ़्लो. (ए) मुख पृष्ठ स्क्रीनशॉट खोज बॉक्स दिखा जहां जीन की सूची का विश्लेषण किया जा करने के लिए डाला जाता है. (बी) miR-137 targetome के लिए प्रतिनिधि खोज परिणाम, सबसे सांख्यिकीय महत्वपूर्ण जीन आंटलजी (GO) श्रेणियों दिखा. कृपया इस आंकड़े को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यह प्रोटोकॉल इस धारणा पर आधारित है कि अलगाव में कार्य करने के बजाय, मिरानए समूहों में कार्य करके जैविक रूप से प्रासंगिक होते हैं, और ये समूह विशिष्ट सेलुलर संदर्भों26द्वारा प्रतिलेखनात्मक रूप से निर्धारित किए जाते हैं। एक अनुवाद के नजरिए से इस दृष्टिकोण का औचित्य साबित करने के लिए, एक अनुवर्ती प्रोटोकॉल है कि कोशिकाओं में इस बहु-miRNA पैटर्न के मनोरंजन की अनुमति देता है / यह miRNAs के अपेक्षाकृत सरल जीवजनन का लाभ लेने के द्वारा संभव है, जिससे माइक्रोप्रोसेसर द्वारा विशेषता miRNA हेयरपिन की मान्यता आवश्यक है और सही miRNA प्रसंस्करण27के लिए पर्याप्त है. एक ही समय में, इस न्यूनतम आवश्यकता वांछित miRNA मॉड्यूल की अभिव्यक्ति के लिए एक रीढ़ के रूप में स्वाभाविक रूप से होने वाली miRNA समूहों की आनुवंशिक पाड़ के उपयोग की अनुमति देता है, जो कम डीएनए दृश्यों कि किसी भी वितरण vectors में फिट किया जा सकता है के भीतर निहित हैं पसंद की. इस प्रोटोकॉल की प्रमुख आवश्यकता hairpin संरचना और स्टेम घटक की पर्याप्त लंबाई को बनाए रखने के लिए उचित दरार की अनुमति है.

इस प्रोटोकॉल के निष्पादन के संबंध में दो प्रमुख महत्वपूर्ण विचार हैं। पहली बात इष्टतम miRNA संयोजन का सही निर्धारण है. यह न केवल नियंत्रण की तुलना में कोशिकाओं या ऊतकों के miRNA अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के सावधान विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं प्रयोगात्मक हेरफेर कर रहे हैं के रूप में मनाया किसी भी एक साथ अभिव्यक्ति परिवर्तन की. एक बार miRNAs का एक सेट परिभाषित किया गया है, यह भी पता लगाने के लिए मौलिक है कि प्रत्येक singularly के कृत्रिम मॉडुलन दूसरों की अभिव्यक्ति को संशोधित नहीं करता है.

दूसरा महत्वपूर्ण पहलू कृत्रिम रूप से इस कार्यात्मक miRNA क्लस्टरिंग recapitulate करने के लिए झंकार अनुक्रम के निर्माण से संबंधित है। यह miRNA प्रसंस्करण मशीनरी की संरचनात्मक आवश्यकताओं का पालन करने के लिए मौलिक है, जो एक लंबे समय से पर्याप्त स्टेम अनुक्रम की उपस्थिति है (कम से कम 11 न्यूक्लियोटाइडों को मापने) प्रत्येक miRNA hairpin के मूल पर18, साथ ही मूल के रखरखाव देशी miRNA क्लस्टर पाड़ के अनुक्रम रिक्ति. हमारे अनुभव में, इन दो आवश्यकताओं को पूरा करने से लगातार उपयुक्त आरएनए तह(चित्र 4) प्राप्त हुआ है और इसके परिणामस्वरूप बहु-मिर्ना अभिव्यक्ति सफल हुई है।

इस तकनीक की प्रमुख सीमा miRNAs की सीमित संख्या है कि एक साथ एक कार्यात्मक transgene में संकुल किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक छह अलग miRNAs अप करने के लिए overexpressing दृश्यों इंजीनियर है, लेकिन hairpins की संख्या बढ़ जाती है के रूप में प्रसंस्करण दक्षता में कुछ कमी मनाया. अब तक miR-17-92 क्लस्टर की आनुवंशिक संरचना का इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि यह कम से कम डीएनए अनुक्रम के भीतर हेयरपिन (छह) की उच्चतम संख्या में एक एन्कोडिंग है ($800 आधार जोड़े)8. के रूप में वहाँ अन्य प्राकृतिक miRNA समूहों रहे हैं, यह अनुमान है कि वे भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 28. अंत में, यह देखा गया है कि हेयरपिन के बीच रिक्ति दृश्यों के संशोधन उनके प्रसंस्करण कम हो जाती है, तो वहाँ किस हद तक देशी संरचना को संशोधित किया जा सकता है के बारे में कुछ बाधाएं हैं.

इस प्रस्तावित विधि का सबसे महत्वपूर्ण और लाभप्रद पहलू यह है कि यह transgenes कि एक साथ कई वांछित miRNAs मुख्य रूप से एक silico दृष्टिकोण का उपयोग कर overexpress करने में सक्षम हैं की इंजीनियरिंग की अनुमति देता है, थकाऊ और के लिए की जरूरत सीमित समय लेने वाली आणविक क्लोनिंग कदम, जैसा कि पहले29,30,31वर्णित है. वर्णित प्रोटोकॉल निष्पादित करने के लिए आसान है और विशेष उपकरण या कौशल की आवश्यकता नहीं है।

आणविक जीव विज्ञान में miRNAs के मान्यता प्राप्त महत्व और चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उनकी क्षमता के विचार में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं की एक बड़ी दर्शकों के लिए ब्याज की है. इस दृष्टिकोण के लिए भविष्य के अध्ययन है कि miRNAs के combinatorial गुणों पर ध्यान केंद्रित प्रोत्साहित करने की उम्मीद है और उनके निष्पादन के लिए एक सरल और मजबूत उपकरण के रूप में काम करेंगे. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन संकुल transgenes जीन चिकित्सा वैक्टर के लिए आदर्श कार्गो का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक 3-miRNA क्लस्टर के vivo वितरण में सफल के सबूत पहले से ही एएवी वेक्टर (अप्रकाशित डेटा) के प्रत्यक्ष इंट्राट्यूमरल इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया है। इस प्रकार यह अनुमान लगाया गया है कि इस तकनीक से miRNA अनुसंधान के अनुवाद पहलुओं को काफी बढ़ावा मिलेगा।

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Disclosures

लेखकहित के कोई विरोध की रिपोर्ट.

Acknowledgments

लेखकों का समर्थन और रचनात्मक आलोचना के लिए हार्वे कुशिंग न्यूरो ऑन्कोलॉजी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को एनआईडीएस अनुदान K12NS80223 और K08NS101091 द्वारा पी.पी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5 mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

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References

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आनुवंशिकी अंक 152 miRNAs समूहों silico में जीन चिकित्सा synergism ग्लियोब्लास्टोमा
ग्लियोब्लास्टोमा में कार्यात्मक रूप से एसोसिएटेड miRNAs की विशेषता और जीन थेरेपी के लिए कृत्रिम क्लस्टर में उनकी इंजीनियरिंग
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Bhaskaran, V., Peruzzi, P.… More

Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

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