Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60275
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 2Independent Scholar

Summary

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

Abstract

חקר האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים הוביל לתגליות רבות, החל מantimicrobials הרומן ועד לתובנות בתחומי האקולוגיה. גישות רבות המשמשות לחקר אינטראקציות מיקרוביאלית דורשות ציוד מיוחד והינן יקרות ועתירות זמן. נייר זה מציג פרוטוקול לשיתוף פעולה עם תרבות שיתוף, כי הם זולים, מדרגיים למדגם מספרים גדולים, בקלות להתאמה לעיצובים ניסיוניים רבים. מיקרואורגניזמים הם מתורבתים יחד, עם כל המייצגים שילוב אחד זיווגים ומיקרואורגניזמים. אורגניזם מבחן הוא מתורבת בצד אחד של כל היטב מודבטים הראשון בתרבות מונוטוני. לאחר מכן, אורגניזמים היעד מחוסן בו על הצד הנגדי של כל באר באמצעות חותמת החיסון 3D-מודפס. לאחר שיתוף התרבות, השלימה הושלמה הבקיע עבור פנוטיפים חזותיים, כגון צמיחה או עיכוב. מספר זה יכול לשמש כדי לאשר פנוטיפים או לזהות דפוסים בין מבודד של עניין. באמצעות שיטה זו פשוטה ויעילה, משתמשים יכולים לנתח שילובים של מיקרואורגניזמים במהירות וביעילות. זו גישה שיתוף תרבות ישימה לגילוי אנטיביוטי, כמו גם מחקר מבוססי התרבות מיקרובידום והוחל כבר בהצלחה שני יישומים.

Introduction

בטבע, לעתים נדירות מיקרואורגניזמים קיימים בבידוד; כתוצאה מכך, הם מאינטראקציה ללא הרף עם אורגניזמים אחרים. לכן, לימוד כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים אחד עם השני הוא חיוני כדי להבין ריבוי של התנהגויות חיידקים1. אינטראקציות מיקרוביאלית יכולות להיות מדדיות, מיו, או אנטליסטית. אלה ב teractions יכול להשפיע לא רק את המיקרואורגניזמים עצמם אלא גם את הסביבות והמארחים כי המיקרואורגניזמים ליישב1,2.

מדענים רבים מחקר אינטראקציות מיקרוביאלית כדי לזהות מולקולות מיקרוביאלית חדש. אחד מולקולות קליניות מיקרוביאלית חשוב הראשון נמצא באמצעות המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית. סר אלכסנדר פלמינג הבחין מזהם Penicליום spp. בידוד כי עכבות את הצמיחה של זן סטייהילוקוקוס , אשר הוביל לגילוי של פניצילין אנטיביוטי נפוץ3. אפיון המנגנונים בהם משתמשים מיקרואורגניזמים כדי להרגיז את המתחרים שלהם נותר משאב פורה לגילוי מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, זה הוכח לאחרונה כי Streptomyces sp. מאמץ Mg1 מייצרת linearmycins אנטיביוטי, אשר יש פעילות lytic ו degradative נגד מקרתגו subtilis4.

יתר על כן, פפטיד לא מסונתז בעלי שם לוגדאנב התגלתה לאחרונה לאחר התצפית כי האף המולוקוקוס מעכב אתמחלת הקוקוס המכונה5. מחקרים הראו גם כי אינטראקציות מדדיות בין המיקרואורגניזמים הם באותה מידה חזקה כמו אינטראקציות עוינת לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, רבים פטריה-חקלאות נמלים בתוך השבט Attini חיידקים סימביוטי המכונה Pseudonocardia על השלד החיצוני שלהם שמייצר מולקולות פטריות כדי לעכב את הפתוגן מחייב של יבול פטרייתי שלהם6. כמו המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית כבר מועיל לגילוי מולקולות מיקרוביאלית, השימוש במסכים תפוקה גבוהה עלול לגרום לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית חדשים.

ביחס לעלות ולקלות הביצועים, המתודולוגיות המשמשות לחקר האינטראקציות של מיקרוביאלית נעות בין פשוטה למורכבת. למשל, שיטת התקע אגר היא שיטה זולה ופשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את האנטניזם בין מיקרואורגניזמים מרובים7. עם זאת, שיטת התקע של אגר אינה הליך יעיל והיא יכולה להיות אינטנסיבית לעבודה עבור שילובים רבים של זיווגים. כדי להעריך את ההשפעות של מוצרים מתוצרת microbially על מבודד היעד של עניין באופן תפוקה גבוהה, מעבדות רבות להשתמש הדיסק דיפוזיה בחני8. שמות אלה הם קלים וזולים יכול להיות מדרגי למספר גבוה יותר של דגימות7. עם זאת, מעשה זה דורש את הדור של תמציות מיקרוביאלית ועשוי לייצר תוצאות מטעה עבור צירופים מסוימים של אורגניזמים ואנטיביוטיקה היעד, כגון סלמונלה ו צפלוספורנס9.

הגישות הקודמות מסתמכות על רכיבים מבודדים כדי לעורר תגובה באורגניזם מטרה, במקום לאפשר למיקרואורגניזמים לקיים אינטראקציה זה עם זה. זה של הערה משום שאינטראקציות בין חיידקים עשוי לעורר את הייצור של מולקולות מיקרוביאלית של "סודי" שאינם מיוצרים בתרבית. למשל, זה הוכח לאחרונה כי keyicin מיקרוביאלית מופק רק על ידי מיקרוונוספורמטר sp. כאשר משותף לתרבות עם מעלה sp. כי הוא מבודד מיקרובידום ספוג אותו10. מתודולוגיות אינטרקציה מורכבות יותר מאפשרות לעקוף את העיכוב הפוטנציאלי בתרבות המונאלית. למשל, ה-iChip שימושי לבידוד נדיר וקשה לטיפוח חיידקים מדגימות סביבתיות ומאפשר התבוננות באינטראקציות מיקרוביאלית באמצעות צמיחה באתרו11. כדי לחקור את האינטראקציות בפרוטרוט, מטריקס סייעה להשתמש בהדמיית לייזר להדמיה בזמן של טיסת הדמיה של המסה ספקטרומטריה (MALDI-תוף-IMS). גישה זו מספקת מידע מפורט על הרכב והפצה של מולקולות קטנות פפטידים המיוצר על ידי אינטראקציה מושבות מיקרוביאלית עם רזולוציה מרחבית גבוהה. Maldi-תוף-IMS שימש גם במחקרים מרובים של אינטראקציות חיידקי כדי לאפיין את מנגנוני התחרות12,13,14,15. עם זאת, MALDI-תוף-IMS לעתים קרובות דורש הכנה לדוגמה מפרך, מומחיות מיוחדת כדי להפעיל את הציוד, ואת יקר ומיוחדות ספקטרומטר מסה. מסיבות אלה, זוהי טכניקה קשה לשימוש עבור לימודי תפוקה גבוהה. לפיכך, שיטת שיתוף תרבות פשוטה, מדרגית ובעלת תפוקה גבוהה עבור אינטראקציות מיקרוביאלית הגוברת על מגבלות רבות של הגישות הנ ל יהיו מועילות.

כאן מוצג פרוטוקול לתרבות מיקרוביאלית של תפוקה גבוהה. מעשה זה פשוט ומשולב בקלות למחקרים קיימים של אינטראקציות מיקרוביאלית. בניגוד לשיטות רבות בשימוש נפוץ לחקר האינטראקציות של חיידקים, השיטה שלנו היא פשוטה, זולה, והיא קלה לחקירת מספר רב של אינטראקציות. מספר זה לא רק קל לביצוע, אבל החומרים זמינים באופן נרחב מרוב ספקי המעבדה או משאבים ציבוריים (למשל, ספריות, makerspaces). כתוצאה מכך, שיטת החקירה הזאת היא יתרון כשורה ראשונה לזיהוי וניתוח דפוסים מעניינים בקרב שילובי זיווגים רבים של מיקרואורגניזמים, שעשויים להועיל במיוחד לחקירת האקולוגיה של מיקרוביאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הסכמה מושכלת הושגה מהוריו של התורם, וועדת האדם באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון אישרה את המחקר (לוח סקירה מוסדי [IRB] אישור מספר H-2013-1044).

1. דוגמא לתרבות

הערה: הליך זה משמש כאן לחקר האינטראקציות בין חיידקים מבודד מחלל האף האנושי. בעיקרון, השיטות הבאות ישימות על כל תנאי תרבות. המוח לב-ציר אינפוזיה (BHI) משמש עבור התפשטות כללית של חיידקים האף. כל הצלחות מתמצנות באמצעות 1.5% אגר. עבור מחקר זה, דגימות נלקחים מתמיסה מלוחים לתוך האף של תורם (שאיפה האף), הועבר לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ו קפוא ב-80 ° c.

  1. השתמש בטכניקות התרבות הסטנדרטיות לצלחת 100 μL של כל אחד מדגימות השטיפה המופשנות על צלחות BHI.
  2. מודטה את הצלחות aerobically ב 37 ° c עבור שבוע אחד.
  3. לאחר הדגירה, בחר ≥ 2 מושבות של כל מורפולטיפ שונים לוחית ומעבר את מבודד aerobically על לוחות BHI על ידי הליכה המושבה מן הצלחת הראשונית אל הצלחת BHI חדש ו מודקת את הצלחת ב 37 ° c. . אני חוזר עד שתרביות החיידקים טהורות
    הערה: מבודד חיידקי ניתן לזהות באמצעות מורפולוגיה המושבה, גראם כתמים, רצף הגנים rRNA של 16, או שיטה אחרת. עם זאת, הידיעה שזהותו של הבודד אינה נחוצה להמשך הפרוטוקול.
  4. הקפאה מבודדת את כל החיידקים ב-80 ° c לאחר שילוב של 1 מ ל של 50% גליצרול עם 1 מ ל של תרבות לילה חיידקית (ראה סעיף 3) ב קריוצינוריות.

2. חותמות הדפסה תלת-ממדית

הערה: פוליקרבונט נבחר כחומר הטבעה בשל טמפרטורת מעבר זכוכית גבוהה (147 ° c) החורג מטמפרטורות האוטוקלב הסטנדרטיות (121 ° c), אשר ממזער את הפוטנציאל לדפורמציה לאחר שימושים חוזרים.

  1. העמיסו את המדפסת התלת-ממדית בחוט פוליקרבונט.
  2. החלת דבק בבית הספר הלבן (אצטט פוליוויניל) אל מיטת ההדפסה כדי לסייע הדבקה ולמזער את העיוות של חותמת החיסון במהלך ההדפסה.
  3. . העמיסו את המטען קובץ מודל STL (קובץ נתונים משלים) עבור חותמת החיסון (איור 1) לתוכנת המדפסת התלת-ממדית.
  4. הדפס את חותמת החיסון בטמפרטורה 290 מעלות צלזיוס, 60 בטמפרטורת מיטה של ° c וגובה שכבה של 0.38 מ"מ.
  5. לעטוף את החותמת ברדיד אלומיניום ולעקר על ידי אוטוקלינג עבור 1.5 h על מחזור כבידה עם 15 דקות של ייבוש.
    הערה: למרות פוליקרבונט הוא hygroscopic, החותמות רק לשמור כ 0.5% משקל המים לאחר autoclaving ינג.

3. הכנת תרביות לילה

  1. שימוש בצנרת סרוולוגית, פיפטה 3 מ ל של ציר BHI סטרילי ל -14 שפופרות של תרבות mL.
  2. באמצעות לולאה מעוקר 1 μL, האיחסן מושבה חיידקית לתוך המרק. מערבולת את הלולאה כדי להבטיח את הגוש מפזר לתוך המרק. מערבולת התרבות צינורות זמן קצר לפני הדגירה.
  3. מודטה את צינורות התרבות ב 37 ° c לילה (~ 16 שעות) על שייקר ב 250 סל ד.
  4. מערבולת לשבור את הגושים של תאים לאחר התרבויות חיידקי להגיע מספיק עכירות (OD600 ≥ 1).

4. הכנת לוחיות ביושיטת הרכב

הערה: לוחיות הרישוי מוכנות במכסה של זרימה שכבתית כדי לשמור על עקרות.

  1. הכן מדיה BHI עם 1.5% אגר ולעקר על ידי אוטוקלינג על פי הוראות היצרן.
  2. לאחר האוטוקלינג, צנן את מדיית BHI ל-55 ° c באמבט מים מבוקר טמפרטורה.
  3. שימוש בצנרת סרוולוגית, פיפטה 3 מ ל של מדיית BHI מותכת לתוך כל 12 הבארות בצלחת 12. ודא כי הבארות הן מדויקות ואפילו ככל האפשר. ליטר אחד של מדיה תניב ~ 27 לוחיות ביוטכנולוגיה.
  4. . הניחו לאגר לקבוע לילה

5. לאחר לוחיות בדיקת האורגניזם

הערה: אורגניזם מבחן מתייחס לאורגניזם שעבורו הייצור של פעילות העכבות (למשל, ייצור אנטיביוטי) נקבע באמצעות שיטת האינטראקציה בין תרבות שותפה. בשביל הניסוי הזה, האורגניזמים האלה הם. אקאובקטריה מבודדים מדגימות האף

  1. החדרת האורגניזם לבדיקה על צלחת ביולוגית על-ידי הכנסת לולאה מנומנת של 10 μL לתוך התרבות של הלילה ומליטה על ה-droplet של התרבות מעל השליש השמאלי של צלחת היטב.
    הערה: מומלץ לרצף רק שליש מבאר, מאחר שגידול יתר של הבאר אוסר מאוחר יותר על אורגניזמים המטרה.
  2. אני חוזר עד שכל 12 הבארות על. הלוחית חוסנו עם אורגניזם הניסוי
  3. לוחיות הזיהוי הפוכות בטמפרטורה. המתאימה במשך 7 ימים בטמפרטורות גבוהות יותר (≥ 37 ° c) או באקלים יבש, מאחסנים את הצלחות במיכל לח כדי למנוע מהלוחות להתייבש.

6. הכנת אורגניזמים היעד

הערה: אורגניזם מטרה מתייחס לאורגניזם שמצב העיכוב שלהם נקבע באמצעות שיטת האינטראקציה בין התרבויות. בשביל הניסוי הזה, האורגניזמים המטרה הם. הבודדים מדגימות האף

  1. לאחר הדגירה של לוחות ביולוגי 6 ימים, להכין תרבויות לילה של אורגניזמים היעד שצוין, כפי שנעשה לעיל (ראה סעיף 3).

7. אורגניזם היעד החיסון

הערה: לאחר הדגירה הלילה, להבטיח כי התרבויות הם נחל דלוח (OD600 ≥ 1). כמה תרבויות בקטריאלי עלולות להיות. מואחרות בתחתית הצינורית התרבותית מערבולת התרבות צינורות לפזר גושים ולהעריך את העכירות תרבות.

  1. להכין את לוחית היעד על ידי מילוי כל טוב של ריקה 12 היטב צלחת עם 1.8 mL של BHI ו 200 μL של תרבות לילה היעד.
  2. לפתוח ולהציב חותמת חיסון. סטרילית בלוחית היעד מסובב בעדינות את התרבויות סביב הבארות, מטפל כדי להבטיח כי התרבויות לא לחצות מזהם בארות השכנות.
  3. הרם את חותמת החיסון וודא שקיימת droplet של תרבות יעד מדוללת על כל קצה של חותמת.
  4. הכינו לוחית שליטה מונונובית על ידי הצבת חותמת החיסון על צלחת ביולוגית בלתי מחוסנת והסלע העדין של הבול כך שירידה בתרבות מבטאת כל היטב. לאחר הסרת חותמת החיסון, יש לראות droplet של תרבות בבארות של לוחית העיבוד הביולוגית.
    1. אם בארות כלשהן אינן מחוסנו עם חותמת החיסון עקב רמות מחוספס של מדיה, ספוט 3 μL של תרבות לילה מדולל על הצד הימני של הבארות באמצעות פיפטה.
  5. החזר את הלוחות הביותוניים כפי שנעשה לעיל (ראה step 7.4.1), אך יישר את החותמת כך שהעצות יתיישרו עם הצד הימני של 12 הלוחות היטב. ודא שהחותמת אינה מפנה אל המושבה החיידקית הקיימת כאשר היא מקיימת את הבארות.
  6. הסר בזהירות את החותמת והמקום חזרה לצלחת היעד.
  7. חזור על החיסונים עבור כל צלחת ביולוגית עד שכל הצלחות מחוסנו.
  8. לוחיות הרישוי של הבית מודגרות בטמפרטורה המתאימה למשך 7 ימים.

8. ניקוד

  1. לאחר שיתוף הבדיקה והיעד של אורגניזמים במשך שבוע אחד, ציון האינטראקציות המבוססות על ההערכה החזותית הבאה:
    1. ציון הבארות עם צמיחת האורגניזם היעד המוצגים צמיחה שאינה מאפשרת להבחין בין שליטה מונותרבותית כ-"0" (ללא עיכוב) (איור 2א, ב).
    2. ציון הבארות עם אורגניזם היעד המוצגים צמיחה מופחתת לעומת השליטה כ "1" (עיכוב חלש) (איור 2ג).
    3. ציון בארות שבו אורגניזם היעד לא לגדול כמו "2" (עיכוב חזק) (איור 2ד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האינטראקציה בין שיתוף התרבות יכולה לשמש כדי להבין את האינטראקציות של מיקרוביאלית, לזהות דפוסי עניין ולחשוף מיקרוביאלית באמצעות פעילויות מעניינות. באלה מספר, אורגניזם מבחן הוא מונותרבותי בצד אחד של 12 צלחת אגר היטב ומודונבטים במשך 7 ימים. לאחר מכן, אורגניזם היעד הוא הבחין ליד האורגניזם במבחן ושני חיידקים היו שיתוף תרבותי עבור 7 ימים לפני הבקיע את הצמיחה של האורגניזם היעד. The מספר הם הבקיע מבוסס על ניתוח חזותי של הצמיחה או עיכוב של אורגניזם היעד.

אלה שיתוף התרבות המשותף השתמשו לאחרונה כדי להעריך את פעילות העכבות של אקאובקטריה (אורגניזמים בדיקה) לכיוון החיידק של סטייהולוקוקוס . (אורגניזמים היעד) מבודדים מחלל האף האנושי (איור 2)16. שיתוף התרבות המשותף שימשו כדי לזהות דפוסי עכבות ספציפיים בין האקאובקטריה (n = 21) ו סטייהילוקוקוס מבודד (n = 39) והראה כי האקאובקטריה הראתה וריאציה ביכולתם לעכב את הקואגוקלז-שלילי . בסדר. סך של 812 שילובים של זיווגים. בפרט, corynebacterium propinquum מאוד מעכבות חסרונות (איור 2ד), במיוחד לעומת corynebacterium אחרים כי החסרונות מעכבות חלש (איור 2ג) או לא היתה השפעה על חסרונות ( איור 2ב'), ובהשוואה לבקרת המונוקולטורה (איור 2א)16.

באמצעות גנומיקה השוואתית, אשכול גנים biosynthetic עבור ייצור siderophore זוהה ב C. propinquum גנום כי היה נעדר הגנום של corynebacterium אחרים מבודד16. Siderophores הם כירונים המיוצר על ידי מיקרואורגניזמים לניקוי ברזל מהסביבה17. הפקה של סידרפור על ידי C. propinquum אושרה והסידרפור זוהה כdehydroxynocardamine16. תוצאה זו הובילה את ההשערה כי עיכוב של החסרונות היה בשל המחסור בברזל בתיווך sideropפפור. לאחר מכן, על-ידי ביצוע אינטראקציה עם תרבות שיתוף בין C. propinquum ו החסרונות הן סטנדרטי ברזל בתוספת bhi בינונית, זה היה נחוש ביותר פנוטיפ עיכוב היה תלוי ברזל (איור 2E). יחד, תוצאות אלה הראו כי siderophore בתיווך מחסור ברזל היה אחראי על עיכוב חזק של חסרונות על ידי C. propinquum16.

Figure 1
איור 1: צילום של חותמת הביושיטת החיסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיתוף הפעולה של התרבות המשותף לחשוף את siderophore-בתיווך עיכוב של החסרונות על ידי הידברות propinquum. (א) מונותרבות של חסרונות (אורגניזם היעד) מחוסן על צלחת bhi שיטת ביוטכנולוגיה. (ב, ג, ד) שיתוף תרבויות בין זנים שונים של Corynebacterium spp. (אורגניזמים מבחן, שמאל) ואת אותו זן של חסרונות (היעד אורגניזם, ימין) מחוסן על לוחיות ביוטכנולוגיה bhi. כל פאנל הוא תמונה ייצוגית המציגה אינטראקציות עם (ב) ללא עיכוב (ציון = 0), (ג) עיכוב חלש (ציון = 1), או (ד) עיכוב חזק (ציון = 2). (ה) השוואה בין אינטראקציות בין corynebacterium pseudodiphtheriticum (siderophore לא המפיק) או corynebacterium propinquum (המפיק siderophore) עם אותו זן של חסרונות ב bhi מדיה (bhi) ו bhi מדיה בתוספת עם 200 μMשלוש (bhi + ברזל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ נתונים משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנטיביוטיקה ומטבוליטים משניים אחרים הבתווך אינטראקציות מיקרוביאלית שימושיות עבור שפע של יישומים, כולל גילוי סמים. במסמך זה, פרוטוקול לשיתוף התרבות המשותף מציג להערכת מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאלית. אלה שיתוף התרבות ההדדית האינטראקציה היא פשוטה, סבירים, מדרגי, תפוקה גבוהה פירושו לחקור שילובים זוגות רבים של מיקרואורגניזמים במקביל. אורגניזמים היעד הם זיהו ליד בדיקת אורגניזמים בבאר של 12 צלחת הבאר באמצעות חותמת חיסון, ועיכוב של אורגניזמים היעד הוא הבקיע מבוסס על בדיקה חזותית של האורגניזם היעד של היצור. רוב החומרים הנמצאים בשימוש אלה זמינים בקלות באמצעות רוב ספקי המעבדה או באמצעות משאבים ציבוריים. לכן ניתן להתאים בקלות לסביבות מעבדה רבות. במעבדה, בחני שיתוף התרבות האלה הצליחו לחקור את האינטראקציות של מיקרואורגניזמים הקשורים מארחים רבים ממגוון רחב של סביבות.

בעוד יש יתרונות רבים לטכניקה זו, יש גם כמה הגבלות. המגבלה הבולטת הראשונה היא שדפוסים מתוך מספר התרבות המשותף קשים לפענוח ללא מטא-נתונים אחרים. בשני המסמכים האחרונים שהעסיקו את התרבות המשותף הזאת, מספר16,18, דפוסי הריבית זוהו רק בשילוב עם מטה-נתונים אחרים, כגון הזהות המעובדת של אורגניזמים הניסוי. אף על פי כן, גם ללא המטא-נתונים הנלווים, השיטות המפורטות בנייר זה הן מדויקות לזיהוי מבודד חיידקי עם פעילות מעכבות כלפי פתוגנים ספציפיים או חיידקים מטרה של עניין.

מגבלה נוספת היא שאלה שאינם זמינים מבחינה מסחרית, והלוחות הביותוניים חייבים להיות מוכנים ידנית, שיכולים להגביל את יעילות התשובה. הכנת הלוחות היא קריטית לניסוי, והטיפול צריך להילקח תוך כדי הכנת הצלחות. אם הבארות לא שווים, ייתכן שחותמת. החיסון לא תוכל לחסן את כל הבארות עם זאת, בארות החמיץ יכול פשוט להיות מחוסן על ידי ליטוף ישירות את התרבות אורגניזם היעד אל הצד הימני של כל באר לא מחוסנת. אכן, גם אם כמה בארות על כל צלחת מחמיץ על ידי חותמת, ההליך הוא עדיין יעיל יותר מאשר באופן ישיר ללטף את האורגניזם היעד לתוך כל באר אחת. לחילופין, משתמשים יכולים לוותר על חותמת החיסון והפיפטה של אורגניזם היעד, אך תהליך זה ארוך יותר, במיוחד לעומת הטבעת 12 בארות בו.

בסופו של דבר, האורגניזם מבחן עשוי לצרוך את החומרים המזינים הזמינים בבאר במהלך התרבות מונוחד לפני האורגניזם היעד מחוסן. למרות מחסור תזונתי עלול להשפיע על דפוסי עיכוב נצפתה, זה נראה נדיר בין שילובים זיווגים כי נבדקו עד כה. בעיקר, דלדול של ברזל בבארות על ידי C. propinquum מותר לגילוי של siderophore תחרות תיווך מחברי האף האנושי microbiota16.

אלה שיתוף התרבות אינטראקציה הניתנים להתאמה אישית על ידי שינוי הרכב המדיה, עיתוי, או אפילו כולל אורגניזמים מרובים או חיידקים קונסורציומים כמו אורגניזם הבדיקה. יתרה מזאת, ניתן להשתמש במערכות הבקיע שונות בהתאם לרמת הפירוט הרצויה הדרושה כדי לתאר את פנוטיפים לאינטראקציה. דוגמאות סולמות הבקיע כוללים אלה מ 0-2 השתמשו כדי לתאר אינטראקציות תחרותי בין חיידקים מבודדים של האף האנושי האדם16 (איור 2) ו 0-3 משמש להערכת פוטנציאל מיקרוביאלית של Streptomyces מבודדים ממיקרוביזה של חרק18. עם זאת, עם קשקשים יותר מאוזנת, הניקוד הופך קשה יותר ויותר. לפיכך, העיכוב הוא מזוהה בקלות ביותר באמצעות מערכת הבקיע בינארי (למשל, 0 מוגדר ללא עיכוב ו 1 כעיכוב), אשר יכול לחסל כל בלבול ולתקנן הבקיע על פני אנשים מרובים. יתר על כן, בנוסף על הניקוד עבור פנוטיפים עיכוב, אלה מאמר יכול להיות גם הבקיע עבור פנוטיפים אחרים, כולל הפקת פיגמנט, ספורטולציות, או כל פנוטיפ אחר כי ניתן להעריך ויזואלית. כפי שניתן לאמר אלה הם מדרגיים מאוד עם ניתוח מבוסס על בדיקה חזותית של האורגניזם היעד, ערכות הדרכה עבור אלגוריתמים למידה של מחשב יכול להיווצר כדי להקל על הניקוד ולהגדיל עוד יותר את התפוקה.

החוזק העיקרי של שיתוף התרבות האלה הוא היכולת שלהם להקל על הקרנת שילובים רבים של אינטראקציות זיווגים ובמהירות בזול כדי לחשוף פעילויות או מעכבות דפוסי עניין. לאחר מכן, שיטות מורכבות ואינטנסיביות יותר (כלומר, אפיון גנומי, מאלדי-תוף-IMS, או בידוד ואפיון טבעי של מוצר) עשויים לשמש לאפיון עמוק יותר של החיידקים והאינטראקציות של הריבית המזוהה על-ידי שיתוף התרבות המשותף. כדוגמה לאחרונה, אלה שיתוף התרבות עיכוב בחני שימשו כדי להראות כי Streptomyces חרקים נגזר יכול לעכב חיידקים גראם שליליים ופטריות יותר טוב מאשר הקרקע שלהם נגזר עמיתיהם. עיכוב בחני אפשר הדמיה מהירה ויעילה של דפוסי עכבות בקרב 2,003 Streptomyces בודד והוביל לגילוי של פטריות חדש בשם cyphomycin, אשר פעיל נגד פתוגנים תרופה עמידים בפני תרופות 18. לפיכך, האינטראקציה הזאת עם התרבות המשותף היא כלי רב עוצמה עבור מחקר microbiome, גילוי מיקרוביאלית, וצובר תובנות עמוקות יותר לדפוסים של אינטראקציות מיקרוביאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לדניאל מאי, מארק שירט ודון ואנג על הקריאה הקריטית של כתב היד. עבודה זו, כולל המאמצים של קמרון R. קורי, נתמכת על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, משרד סגן הקנצלר למחקר ובוגר השכלה עם מימון של הקרן למחקר ויסקונסין בוגרים, מימון שסופק גם על ידי ה המכונים הלאומיים למרכזי בריאות למצוינות במחקר טרנסלtional (U19-AI109673-01). ריד מ. סטובננק נתמך על ידי הספרייה הלאומית של מענק הכשרת הרפואה למחשוב ולאינפורמטיקה בתוכנית ההכשרה לביולוגיה ולרפואה (NLM 5T15LM007359). לתורמים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, באיסוף הנתונים ובפרשנות, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue VWR 12000-806
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow VWR 12000-810
12-well cell culture plate, sterile with lid Greiner bio-one 665 180
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile Falcon 352057
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile USA scientific 1420-9710
25 mL serological pipet Cell Treat 229225B
Agar, bacteriological VWR J637
Brain Heart Infusion Broth Dot Scientific DSB11000-5000
Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter Keene Village Plastics 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
School Glue Elmer's EPIE304
Taz 6 3D printer Lulzbot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
  2. Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
  3. Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
  4. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
  5. Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
  6. Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
  7. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  8. Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
  10. Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
  11. Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  12. Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
  13. Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
  14. Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
  15. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
  16. Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
  17. Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
  18. Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 152 אנטיביוטיקה antimicrobials שיתוף תרבות עיכוב assays אינטראקציות מיקרוביאלית המסך פנוטימית
התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Temkin, M. I., Carlson, C. M.,… More

Temkin, M. I., Carlson, C. M., Stubbendieck, A. L., Currie, C. R., Stubbendieck, R. M. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (152), e60275, doi:10.3791/60275 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter