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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

माउस किडनी में स्थापित मेटास्टैटिक क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा मॉडल की तुलना और चिकन कोरियोलंटोइक झिल्ली पर

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60314
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 1, 1,8
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

मेटास्टैटिक क्लियर सेल रीनल सेल कार्सिनोमा पूरी तरह से प्रीक्लीनिकल जांच के लिए एक व्यापक पशु मॉडल के बिना एक बीमारी है। यह प्रोटोकॉल रोग के लिए दो उपन्यास पशु मॉडल दिखाता है: ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित माउस मॉडल और चिकन कोरियोलेंटोइक झिल्ली मॉडल, दोनों नैदानिक मामलों जैसी फेफड़ों के मेटास्टेसिस का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

मेटास्टैटिक क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा (सीसीआरसीसी) किडनी कैंसर का सबसे आम सबटाइप है। स्थानीयकृत सीसीआरसीसी का अनुकूल शल्य चिकित्सा परिणाम है। हालांकि, सीसीआरसीसी के एक तिहाई मरीज फेफड़ों के मेटाटैस विकसित करेंगे, जो मरीजों के लिए बहुत खराब परिणाम से संबंधित है । दुर्भाग्य से, इस घातक चरण के लिए कोई चिकित्सा उपलब्ध नहीं है, क्योंकि मेटाटैसिस का आणविक तंत्र अज्ञात रहता है। यह 25 साल से जाना जाता रहा है कि वॉन हिपपेल-लिंडाऊ (वीएचएल) ट्यूमर दमनकारी जीन के फंक्शन का नुकसान सीसीआरसीसी का रोगोग्नि है । हालांकि, सीसीआरसीसी का कोई चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए दो नए स्थापित पशु मॉडलों को पेश करना और तुलना करना है। माउस मॉडल में पहला गुर्दे प्रत्यारोपण है। हमारी प्रयोगशाला में, CRISPR जीन संपादन प्रणाली का उपयोग कई आरसीसी सेल लाइनों में वीएचएल जीन को खटखटाने के लिए किया गया था। गुर्दे कैप्सूल के लिए विषम सीसीआरसी आबादी के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण ने उपन्यास सीसीआरसीसी मॉडल बनाए जो इम्यूनोसक्षम चूहों में मजबूत फेफड़ों के मेटास्टेस विकसित करते हैं। दूसरा मॉडल चिकन कोरियोएलनोइक झिल्ली (कैम) सिस्टम है। माउस मॉडल की तुलना में, यह मॉडल अधिक समय, श्रम और लागत-कुशल है। इस मॉडल ने मजबूत ट्यूमर गठन और इंट्राविटेशन का भी समर्थन किया। कैम में ट्यूमर के विकास की कम 10 दिन की अवधि के कारण, एकत्र भ्रूण ऊतकों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा कोई भी अनाप-शनाप मेटास्टेमिस नहीं देखा गया । हालांकि, जब ट्यूमर के विकास को रची चिकन में दो सप्ताह तक बढ़ाया गया था, माइक्रोमेटास्टैटिक सीसीआरसीसी घावों को आईएचसी द्वारा फेफड़ों में देखा गया था। ये दो उपन्यास प्रीक्लिनिकल मॉडल मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए उपन्यास उपचार के विकास की ओर नए, रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) स्थापित करने के लिए मेटास्टेटिक सीसीआरसीसी के पीछे आणविक तंत्र का अध्ययन करने के साथ-साथ उपयोगी होंगे।

Introduction

गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) संयुक्त राज्य अमेरिका में 7सबसे आम कैंसर है। सालाना, ७४,००० अमेरिकियों को नए निदान होने का अनुमान है, १४,००० से अधिक मौतों के लिए लेखांकन (स्पष्ट सेल हिस्टोलॉजिकल उपप्रकार, या सीसीआरसी, सबसे आम उपप्रकार है, आरसीसी मामलों के लगभग ८०% के लिए लेखांकन । स्थानीयकृत द्रोह वाले रोगियों का इलाज नेफ्रोक्टॉमी से किया जाता है और 73% 1 की अनुकूल 5 साल की जीवित रहने की दरहोतीहै। हालांकि, 25%-30% रोगी फेफड़ों जैसे महत्वपूर्ण अंगों के लिए दूर मेटास्टेटेस विकसित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 13 महीने का खराब मतलब जीवित होता है और केवल 11%1,2,3की 5 साल की जीवित रहने की दर होती है। मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के लिए घातक परिणाम में सुधार करने के लिए मेटास्टैटिक तंत्र की और समझ की आवश्यकता है।

वीएचएल ट्यूमर दबाने वाले जीन का नुकसान मानव सीसीआरसीसी के अधिकांश मामलों4,5,6,7में एक बानगी आनुवंशिक घाव है . हालांकि, सीसीआरसीसी में वीएचएल हानि का सटीक ऑनकोजेनिक तंत्र अज्ञात है। इसके अलावा, वीएचएल अभिव्यक्ति की स्थिति सीसीआरसीसी8में परिणाम की भविष्य कहनेवाला नहीं है । विशेष रूप से, गुर्दे-एपिथेलियल-लक्षित वीएचएल नॉकआउट में कई प्रयासों के बावजूद, वैज्ञानिक9चूहों में देखे गए प्रीनियोप्लास्टिक सिस्टिक घावों से परे गुर्दे की असामान्यता उत्पन्न करने में विफल रहे हैं, यहां तक कि जब PTEN और p5310जैसे अन्य ट्यूमर दबाने वालों को हटाने के साथ संयुक्त किया गया है। ये निष्कर्ष इस विचार का समर्थन करते हैं कि अकेले वीएचएल हानि ट्यूमरिजनया बाद के सहज मेटास्टासिस के लिए अपर्याप्त है।

हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ने एक नई वीएचएल नॉकआउट (VHL-KO) सेल लाइन बनाई, जिसमें मुरीन वीएचएल + सीसीआरसीसी सेल लाइन (RENCA, या VHL-WT)11,12में वीएचएल जीन के CRISPR/Cas9 मध्यस्थता हटाने का उपयोग किया गया । हमने दिखाया कि वीएचएल-को न केवल मेसेनचिमल है, बल्कि वीएचएल-डब्ल्यूटी कोशिकाओं12के मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) के लिए विशेषण को भी बढ़ावा देता है। ईएमटी को मेटास्टैटिक प्रक्रिया13में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । हमारे काम से आगे पता चला है कि दूर फेफड़ों मेटास्टासिस केवल सह के साथ होता है VHL-KO और VHL-WT कोशिकाओं के गुर्दे में प्रत्यारोपण, मेटास्टासिस के एक सहकारी तंत्र का समर्थन । महत्वपूर्ण बात, हमारे ऑर्थोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित वीएचएल-KO और वीएचएल-डब्ल्यूटी मॉडल मजबूत फेफड़ों के मेटास्टेज़ की ओर जाता है, जो नैदानिक सीसीआरसीसी मामलों को फिर से तैयार करता है। यह सहज मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी मॉडल ट्रांसजेनिक मेटास्टैटिक माउस मॉडल की कमी की भरपाई करता है, खासकर उपन्यास एंटी-मेटास्टैसिस दवाओं के विकास में। यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक इंजीनियर RENCA कोशिकाओं की विषम कोशिका आबादी के गुर्दे कैप्सूल प्रत्यारोपण को दर्शाता है ।

चिकन कैम मॉडल ों का उनके कई फायदों के कारण एंजियोजेनेसिस और ट्यूमर बायोलॉजी के लिए शोध में एक लंबा इतिहास रहा है, जैसा कि तालिका14,15,16,17,18में संक्षेप में किया गया है। संक्षेप में, कैम ट्यूमर के विकास के लिए समय खिड़की कम है, जब तक कैम चिकन16के हैचिंग पर नष्ट हो जाता है 11 दिनों की एक अधिकतम अनुमति । कम विकास के समय के बावजूद, चिकन भ्रूण की समृद्ध पोषण आपूर्ति और इम्यूनोडिफिजेंट स्थिति बहुत कुशल ट्यूमर एनग्राफमेंट16,19,20,21को सक्षम करती है। अंत में, प्रत्येक निषेचित अंडे की लागत ~ $ 1 है, एक SCID माउस के लिए $ 100 से अधिक की तुलना में। साथ में, कैम मॉडल माउस की तुलना में समय और लागत में एक महान बचत पर नए PDXs की स्थापना में एक मूल्यवान वैकल्पिक पशु मॉडल के रूप में काम कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने आकलन किया कि क्या मॉडल माउस ऑर्थोटोपिक मॉडल में मनाए गए मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी के जीव विज्ञान को फिर से तैयार करने में सक्षम था।

(एससीआईडी) माउस कैम नोट
लागत 100 डॉलर प्रत्येक ~ $ 1 प्रत्येक 50-75% से लेकर व्यवहार्यता
बैरियर आवास की आवश्यकता हाँ नहीं इसके अलावा लागत कम कर देता है और ट्यूमर की धारावाहिक निगरानी को सरल बनाता है
ट्यूमर सीधे दिखाई दे रहा है नहीं हाँ चित्रा 3A
पहले engraftment (RENCA) के लिए समय 2 सप्ताह 2-4 दिन रेफरी 14, 15
विकास का अंतिम बिंदु (RENCA) 3-6 सप्ताह 10 दिन रेफरी 14, 15
मेटास्तासिस (RENCA) मनाया हाँ लड़कियों में हां चित्रा 3D
सीरियल पैसेज हाँ हाँ रेफरी 16-18
चूहों के लिए मार्ग (RENCA) हाँ हाँ हू, जे, एट अल समीक्षा के तहत (२०१९)
ट्यूमर विषमता बनाए रखें हाँ हाँ हू, जे, एट अल समीक्षा के तहत (२०१९)

तालिका 1: माउस और कैम मॉडल के फायदे और सीमाएं। यह तालिका आवश्यक समय, लागत, श्रम के साथ-साथ जीव विज्ञान के संदर्भ में उनके फायदे और सीमाओं के लिए दो मॉडलों की तुलना करती है। सीएएम मॉडल दक्षता में फायदे हैं, लेकिन पक्षियों और स्तनधारियों के बीच विभिन्न आकृति विज्ञान के कारण इसकी अपनी अनूठी सीमाएं भी हैं। इसलिए इस बात की पुष्टि करना जरूरी है कि मॉडल जेनोग्राफ्स के बायोलॉजी को बरकरार रख सकता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है, जिन्हें यूसीएलए चांसलर पशु अनुसंधान समिति (एआरसी) (एआरसी 2002-049-53 और एआरसी 2017-102-01A) के रूप में नामित किया गया है । 2002-049-53 प्रोटोकॉल नग्न या BALB/c चूहों के गुर्दे कैप्सूल में सीसीआरसी ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित है । हैचिंग से पहले निषेचित चिकन अंडे में ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रयोगों को आईएसएसी अनुमोदन की आवश्यकता नहीं होती है। फेफड़ों के मेटास्टैसिस की स्थापना के लिए समय का विस्तार करने के लिए, कैम ट्यूमर के साथ भ्रूण को हैच और मुर्गियों में विकसित करने की अनुमति है। 2017-102-01A प्रोटोकॉल इन पशु प्रयोगों को शामिल किया गया ।

1. चूहों में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर अध्ययन

नोट: इस प्रयोग के लिए समय रेखा चित्र 1एमें दिखाया गया है । इन प्रक्रियाओं को पिछले प्रकाशनों11,12से अनुकूलित किया गया था .

  1. ग्राफ्टिंग के लिए सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी
    1. ट्रिप्सिन/EDTA का उपयोग कर संस्कृति व्यंजनों से RENCA VHL-WT और VHL-KO कोशिकाओं को अलग करें ।
    2. कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनें और 1 x 105 कोशिकाओं/μL की एकाग्रता पर पीबीएस और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स समाधान के प्रीकूल्ड 1:1 मिश्रण में फिर से निलंबित करें।
      नोट: सजातीय प्रत्यारोपण के लिए अकेले विषम प्रत्यारोपण और वीएचएल-डब्ल्यूटी के लिए वीएचएल-KO कोशिकाओं VHL-WT के 1:4 अनुपात का उपयोग करें।
    3. पुनर्निलंबित कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रत्यारोपण तक बर्फ पर रखें।
  2. गुर्दे कैप्सूल के लिए प्रत्यारोपण
    1. एनेस्थीसिया: एक गर्म पैड को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें और इसे मोटी बाँझ ड्रेप के टुकड़े से ढक दें। 10 मीटर/किलो की खुराक पर 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से या तो आइसोफ्लोरीन साँस लेना द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    2. सर्जिकल साइट से बाल शेव करें। इस कदम को नग्न चूहों के लिए छोड़ दिया जा सकता है।
    3. कीटाणुशोधन और सर्जिकल ड्रैपिंग: माउस के पीछे को पूरी तरह से पोविडोन-आयोडीन 3x के साथ कीटाणुरहित करें और इसके बाद 70% इथेनॉल 1x और बाँझ कपास झाड़ू के साथ इसे सूखा पोंछें। फिर तीन बाँझ चिकित्सा ड्रेसिंग क्रमिक रूप से लागू करें, पूरी पीठ को कवर करने के लिए एक शल्य चिकित्सा क्षेत्र बनाने के साथ ही माउस स्थिर करने के लिए ।
    4. चीरा और गुर्दे बाहरी: ऑपरेशन से पहले, povidone-आयोडीन के साथ ऑपरेटर की उंगलियों कीटाणुरहित या बाँझ दस्ताने की एक जोड़ी का उपयोग करें । माउस को प्रवण स्थिति में रखें और बाएं पार्श्व के नीचे बाईं किडनी का पता लगाने के लिए उंगलियों का उपयोग करें। त्वचा को खुले और निर्दिष्ट स्थान के नीचे मांसपेशियों की परत को काटने के लिए कुंद संदंश और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। पेट से बाईं किडनी को आंशिक रूप से बाहरी बनाने के लिए बाँझ कपास झाड़ू और संदंश का उपयोग करें।
    5. ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण: या तो इंसुलिन सीरिंज या अनुकूलित हैमिल्टन सीरिंज में चरण 1.1 में तैयार सेल निलंबन लोड (विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। गुर्दे कैप्सूल के नीचे पुनः निलंबित कोशिकाओं के 20 μL इंजेक्ट।
      नोट: सफल इंजेक्शन गुर्दे की सतह पर एक पारदर्शी उभार के गठन से निर्धारित होता है। गुर्दे के परेंचिमा में आकस्मिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप रक्तस्राव होता है और इंजेक्शन साइट पर घातक रक्तस्राव के कारण 90% के रूप में उच्च के रूप में एक पोस्ट-ऑपरेटिव मृत्यु दर होती है।
    6. धीरे-धीरे सुई को बाहर निकालें ताकि बहिर्ह या ट्यूमर सेल रिसाव को जमना और रोकने के लिए बाह्य मैट्रिक्स समाधान की अनुमति दी जा सके। फिर, बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके, गुर्दे को वापस पेट में धकेल दें।
    7. घाव सिलाई: मांसपेशियों की परत सिलाई करने के लिए 5-0 लेपित विकराल सीवन का उपयोग करें। त्वचा को एक बार पोविडोन-आयोडीन से कीटाणुरहित करें और त्वचा को घाव वाले ऑटोक्लिप के साथ बंद करें।
    8. वसूली: गर्म पैड पर माउस रखें जब तक कि यह जाग न जाए। यदि माउस को साँस लेना द्वारा एनेस्थेटाइज्ड किया गया था, तो आइसोफ्लोरीन को वापस लें और माउस को गर्म पैड पर तब तक रखें जब तक कि वह जाग न जाए।
  3. बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) और ऊतक संग्रह
    1. ट्यूमर प्रत्यारोपण के छह सप्ताह बाद, जुगनू-लूसिफ़ेरेज़ आधारित BLI छवियों ले लो । फिर आइसोफ्लोरीन साँस लेने के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें और उसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ट्यूमर सेल (सीटीसी) का पता लगाने के लिए रक्त एकत्र करें।
    3. हार्वेस्ट ट्यूमर और ब्याज के अंगों (गुर्दे, फेफड़ों, जिगर, आंतों, और तिल्ली) एक बाँझ ऊतक संचयन तकनीक22का उपयोग कर । पैराफिन-वैक्स एम्बेडिंग के लिए उन्हें रातोंरात 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें।

2. कैम ट्यूमर विद्वेष मॉडल

नोट: इन प्रक्रियाओं को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल23,24से अनुकूलित और संशोधित किया गया था । इस प्रक्रिया के लिए समय रेखा चित्र ा 1बीमें दिखाया गया है । यह लेख केवल सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, कृपया हमारे समूह25द्वारा प्रकाशित एक और JoVE लेख का उल्लेख करें ।

  1. प्रीक्यूबेशन: इनक्यूबेट हौसले से बिछाया, 37 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन अंडे इनक्यूबेटर में उर्वरित चिकन अंडे और 7 दिनों के लिए 55-65% आर्द्रता।
  2. सीएएम और खुली खिड़की (विकास ात्मक दिन 7) ड्रॉप करें:
    1. हवा की थैली और नसों का पता लगाएं और चिह्नित करें।
      नोट: आमतौर पर 10-15% अंडे हटा दिए जाते हैं क्योंकि वे निषेचित होते हैं या निषेचन के 7 दिनों के भीतर मर जाते हैं।
    2. एक चिह्नित नस के शीर्ष पर एक नई हवा थैली बनाएं।
    3. नई हवा थैली को रेखांकित करें, पैकिंग टेप लागू करें, और अंडे को इनक्यूबेटर पर वापस रखें।
      नोट: प्रक्रिया यहां रोका जा सकता है । उसी दिन के भीतर प्रक्रियाओं को फिर से शुरू करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि एयर सैक स्थानांतरित हो सकता है।
    4. एक खिड़की खोलें: घुमावदार माइक्रोडिविच्छेदन कैंची की एक जोड़ी और सुई-नाक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, खोल में 1.5 x 1.5 सेमी परिपत्र खिड़की काट ें।
      नोट: कैम के व्यवधान रक्त और कट शेल टुकड़े पर मौजूद कैम का एक टुकड़ा द्वारा इंगित किया जाता है।
    5. पारदर्शी चिकित्सा ड्रेसिंग के साथ छेद सील करें और अंडे को 37 डिग्री सेल्सियस और 55%-65% आर्द्रता पर स्थिर इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: चरण 2.1 में एक ही अंडे इनक्यूबेटर का उपयोग करें। इसे स्थिर बनाने के लिए रोटेटर बंद कर दें।
  3. स्वास्थ्य जांच (विकास ात्मक दिन 9): मृत अंडे निकालें और फिर बेतरतीब ढंग से ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण के लिए अंडे के बाकी समूह ।
    नोट: आदर्श रूप में, इस बिंदु पर जीवित रहने की दर विकास ात्मक दिन 0 का लगभग 80% है।
  4. नए उजागर कैम पर ट्यूमर कोशिकाओं ग्राफ्टिंग (विकास दिवस 10)
    1. प्रीकूल्ड आरपीएमआई 1640 (एल-ग्लूटामाइन के साथ) की मात्रा दोगुनी में एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स समाधान को पतला करें। 2 x 104 कोशिकाओं/μL की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आरएनसीए कोशिकाओं को अलग करें और उपरोक्त समाधान में फिर से निलंबित करें।
      नोट: सजातीय प्रत्यारोपण के लिए विषम प्रत्यारोपण और वीएचएल-डब्ल्यूटी के लिए वीएचएल-डीओ कोशिकाओं VHL-WT के 1:1 अनुपात का उपयोग करें।
    2. सेल निलंबन को पूर्वठोस करने के लिए, प्रत्येक सेल मिश्रण के 100 माइक्रोन को 200 माइक्रोन पिपेट युक्तियों में भरें और उन्हें 15 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर में रखें।
    3. खिड़की के माध्यम से कैम सतह पर प्रत्येक अंडे के लिए सेल निलंबन के 100 μL प्रत्यारोपण।
      नोट: कुछ प्रोटोकॉल23प्रत्यारोपण से पहले कैम खरोंच की आवश्यकता है । यह RENCA कोशिकाओं के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि वे बहुत जल्दी बढ़ते हैं।
  5. 10 दिनों के लिए कैम पर कोशिकाओं को उगाएं और हर 2 दिनों में फोटोग्राफ करें।
  6. इच्छामृत्यु और ट्यूमर, रक्त, और अंगों फसल।
    1. विकास ात्मक दिवस 20 (ट्यूमर दिन 10) पर, एक हेपरिनीकृत 10 मीटर सिरिंज के साथ कोरियोएलन्टोइक नस के माध्यम से रक्त एकत्र करें।
    2. भ्रूण को 15 मिन के लिए बर्फ पर डालकर इच्छामृत्यु करें।
    3. फसल और वजन ट्यूमर। 22चूहों के लिए उपयोग की जाने वाली बाँझ ऊतक कटाई तकनीक का उपयोग करके फेफड़ों और यकृत को विच्छेदन करें।
      नोट: मुर्गियों के यकृत में दो पालि होती हैं, जो पेट की गुहा में देखे जाने वाले पहले अंग होते हैं। इन्हें फेफड़ों से भ्रमित न करें। चिकन फेफड़े हृदय और पट26के नीचे स्थित हैं । फेफड़ों के सफल संग्रह को उजागर पसलियों द्वारा पुष्टि की जा सकती है।
    4. पैराफिन-वैक्स एम्बेडिंग के लिए रातोंरात 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ट्यूमर और विच्छेदित अंगों को ठीक करें।
  7. मुर्गियों को हैच करें।
    1. ट्यूमर के विकास की एक विस्तारित अवधि की अनुमति देने के लिए, 21 दिन के माध्यम से ऊष्मायन जारी रखें और मुर्गियों को 37 डिग्री सेल्सियस और कम से कम 60% आर्द्रता पर निकलने दें।
      नोट: मुर्गियों स्वाभाविक रूप से एक 24 घंटे समय अवधि में 21 दिन के बाद हैच लेकिन कभी कभार मुसीबत खुद से हैचिंग है । इस मामले में, अंडे के गोले को क्रैक करने से कुछ मदद मिलती है। मुर्गियों के लिए 24 घंटे के भीतर हैचिंग प्रक्रिया को पूरा करना महत्वपूर्ण है क्योंकि वे तब के बाद पोषक तत्वों की कमी से मर जाएंगे।
    2. मुर्गियों को 2 सप्ताह के लिए एक पशु सुविधा (2017-102-01A) में उगाएं।
    3. विकास ात्मक दिन 34 (ट्यूमर दिवस 24) पर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफ्लोरीन साँस लेने के साथ लड़कियों को इच्छामृत्यु दें।
    4. 22 चूहों के लिए उपयोग किए जाने वालेबाँझ ऊतक संचयन तकनीक का उपयोग करके फेफड़ों को विच्छेदन करें । फिर, उन्हें पैराफिन-वैक्स एम्बेडिंग के लिए रातोंरात 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें।

3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: सभी ऊतक अनुभागन और एच एंड ई धुंधला कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में ट्रांसलेशनल पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला (टीपीसीएल) द्वारा किया गया था।

  1. 20 किमी के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना स्लाइड और 100% इथेनॉल से पानी के लिए क्रमिक रूप से जाइलीन और रिहाइड्रेट का उपयोग कर 3x deparaffinize।
  2. 25 मिन के लिए एक सब्जी स्टीमर में उबला हुआ एक साइटरेट बफर में एंटीजन पुनः प्राप्त करें।
  3. ब्लॉक करने के लिए 1% बीएसए लगाएं। फिर पीबीएस में 1:200 कमजोर पड़ने के अनुपात में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-वीएचएल, एंटी-एचए, एंटी-फ्लैग) लागू करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. TBST (7 मिन प्रत्येक) के साथ 3x धोने के बाद, 1:200 कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट स्लाइड। TBST (7 मिन प्रत्येक) के साथ 3x धोएं और हेमैटोक्सिलिन प्रतिदागके बाद डीएबी एजेंट लागू करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लिसिस बफर के साथ माउस या चिकन रक्त को संसाधित करें।
    नोट: कैम रक्त का विश्लेषण करते समय पर्याप्त आरबीसी लिसिस विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि चिकन आरबीसी नाभिक हैं और आगे और साइड स्कैटर का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री में आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है।
  2. रक्त लाइसेट पर प्रवाह साइटोमेट्री चलाएं और mस्ट्रॉबेरी और EGFP अभिव्यक्ति के लिए डेटा का विश्लेषण करें।
  3. मलबे, मृत कोशिकाओं और अलिसेड आरडीसी को छोड़कर आगे और साइड स्कैटर के आधार पर प्राथमिक द्वार सेट करें।
  4. अनदाग नमूनों और एकल दाग नियंत्रण के आधार पर फ्लोरेसेंस गेट्स सेट करें। एक दाग नियंत्रण और अरंजित नियंत्रण के रूप में वीएचएल-डब्ल्यूटी, वीएचएल-को, या अलेबल RENCA कोशिकाओं के साथ रक्त लाइकेट प्राइमेड का उपयोग करें।

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Representative Results

प्रत्येक प्रयोग कम से कम 3x किया गया था जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। डेटा को मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। महत्व एक बनती, छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था जब वहां दो समूहों या एक तरह से ANOVA द्वारा जब वहां तीन या अधिक समूहों थे । महत्व स्थापित करने के लिए 0.05 की पी-वैल्यू कटऑफ का उपयोग किया गया था।

ऑर्थोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित रेनका कोशिकाएं सफलतापूर्वक चूहों गुर्दे पर बढ़ी, जैसा कि BLI और एच एंड ई धुंधला(चित्रा 2ए-बी)द्वारा पुष्टि की गई है। हालांकि प्राथमिक विकास में कोई अंतर नहीं था, केवल विषम, मेटास्टैटिक ट्यूमर में फेफड़ों के लिए मजबूत मेटास्टेसिस था जैसा कि एच एंड ई धुंधला में बहुत मजबूत BLI सिग्नल और मेटास्टैटिक नोड्यूल द्वारा इंगित किया गया था। दूसरी ओर, सजातीय, नॉनमेटास्टैटिक ट्यूमर दूर के अंगों के लिए मेटास्टेसाइज नहीं था। सीटीसी मायने रखता है नॉनमेटास्टैटिक ट्यूमर असर उन लोगों की तुलना में मेटास्टैटिक ट्यूमर असर चूहों में अधिक थे(चित्रा 2सी-डी)।

माउस मॉडल के साथ सामंजस्य में, कैम सिस्टम ने आरएनसीए ट्यूमर के विकास और मेटास्टैटिक व्यवहार को सफलतापूर्वक बनाए रखा। हालांकि मेटास्टैटिक और नॉनमेटास्टैटिक ट्यूमर के बीच कोई वृद्धि का अंतर नहीं था, सीटीसी मायने रखता है nonmetastatic समकक्षों(चित्रा 3ए-सी)के साथ उन लोगों की तुलना में मेटास्टैटिक ट्यूमर के साथ अंडे में काफी अधिक थे । कैम ट्यूमर के साथ अंडे हैचिंग और लड़कियों को एक अतिरिक्त दो सप्ताह बढ़ने की अनुमति मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं के लिए अवधि बढ़ाया लड़कियों के फेफड़ों में हिस्टोलॉजिकल रूप से पता लगाने योग्य मेटाटैरेस स्थापित करने के लिए, के रूप में एच & ई और चिकन फेफड़ों के ऊतकों वर्गों के एच दाग में दिखाया गया है(चित्रा 3डी)। मेटास्टैटिक नोड्यूल के बहुमत में एचए-टैग वीएचएल-डब्ल्यूटी कोशिकाएं शामिल थीं, जबकि ध्वज-टैग वीएचएल-KO शायद ही कभी देखा गया था, जैसा कि हमने चूहों में देखा है।

Figure 1
चित्रा 1: मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी ज़ेनोग्राफ्ट के लिए दो पशु मॉडलों का अवलोकन। (क)माउस ऑर्थोटोपिक मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 3- या 4 सप्ताह पुराने चूहों को ऑर्थोटोपिक रूप से या तो नॉनमेटास्टैटिक या मेटास्टैटिक ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। प्रत्यारोपण के छह सप्ताह बाद, ट्यूमर विकास और मेटाटैसिस BLI के साथ कल्पना की गई । फिर, ट्यूमर, रक्त, और अंगों को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ों के लिए एकत्र किया गया था। (ख)सीएएम मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व निम्नलिखित चरणों को दिखाता है: प्रीनिक्यूबेशन, विंडो खोलना, सेल प्रत्यारोपण, और इच्छामृत्यु से पहले या बाद में हैचिंग। एकत्र किए गए नमूनों के लिए माउस मॉडल के समान विश्लेषण किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित चूहों में ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस। (ए)चूहों और निकाले गए अंगों (गुर्दे, फेफड़े, जिगर, आंत, और तिल्ली) के BLI 6 सप्ताह के बाद ऑर्थोटोपिक रेनेस्ट्रीन RENCA कोशिकाओं के प्रत्यारोपण । बाएं: नॉनमेटास्टैटिक (गैर-मुलाकात), दाएं: मेटास्टैटिक। (ख)गुर्दे और फेफड़ों (20x और 100x) के लिए एच एंड ई धुंधला का सकल दृश्य और बढ़ते आवर्धन। बाएं: नॉनमेटास्टैटिक (गैर-मुलाकात), दाएं: मेटास्टैटिक। (ग)रक्त में घूम रही एमस्ट्रॉ + और ईजीएफपी + कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह विश्लेषण। (D)एमस्ट्रॉ + और ईजीएफपी + कोशिकाओं को प्रसारित करने का प्रतिशत जनसंख्या ग्राफ । गैर-मुलाकात: नॉनमेटास्टैटिक। पैनल ए हू एट अल27से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कैम मॉडल में ट्यूमर विकास और मेटाटैसिस। (ए)सीएएम में उगाए गए RENCA ट्यूमर। प्रत्येक समूह के लिए 7 दोहराए गए थे । गैर-मुलाकात: नॉनमेटास्टैटिक। (ख)रक्त में घूम रही एमस्ट्रॉ + और ईजीएफपी + कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह विश्लेषण। (ग)एमस्ट्रॉ + और ईजीएफपी + कोशिकाओं का प्रतिशत जनसंख्या ग्राफ। **पी एंड एलटी; 0.01। (D)आईएचसी अपने भ्रूणीय चरण के दौरान मेटास्टैटिक ट्यूमर वाले 2 सप्ताह की लड़की से फेफड़ों का धुंधला होना । बाएं से, वर्गएच एंड ई, एचए और ध्वज धुंधला दिखाते हैं। #: चिकन फेफड़े की धमनी; तीरसिर: मेटास्टैटिक नोड्यूल्स। यह आंकड़ा हू जे एट अल27से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एपिथेलियल घातक के साथ कई रोगियों के लिए, महत्वपूर्ण अंगों के लिए मेटास्तासिस मृत्यु का प्राथमिक कारण है । इसलिए, अंतर्निहित तंत्र और मेटास्टैटिक रोग के लिए चिकित्सा का एक नया एवेन्यू खोजना आवश्यक है। दुर्भाग्य से, प्रासंगिक मेटास्टैटिक सीसीआरसीसी पशु मॉडल की कमी है। बड़े हिस्से में चुनौती कई ट्रांसजेनिक किडनी एपिथेलियल-लक्षित वीएचएल नॉकआउट माउस मॉडल9,10की पीढ़ी के बावजूद चूहों में सीसीआरसी को फिर से बनाने में असमर्थता के कारण है। यहां, हम दो पशु प्रणालियों, माउस और चिकन कैम में एक प्रत्यारोपण मेटास्टैटिक सीसीआरसी ट्यूमर स्थापित करने के तरीकों को प्रदर्शित करते हैं। इन निष्कर्षों ने दो असमान वातावरण में ट्यूमर के मेटास्टैटिक व्यवहार को मान्य किया, और इस प्रकार मेटास्टैसिस के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करते हैं। पहले मॉडल में, विषम RENCA आबादी को उनके गुर्दे कैप्सूल के लिए अमुनोसक्षम चूहों ऑर्थोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। 6 सप्ताह के बाद, इन चूहों बड़े पैमाने पर फेफड़ों मेटास्तासिस दिखाया । माउस मॉडल के साथ सामंजस्य में, कैम पर विषम RENCA कोशिकाओं का प्रत्यारोपण सफलतापूर्वक बढ़ी और लड़की भ्रूण के रक्त में इंट्रावस। हैचिंग के बाद ट्यूमर की वृद्धि की अवधि को 2 सप्ताह तक बढ़ाकर, माउस में देखे गए लोगों के समान फेफड़ों के मेटाटैस को चूजों में देखा गया था।

दोनों मॉडलों के लिए, तकनीकी कौशल में सुधार करने के लिए प्रत्येक चरण और अभ्यास के तकनीकी विवरणों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देना पशु अस्तित्व और सफल ट्यूमर एनग्राफमेंट और मेटास्टेसिस को बढ़ाने के लिए आवश्यक है। माउस मॉडल के लिए, उपकरणों की सावधानीपूर्वक पसंद और गुर्दे कैप्सूल के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के सटीक इंजेक्शन के बाद ऑपरेटिव मृत्यु दर को कम करने और ट्यूमर के लिए एक पर्याप्त रक्त की आपूर्ति पाने के लिए विकसित करने के लिए मौका बढ़ाने के द्वारा सफलता की दर को अधिकतम करता है और मेटास्टेसाइज। सीएएम मॉडल को सेटअप और तकनीक में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हमारे अध्ययन ों में, भ्रूण व्यवहार्यता शुरुआत में 30% से नीचे थी। अच्छे उपकरण, लगातार निगरानी और प्रक्रियाओं को तेजी से पूरा करके तापमान और आर्द्रता दोनों को हर समय वांछित स्तर पर रखना महत्वपूर्ण है। अनुकूलन के बाद भी, प्रयोगकर्ता और अंडों के व्यक्तिगत बैच के आधार पर जीवितता 50-75% से होती है। बैकअप के लिए हमेशा अतिरिक्त अंडे ऑर्डर करने की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव में, कैम तकनीकों में माहिर 1 वर्ष से अधिक की आवश्यकता होती है। कैम झिल्ली छोड़ने और खिड़की खोलने महत्वपूर्ण कदम है जहां आकस्मिक, भ्रूण को घातक क्षति सबसे अधिक बार होती है । कैम को नुकसान से रोककर चिक भ्रूण की व्यवहार्यता में सुधार किया जा सकता है।

कैम ट्यूमर मॉडल के लिए कई सीमाएं हैं। सबसे पहले सभी ट्यूमर सेल प्रकार के लिए मॉडल की प्रयोज्यता है। हमारे पास 100% सफलता दर सीएएम पर अलग-अलग स्थापित ट्यूमर सेल लाइनों को एन्ग्राफ्टिंग कर रही है, जिसमें गुर्दे, मूत्राशय और प्रोस्टेट ट्यूमर सेल लाइनें (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) और अंडाशय कैंसर सेल लाइनें (ID8 और SKOV3)। हमारे समूह से दो अतिरिक्त अध्ययन इन कैम ट्यूमर25,27के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं । हालांकि, कैम पर कुछ अंडाशय कैंसर कोशिकाओं के विकास को विकास कारक या ट्यूमर से जुड़ी कोशिकाओं25के पूरकीकरण से बढ़ाया जाता है। प्रत्येक सेल लाइन या प्रकार के लिए सेल संख्या या आवश्यक विकास कारक (एस) का अनुकूलन महत्वपूर्ण है। हम25,27जानवरों में ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की निगरानी को सुगम बनाने के लिए रिपोर्टर या मार्कर जीन, जैसे लूसिफ़ेरेज, प्रोटीन टैग (जैसे, एचए या फ्लैग), या फ्लोरेसेंस टैग (जैसे, एमस्ट्रॉबेरी या ईजीएफपी) को भी शामिल करते हैं। हमारे अनुभव के आधार पर, कैंसर सेल लाइनों का एक बड़ा बहुमत कैम पर स्थापित किया जा सकता है । engraftment के लिए एक प्रमुख सीमा ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति दी कम 10 दिन खिड़की हो सकती है, जो एक धीमी गति से बढ़ती सेल लाइन के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है इस तरह के एक कम समय सीमा में पर्याप्त द्रव्यमान स्थापित करने के लिए ।

कैम मॉडल की एक और कमी एवियन भ्रूण और स्तनधारियों के बीच शरीर विज्ञान में अंतर है। कैम ट्यूमर से भ्रूण के जिगर या फेफड़ों जैसे प्रमुख अंगों तक मेटास्तासिस का पता मुख्य रूप से संवेदनशील पीसीआरतकनीक28द्वारा लगाया गया है । सीएएम में विकास की कम समय ावधि बड़े मेटास्टैटिक घावों को स्थापित करने के लिए अपर्याप्त होगी जिन्हें हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। इसके अलावा, अनइन्फ्लेटेड भ्रूण फेफड़ों का कम संवहनी परफ्यूजन फेफड़ों के मेटास्ताकेस के विकास की स्थापना या समर्थन करने के लिए अनुकूल नहीं है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमारे संस्थागत पशु उपयोग समिति (आईएसीयूसी) से एक अनुमोदन कैम ट्यूमर असर भ्रूण से मुर्गियों हैच और उंहें हैचिंग के बाद एक अतिरिक्त 2 सप्ताह घर प्राप्त किया गया था । इस तरीके से ट्यूमर के विकास के समय का विस्तार हमें आईएचसी द्वारा दूर फेफड़ों के मेटास्तास का पता लगाने के लिए सक्षम है । हालांकि रची चिकन अध्ययन अतिरिक्त IACUC अनुमोदन की आवश्यकता है कि कैम ट्यूमर अध्ययन नहीं है, इस दृष्टिकोण के लिए एक मूल्यवान मुर्गियों में मेटास्टैटिक झरना अध्ययन के रूप में पहले चूहों में किया अवसर प्रदान करता है । चिकन प्रतिरक्षा प्रणाली को 12 दिन के बाद निषेचन20पर शुरू विकसित करने की सूचना दी गई है । एनग्राफिंग म्यूरेशन व्युत्पन्न RENCA ट्यूमर की उच्च दक्षता को देखते हुए यहां रिपोर्ट और कई अंय मानव कैंसर सेल लाइनों और 10 दिन पर कैम में PDXs निषेचन के बाद24,25,27,हम परिणाम निकालना सकता है कि भ्रूण में प्रतिरक्षा प्रणाली पूरी तरह से इस बिंदु पर विकसित नहीं है । चिकन की प्रतिरक्षा प्रणाली और कैम ट्यूमर के परस्पर क्रिया स्पष्ट रूप से आगे की जांच वारंट ।

हमारा काम मजबूत सहायक सबूत प्रदान करता है कि कैम ट्यूमर मॉडल मेटास्टेसिस सहित कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में एक सरल प्रारंभिक हो सकता है। ऊपर उल्लेख की गई सीमाओं के कारण, कैम मॉडल को माउस मॉडल को प्रतिस्थापित नहीं करना चाहिए, लेकिन इसे पूरक करना चाहिए। हमारे चल रहे शोध से पता चलता है कि सीसीआरसीसी में विषम कोशिका आबादी के बीच सिग्नल क्रॉसटॉक मेटास्टैटिक प्रगति11,12को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कैम और माउस मॉडल दोनों का उपयोग सीसीआरसीसी में खेलने पर मेटास्टैटिक क्रॉसटॉक को मान्य करने का एक मूल्यवान साधन हो सकता है। हमारा मानना है कि यहां प्रस्तुत कैम मॉडल के कई फायदे कैंसर के इस घातक चरण को हल करने के लिए उपन्यास मेटास्टैटिक तंत्र और प्रभावी उपचार की खोज की गति में तेजी ला सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूसीएलए जेसीसीसी सीड ग्रांट, यूसीएलए 3आर ग्रांट, यूसीएलए सीटीएसआई और यूसी टीआरडीआरपी (एलडब्ल्यू) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम प्रायोगिक तरीकों के साथ उनकी मदद के लिए क्रूम्प इंस्टीट्यूट की प्रीक्लीनिकल इमेजिंग फैसिलिटी, टीपीसीएल और यूसीएलए के डिपार्टमेंट ऑफ लेबोरेटरी एनिमल मेडिसिन (डीएमएएम) को धन्यवाद देते हैं । फ्लो साइटोमेट्री UCLA जॉनसन कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर (JCCC) और एड्स अनुसंधान प्रवाह साइटोमेट्री कोर सुविधा है कि स्वास्थ्य पुरस्कार P30 CA016042 और 5P30 AI028697 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र में प्रदर्शन किया गया था, और JCCC, UCLA एड्स संस्थान, UCLA में डेविड Geffen स्कूल ऑफ मेडिसिन, UCLA चांसलर कार्यालय, और UCLA कुलपति सांख्यिकी परामर्श और डेटा विश्लेषण सेवाएं UCLA CTSI बायोस्टैटिस्टिक्स, महामारी विज्ञान, और अनुसंधान डिजाइन (BERD) कार्यक्रम है कि NIH द्वारा समर्थित है द्वारा प्रदान की गई/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

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References

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

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कैंसर अनुसंधान अंक 156 गुर्दे सेल कार्सिनोमा मेटास्टेसिस पशु मॉडल गुर्दे प्रत्यारोपण कैम वीएचएल जीन विलोपन intratumoral विषमता
माउस किडनी में स्थापित मेटास्टैटिक क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा मॉडल की तुलना और चिकन कोरियोलंटोइक झिल्ली पर
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Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X.,… More

Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

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