Summary
هنا ، نقدم بروتوكولًا لتنفيذ عزل وتوسيع خلايا الدم الطرفية أحادية النواة المشتقة من السيتوكين CD3+CD56+ الخلايا القاتلة وتوضيح تأثيرها على السمية السيتومية ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة باستخدام نظام التدفق الخلوي للتشخيص المختبري.
Abstract
يركز العلاج المناعي الخلوي بالتبني على استعادة التعرف على السرطان عبر الجهاز المناعي ويحسن القتل الفعال للخلايا السرطانية. وقد أفيد القاتل الناجم عن السيتوكين (CIK) T العلاج بالخلايا لممارسة آثار كبيرة السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. يمكن اشتقاق CIK من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطية (PBMCs) ونخاع العظام ودم الحبل السري. خلايا CIK هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا التائية مع CD3+CD56+ والخصائص الطبيعية للقاتل (NK) التي تشمل مجمع التوافق الأنسجة الرئيسي (MHC) - نشاط مضاد للورم غير المقيد. تصف هذه الدراسة طريقة مؤهلة وقابلة للتطبيق سريرياً وقائمة على التدفق الخلوي للقياس الكمي للقدرة الخلويلة لخلايا CIK المشتقة من PBMC ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة. في الاستئصال الخلوي، تشارك خلايا CIK في احتضان بنسب مختلفة مع الخلايا السرطانية المستهدفة الملطخة مسبقا. بعد فترة الحضانة ، يتم تحديد عدد الخلايا المستهدفة بواسطة بقعة ملزمة للحمض النووي للكشف عن الخلايا الميتة. تنطبق هذه الطريقة على كل من تطبيقات البحث والتشخيص. تمتلك خلايا CIK سمية سيتومية قوية يمكن استكشافها كاستراتيجية بديلة لعلاج السرطان عند تقييمها قبل السريري من خلال إعداد وتتبع مقياس الخلايا (CS & T) نظام قياس الخلايا القائم على.
Introduction
الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا هي مجموعة خلايا ذات تأثير مناعي محددة تتوسط الاستجابات المناعية ضد السرطان. تم تطوير العديد من مجموعات الخلايا الضارة بما في ذلك الخلايا القاتلة المنشطة من اللمفوكين (LAK) ، والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا T ، والخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) لأغراض العلاج بالخلايا التائية بالتبني (ACT)1. هناك اهتمام متزايد في خلايا CIK ، لأنها تمثل مزيجًا من مجموعات الخلايا السامة للخلايا الناجمة عن السيتوكين التي توسعت من الخلايا أحادية نووية الدم المحيطية الذاتية (PMBCs)2.
يؤدي النمو غير المنضبط لخلايا السلف اللمفاوية والمايلوبلاست والأورام اللمفاوية إلى ثلاثة أنواع رئيسية من سرطان الدم (أي سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية والمايلوما) والأورام الصلبة ، بما في ذلك السرطانات (على سبيل المثال ، سرطان الرئة ، سرطان المعدة ، سرطان عنق الرحم) ، والساركومات ، من بين أنواع أخرى من السرطانات3. خلايا CIK هي مزيج من مجموعات الخلايا التي تحمل مجموعة واسعة من مجمع التوافق الهيستيك الرئيسي (MHC) - نشاط مضاد للورم غير المقيد وبالتالي تحمل الوعد لعلاج الأورام الدموية والمتقدمة4،5،6،7. خلايا CIK تتألف من مزيج من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3+CD56−)، NK-T الخلايا (CD3+CD56+)، وخلايا NK (CD3-CD56+). التحسين من بروتوكول التعريفي CIK باستخدام جدول زمني ثابت بالإضافة إلى IFN-ο، الأجسام المضادة CD3، وIL-2، يؤدي إلى توسيع خلايا CIK8. القدرة السامة للخلايا CIK ضد الخلايا السرطانية يعتمد أساسا على مشاركة NK المجموعة 2 عضو D (عضو في الأسرة مستقبلات C-نوع ليكتين مثل) لغاند NKG2D على الخلايا السرطانية, وعلى مسارات perforin بوساطة9. وكشفت نتائج دراسة ما قبل السريرية أن IL-15-حفز خلايا CIK تسبب السمية الخلوية قوية ضد خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الأولية والحادة في المختبر وأظهرت انخفاض alloreactivity ضد PBMCs العاديوالخلايا الليفية9. في الآونة الأخيرة ، تم نشر نتيجة CIK المشتقة من المتبرع الصحي لمرة واحدة (1 × 108/ كجم CD3+ الخلايا) التسريب كدمج بعد زرع الخلايا الجينية غير النخاعية لعلاج الأورام النخاعية في دراسة سريرية المرحلة الثانية10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير صيغة زراعة الخلايا المحسنة المكونة من IFN-ο ، IL-1α ، الأجسام المضادة CD3 ، وIL-2 المضافة إلى وسط الخلية المكونة للدم لزيادة إنتاج CIK ، وحقق تأثير الخلايا السامة للخلايا ضد الإنسان المزمن سرطان الدم النخاعي (K562) الخلايا وسرطان المبيض (OC-3) الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ البروتوكول السريري والموافقة عليه وفقًا للمبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الطبية الصينية ولجنة أخلاقيات أبحاث المستشفيات. تم حصاد عينات الدم المحيطية من متطوعين أصحاء بموافقتهم المستنيرة.
1- إعداد المواد
- تخزين الكواشف والأجسام المضادة والمواد الكيميائية كما هو موضح في ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS). حل الأدوية أو السيتوكينات في المذيبات وحلول الأسهم ومن ثم aliquot للتخزين في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
ملاحظة: ترد معلومات مفصلة لإعداد المواد في جدول المواد.
2- عزل المجلس الطبي المتعدد المتعددة المتعددة المتعددة البروم
- قم بتسخين محلول تدرج الكثافة(جدول المواد)إلى 18-20 درجة مئوية قبل الاستخدام. عكس زجاجة الحل عدة مرات لضمان خلط شامل.
- اجمع 3-5 مل من عينة دم وريدية بشرية في قارورة مُقنعة واخلط جيداً عن طريق قلب الأنبوب بلطف عدة مرات.
- إعداد 4 مل من محلول تدرج الكثافة في أنبوب معقم 15 مل.
- طبقة بعناية 1 مل من عينة الدم على حل التدرج كثافة.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 30 دقيقة عند 18-20 درجة مئوية (إيقاف الكسر).
- يستنشق بعناية وعلى الفور طبقة معطف باهي من الخلايا أحادية النواة (حوالي 1 مل) في وقت واحد لتجنب إزعاج الطبقات إلى أنبوب معقم 15 مل باستخدام ماصة معقمة 1 مل.
- أضف ما لا يقل عن 3 مجلدات (~ 3 مل) من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) إلى معطف برتقالي في أنبوب الطرد المركزي. تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x مع ماصة معقمة.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 10 دقيقة عند 18-20 درجة مئوية. يستنشق الـ(سوبرناتانت)
- تعليق بيليه الخلية مع 5 مل من المتوسطة القاعدية(جدول المواد)ونقلها إلى قارورة. ثقافة الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
3. CIK التعريفي والتوسع
- في اليوم 0، ثقافة PBMCs (1 × 106)في وسط القاعدية الطازجة التي تحتوي على 1000 وحدة دولية / مل من IFN-ο لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلايا المرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- في اليوم الأول، قم بتحديث الوسط بوسط بازلي جديد يحتوي على 50 نانوغرام/مل من الأجسام المضادة CD3، و1 نانوغرام/مل من RH IL-1α، و1000 U/mL من RH IL-2. تحديث المتوسط كل 3 أيام.
- في اليوم 7، قم بتحديث الوسط مع وسط القاعدي ة جديدة تحتوي على 1000 U/mL من RH IL-2. تحديث المتوسط كل 3 أيام حتى نهاية توسيع الخلية (اليوم 14).
4. المناعة لتقييم خلايا CIK
- غسل خلايا CIK مع 10 مل من PBS المعقم. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 300 × ز و 18−20 درجة مئوية، تستنشق السوبرناتان، وإعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من PBS. عد عدد الخلية واختبار قابلية الخلية باستخدام مقهّز استبعاد أزرق trypan.
- Aliquot خلايا CIK إلى ستة أنابيب معقمة 1.5 مل بكثافة ~ 5-10 × 105 خلايا / مل PBS. التسمية وعلاج على النحو التالي: أنبوب 1، فارغة (لا الأجسام المضادة)؛ أنبوب 2، إضافة 20 ميكرولتر من isotype IgG1-FITC؛ أنبوب 3، إضافة 20 ميكرولتر من isotype IgG1-APC mAbs؛ أنبوب 4، إضافة 20 ميكرولتر من CD3-FITC؛ أنبوب 5، إضافة 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs؛ وأنبوب 6، إضافة 20 ميكرولتر من CD3-FITC و 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs.
- مزيج بلطف خلايا CIK مع الأجسام المضادة عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x مع 1 مل معقمة ماصة، ومن ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 300 × ز و 18-20 درجة مئوية. يستنشق supernatant وتعليق بيليه الخلية مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. أنبوب بلطف لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x مع 1 مل ماصة معقمة.
- كرر الخطوة 4.4.
- ترك الأنابيب في الظلام قبل تحليل التدفق الخلوي.
5. علامة CD الاعتراف
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب قاع دائري دائري معقم 5 مل من البوليسترين مع غطاء مصفاة الخلية (100 ميكرومتر) عن طريق الأنابيب بلطف من خلال الغطاء. وضع الأنابيب على دائري في النظام.
- افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وأنشئ مجلدًا تجريبيًا. انقر على زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة وتسمية الأنابيب على النحو التالي: أنبوب 1، فارغ؛ أنبوب 2، Isotype IgG1-CD3؛ أنبوب 3، Isotype IgG1-CD56؛ أنبوب 4، CD3؛ أنبوب 5، CD56؛ أنبوب 6، CD3CD56.
- إنشاء نظام جالغاتينغ مبعثر لخلايا CIK(الشكل 2A).
- حدد الأنبوب 1 (فارغ) وانقر على زر Dot Plot لإنشاء قطعة FSC-A/SSC-A. رسم بوابة مستطيل على كامل عدد الخلايا مع عتبة FSC-A > 5 × 104 لاستبعاد حطام الخلية.
- حدد المعلمة SSC-A/SSC-H لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة مضلع حول كافة الخلايا المفردة. حدد معلمة Count/FITC (CD3) وCount/APC (CD56) لحبكة الرسم البياني الجديدة، على التوالي. حدد معلمة FITC (CD3)/APC (CD56) لقطعة النقطة الجديدة وارسم بوابة رباعية أربعة لتحديد الفئات السكانية الفرعية الأربعة.
- تسجيل البيانات من 20،000 خلية واحدة في كل عينة. انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل نموذج التحكم الفارغ أولاً. تحديد مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3.
- كرر الخطوة 5.3 للتحقيق في جميع العينات.
- افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.
6. زراعة وتلطيخ سرطان الدم النخاعي البشري K562 خلايا وسرطان المبيض OC-3 الخلايا
- خلايا K562
- خلايا الثقافة K562 في الوسائط الكاملة (RPMI وسيطة القاعدية تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنيني [FBS] و 50 U/mL المضادات الحيوية وضبط الجلوكوز إلى 4.5 غرام / لتر) بكثافة 0.5-1 × 106 خلايا / مل في قارورة زراعة الخلايا واحتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- نقل الوسائط الثقافية التي تحتوي على خلايا K562 إلى أنابيب معقمة 50 مل وبيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 18-20 درجة مئوية في يوم التجربة.
- يستنشق supernatant، resuspend الخلايا في 5 مل من PBS العقيمة، وتخلط جيدا بلطف.
- بيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تستنشق supernatant، إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني، وضبط الخلايا K562 إلى تركيز 0.5-1 × 106 خلايا / مل.
- أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة CFSE إلى 1 مل من تعليق الخلية K562 في أنبوب معقم 15 مل بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر. مزيج بلطف التعليق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا على الأقل 3x.
- اترك الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربونلمدة 10-15 دقيقة.
- إضافة 9 مل من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب وبيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. Decant supernatant ثم تعليق بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام كاملة. نقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة الخلية ووضعها في الحاضنة.
- خلايا OC-3
- خلايا OC-3 الثقافة في الوسائط الكاملة (DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS و 50 U/mL المضادات الحيوية) بكثافة 0.5-1 × 106 خلايا في قارورة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- اسشق وسائل الإعلام والثقافة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 قبل يوم من التجربة.
- فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من خلية حل إنزيم التفكك(جدول المواد)واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- تعليق الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا بلطف. بيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة واستنشاق supernatant. إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وضبط الخلايا إلى تركيز 0.5-1 × 106 خلايا / مل.
- أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة CFSE إلى 1 مل من تعليق الخلية OC-3 في أنبوب معقم 15 مل بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر. مزيج بلطف التعليق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا على الأقل 3x.
- اترك الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربونلمدة 10-15 دقيقة.
- إضافة 9 مل من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب وبيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. Decant supernatant ثم تعليق بيليه الخلية مع وسائل الإعلام كاملة. البذور 5 × 105 خلايا / جيدا في لوحة بئر 6 واحتضان في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
7. الخلايا السامة للاقاسية
- الثقافة المشتركة لخلايا CIK وK562 (CIK-K562)
- عد الخلايا K562 من الخطوة 6.1.7 واختبار قابلية الخلية عن طريق فحص استبعاد الأزرق trypan. أضف 1 مل من خلايا K562 إلى كل بئر في لوحة بئر 6 بكثافة 5 × 105/ مل.
- إضافة 1 مل من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK من الخطوة 3.4 إلى لوحة بئر 6 من الخطوة 7.1.1 على النحو التالي: حسنا 1 = فارغة، K562 الخلايا وحدها (5 × 105)؛ حسنا 2 = CFSE الملطخة K562 الخلايا وحدها (5 × 105); حسنا 3 = خلايا CIK (E [effector], 25 × 105)+ CFSE الملطخة K562 الخلايا (T [الهدف], 5 × 105); حسنا 4 = خلايا CIK (E، 50 × 105)+ CFSE الملطخة K562 الخلايا (T، 5 × 105).
- خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- الاستزراع المشترك لخلايا CIK و OC-3 (CIK-OC-3)
- إضافة 1 مل من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK من الخطوة 3.4 إلى لوحة 6 جيدا من الخطوة 6.2.7 على النحو التالي: حسنا 1 = فارغة، OC-3 الخلايا وحدها (5 × 105)؛ حسنا 2 = CFSE الملطخة OC-3 الخلايا وحدها (5 × 105); حسنا 3 = خلايا CIK (E، 25 × 105)+ CFSE الملطخة OC-3 الخلايا (T، 5 × 105)؛ حسنا 4 = خلايا CIK (E، 50 × 105)+ CFSE الملطخة OC-3 الخلايا (T، 5 × 105).
- خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x. وضع لوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- 7-أمينولينومايسين د (7-AAD) صبغ تلطيخ
- حصاد تعليق الخلية CIK-K562 من الخطوة 7.1.3 مباشرة إلى أنبوب معقم 15 مل.
- حصاد كل من تعليق والخلايا المنضمة من مجموعات CIK-OC-3 من الخطوة 7.2.2.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 مل. غسل البئر مع 1 مل من PBS المعقمة، وجمع برنامج تلفزيوني، وإضافة إلى الأنبوب. إضافة 0.5 مل من محلول إنزيم الانفصام الخلية، واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل من الحل من نفس الأنبوب إلى البئر المقابلة وبلطف خلط الخلايا عن طريق الأنابيب لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x مع 1 مل ماصة معقمة. جمع جميع الخلايا في نفس الأنبوب.
- جهاز الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، يستنشق supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS المعقمة. بيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، يستنشق supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة.
- أضف 5 ميكرولتر من صبغة 7-AAD (50 نانوغرام/ميكرولتر) إلى تعليق الخلية. مزيج بلطف الخلايا عن طريق الأنابيب لهم صعودا وهبوطا على الأقل 3x مع 1 مل ماصة معقمة. احتضان لمدة 10 دقائق وترك في الظلام قبل التحليل.
- الخلايا المكانية للقائية
- اخلط تعليق الخلية من الخطوة 7.3.4 وكرر الخطوات 5.1 و 5.2 مرة واحدة.
- انقر على زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة وتسمية الأنابيب على النحو التالي: أنبوب 1، K562 (أو OC-3) الخلايا فقط؛ أنبوب 2، CFSE الملطخة K562 (أو OC-3) الخلايا فقط؛ أنبوب 3، E:T = 5:1; أنبوب 4، E:T = 10:1.
- إنشاء نظام جالغاتينغ مبعثر للمعينات الخلوي(الشكل 3A).
- حدد الأنبوب 1 وانقر على زر نقطة مؤامرة لإنشاء FSC-A/SSC-A مؤامرة. رسم بوابة مستطيل على جميع الأحداث مع عتبة FSC-A > 5 × 104 لاستبعاد حطام الخلية.
- حدد معلمة SSC-A/CFSE لمؤامرة النقطة الجديدة. حدد معلمة 7-AAD/CFSE لمؤامرة النقطة الجديدة وارسم بوابة رباعية لتحديد الفئات السكانية الفرعية الأربعة.
- انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل عينة التحكم الفارغة أولاً.
- ضبط الجهد من SSC-A وFSC-A. تحديد عدد الخلايا الميتة باستخدام معلمات CFSE وقناة 7-AAD. تسجيل البيانات من > 20,000 CFSE+ الخلايا في كل عينة.
- كرر القسم 7.4.6 للتحقيق في جميع العينات.
- افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية لكل عينة فردية لتحليل مجموعات الخلايا غير القابلة للحياة وتصدير البيانات إلى ملفات التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الغرض من هذا البروتوكول هو عزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) T من monocytes الدم المحيطي وتقييم تأثير السامة للخلايا CIK ضد الأورام الخبيثة الدموية والخلايا السرطانية الصلبة، على التوالي. تم تحديد تحريض CIK من خلال الاعتراف CD3/CD56. ويبين الشكل 1ألف بروتوكول تحريض وتوسيع المركز. ويتضح النتائج التمثيلية لاستراتيجية الجاتينغ لتحليل السكان الفرعيين من CD3+CD56+ الخلايا التائية من المتبرعين الأصحاء في الشكل 1B. ويبين الشكل 1جيم التحليل الإحصائي لنسبة المركز من ثلاثة أفراد.
الشكل 2ألف يبين أن CD3+CD56+ نسبة الخلية (0.65٪ لPBMC الأصلي، لوحة أقل اليسار و 27.4٪ لخلايا CIK حصادها في اليوم 14th،اللوحة السفلى اليمنى) زيادة كبيرة بعد 14 يوما من التوسع. في نظامنا الثقافي ، أسفرت خلايا CIK عن حوالي نصف 100 مرة مقارنة بالعدد الأصلي من PBMCs(الشكل 2B).
ويبين الشكل 3 تأثير السمية للخلايا CIK ضد الإنسان سرطان الدم النخاعي المزمن K562 الخلايا وسرطان المبيض البشري OC-3 الخلايا. كانت خلايا K562 أو OC-3 (الهدف، T) ملطخة بصبغة غير فلورية (CFSE) ، والتي تم مرجلها بواسطة المسح داخل الخلايا داخل الخلايا القابلة للحياة ثم أصبحت صبغة فلورية للغاية. في دراسة الاستزراع المشترك السامة للخلايا، تم علاج خلايا K562 أو OC-3 الملطخة بـ CFSE مع خلايا CIK لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة ، تم حصاد الخلايا الإجمالية وملطخة بصبغة 7-AAD ، وهي صبغة ملزمة للحمض النووي تستخدم كمسبار قابل للتطبيق لاستبعاد الخلايا الميتة. ويتضح حجم والتفاصيل من CIK وCFSE+ الخلايا في الشكل 3A. وقد تم التعامل مع خلايا K562 الملطخة بـ CFSE (الخلايا المستهدفة، T) مع خلايا CIK (خلايا التأثير، E) بنسبة E/T = 0:1 و 5:1 و 10:1، على التوالي. تم تقييم خلايا 7-AAD+ من CFSE+ K562 جميع الخلايا. وكانت النتائج الإحصائية من ثلاث تجارب مستقلة. الانبساط يعني النسبة المئوية لوفاة الخلية في غياب خلايا المؤثرات (E:T = 0:1). يوضح الشكل 3B السمية السيتومية الواضحة لـ CIK ضد خلايا OC-3 (E:T = 10:1) بعد 24 ساعة من الحضانة.
الشكل 1: مخطط تدفق الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين والحث والتوسع. (أ)تعرضت PBMCs من المتبرعين الأصحاء الذين تمت الموافقة عليهم في البداية إلى rhIFN-а (اليوم 0)، تليها rhIL-2، rhIL-1α، ومكافحة CD3 mAb (اليوم 1) كل 3 أيام (اليوم 4). في وقت لاحق، تم تحديث المتوسطة مع rhIL-2 التي تحتوي على المتوسطة كل 3 أيام وتم حصاد الخلايا في اليوم 14. (ب)مورفولوجيا خلايا CIK خلال 7 أيام من الاستقراء. تم تنشيط وتوسيع خلايا CIK على النحو المبين في البروتوكول. لوحظت الخلايا تحت المجهر الخفيف في الأيام 1 و 5 و 7 على التوالي (التكبير = 40x ، شريط المقياس = 200 ميكرومتر). (ج)تم إجراء عمليات عد الخلايا أسبوعيًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نسبة CD3+CD56+ T الخلايا من عينة PBMC تمثيلية. (أ)تم التعرف على الخلايا اللمفاوية من قبل حجم محدد والحبيبية. مجموعة مختارة من الخلايا المفردة للتحليل حسب قياس التدفق الخلوي. (ب)تم إجراء تحليل إحصائي لفعالية توسع CIK من ثلاثة متبرعين أصحاء باستخدام اختبار t (*, p < 0.01). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الآثار السامة للخلايا السامة للخلايا CIK ضد سرطان الدم النخاعي البشري K562 وسرطان المبيض البشري OC-3 الخلايا. (أ)بعد الاستزراع المشترك مع خلايا CIK لمدة 24 ساعة ، تم التعرف على الخلايا المستهدفة K562 وبواباتها استنادًا إلى تلطيخ صبغة CFSE. توضيح رباعي لإجمالي عدد الخلايا تحت معلمة 7-AAD/CFSE المحددة والسمية الخلوية التراكمية لخلايا CIK عند نسبة E:T المشار إليها. (ب)تأثير السمية السيتومية لخلايا CIK ضد خلايا OC-3 في نسبة E:T = 10:1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هي بروتوكول سريع ومريح وموثوق به لعزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) من عينات الدم الكاملة للمتبرعين الأصحاء. كما أنه يظهر تأثير السمية للخلايا من CIK ضد سرطان الدم (K562) وخلايا سرطان المبيض (OC-3) باستخدام تدفق الإعداد الخلوي وتتبع النظام (CS & T). يمكن حث خلايا CIK وتوسيعها في ظروف ممارسات المصنع الجيدة (GMP) باستخدام السيتوكينات من فئة GMP والمتوسطة الخالية من المصل لمزيد من التسريب السريري11. ومع ذلك ، فإن فعالية التعريفي CIK والتوسع معارض الاختلافات الفردية12،13،14. وعلاوة على ذلك، والسلامة هي ميزة ضخ خلايا CIK المستمدة من المريض لعلاج الخلايا السرطانية. وقد أفيد أن خلايا CIK ممارسة الآثار الخلايا على الخلايا السرطانية الصلبة الظهارية في الغالب بطريقة تعتمد على NKG2D. في خلايا سرطان الدم, منع NKG2D مع جسم مضاد محدد يمنع بشكل كبير CIK الناجمة عن السمية الخلايا ضد خلايا K562 NKG2D منخفضة; ومع ذلك ، فإن هذا العلاج ليس له أي تأثير على خلايا HL-60 التي تفتقر إلى NKG2D15. وعلاوة على ذلك، فإن خلايا CIK تعرض نشاطًا أقل لقتل الخلايا ضد خلايا K562 بالمقارنة مع خلايا CD8+ CIK16. في هذه الدراسة، وجدنا أن CIK أظهرت إمكانات أكبر السامة للخلايا ضد سرطان المبيض OC-3 الخلايا مقارنة مع خلايا سرطان الدم K562. هذه البيانات تشير إلى أن الآليات الجزيئية الدقيقة التي من خلالها المؤثرات CIK قتل الخلايا السرطانية ليست واضحة حتى الآن.
أصبح تتبع قابلية الخلية المستهدفة وتقييم إمكانات السمية الخلوية للخلايا الضارة باستخدام قياس التدفق الخلوي طريقة قياسية وتقليدية للفحص السريري17. وقد اقترح أن لوحظ تأثير سلبي على صلاحية الخلية والتعبير عن علامات التنشيط، مثل CD3+ السكان في الخلايا الليمفاوية الملطخة CFSE مع تدفق الخلايا18،19. وبالتالي، تلطيخ الخلايا السرطانية المستهدفة هي استراتيجية أكثر فعالية لتقييم الآثار السامة للخلايا السامة للخلايا CIK الأولية. IFN-ο, OKT3, و IL-2 هي السيتوكينات الرئيسية أو المحفزات للتمايز CIK والانتشار. وعلاوة على ذلك، عوامل أخرى مثل الثيموجلوبولين، IL-1α، IL-10، IL-15، هي أيضا محفزات. حاليا، يتم استخدام المصل البشري، البلازما الغنية بالصفائح الدموية البشرية، وحتى مصل الأبقار الجنينية كمكملات متوسطة يمكن أن تعزز انتشار خلايا CIK. على الرغم من أن يتم إثراء المصل أو البلازما مع المواد الغذائية وعوامل النمو، إضافة المنتجات الحيوانية الكلوجينية يقدم المصدر، دفعة، والاختلافات الكثير التي تؤدي إلى تقلب التجريبية، وحتما دراسات غير مُقلقة مع النتائج العلاجية للخلايا المستزرعة. في هذه الدراسة، استخدمنا الوسائط المتاحة تجارياً خالية من المصل، خالية من الزلال، وخالية من XENO من فئة GMP مُكملة بسيتوكينات من الدرجة السريرية لاستزراع خلايا CIK بنجاح. عيب استخدام مكملات خالية من xeno أو الخالية من الخلايا هو أنها تقلل من فعالية انتشار الخلايا.
أساليب تتبع الخلية ذات اللونين المتوفرة في البروتوكولات تحسب بشكل مستقل الخلايا المستهدفة قابلة للتطبيق أو الميتة في إجراء تقييم السمية الخلوية المباشرة. في استراتيجياتنا الجاتينغ، يمكن تمييز CFSE+ الخلايا المستهدفة بوضوح من خلايا التأثير CIK(الشكل 3). والأهم من ذلك، يجب أن تكون عملية تحريض CIK والتوسع مؤهلة وتظهر قابلية عالية للحياة. لمزيد من الجرعات المتعددة الضخ, حالة الحفظ بالتبريد, وقابلية البقاء والسمية الخلوي بعد ذوبان, هي تحديات حاسمة أخرى. النسبة الفعلية للانقطاعات المحددة تساوي نسبة 100 x (%sample lysis - %Basal lysis)/(100 - %Basal lysis). على النقيض من الدراسات الأخرى18،20، فمن المستحسن أن يتم التحقيق في جميع الخلايا المستهدفة للكشف عن السمية الدقيقة والفعلية للخلايا CIK.
في الختام ، تم تصميم البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة لزيادة عدد خلايا CIK المشتقة من PBMC من المتبرعين الأصحاء وتقييم وظائفها السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية مع تحقيقات قابلة للتنشيط الضوئي بلونين لتتبع انتقائي الخلايا المستهدفة عن طريق قياس الخلايا تدفق مع نظام التشخيص في المختبر (IVD).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح المالية.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل مستشفى الجامعة الطبية الصينية (DMR-Cell-1809).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
- Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
- Grainger, S., et al.
- Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
- Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
- Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
- Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
- Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
- Nausch, N., et al.
- Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
- Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
- Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
- Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
- Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
- Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
- Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
- Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
- Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
- Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).
