Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בידוד והתרחבות של Cy, ציטוטוקאין ציטוטופין המושרה הרוצח T תאים לטיפול בסרטן

Published: January 24, 2020 doi: 10.3791/60420
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4,5, 4,6,7, 1,2, 1,2, 4, 4
1Department of Urology, Wan Fang Hospital, 2Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Translational Cell Therapy Center, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, 5Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 6Graduate Institute of Immunology, China Medical University, 7Department of Neurosurgery, Neuropsychiatric Center, China Medical University Hospital

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע את הבידוד והתרחבות של דם היקפי מונאוטרי תאים-cytokine נגזר המושרה CD3+CD56+ הרוצח תאים ולהמחיש ההשפעה שלהם באמצעות הרעלה נגד המטולוגית ותאים סרטניים מוצק באמצעות האבחון מחוץ לגוף האבחנה cy, לנסות מערכת.

Abstract

חיסוני הסלולר המאמצת מתמקד בשחזור הכרה בסרטן באמצעות מערכת החיסון ומשפר את הריגת תאים סרטניים יעיל. Cytokine המושרה הרוצח (ק) טיפול תא T דווח להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים משמעותיים נגד תאים סרטניים כדי להפחית את ההשפעות השליליות של ניתוח, קרינה, כימותרפיה בטיפול בסרטן. ק. ק. יכול להיות מופק מתאי דם היקפיים (PBMCs), מח עצם ו דם טבורי. תאים מסוג ק הם אוכלוסיית משנה הטרוגנית של תאי T עם CD3+CD56+ ו הרוצח הטבעי (NK) מאפייני פנוסטימית הכוללים מורכבות היסטליתתאימות העיקריים (mhc)-פעילות אנטי סרטניים בלתי מוגבלת. מחקר זה מתאר מוסמך, קליני ישימה, זרימה cy, המבוסס על השיטה המבוססת על כימות של היכולת cytolytic של תאים הנגזרות PBMC-נגזר נגד תאים סרטניים מוצק המטולוגי. בתוך האינטגרל cytolytic, התאים של ק. ק. ו. שכונתיות ביחס שונה עם תאים סרטניים היעד מוכתם. לאחר תקופת הדגירה, מספר תאי היעד נקבעים על ידי כתם חומצות הגרעין מחייב לזהות תאים מתים. שיטה זו ישימה הן עבור יישומים מחקריים והן עבור יישומי אבחון. תאים ק בעלי רעילות חזקה שניתן לחקור כאסטרטגיה חלופית לטיפול בסרטן על הערכה טרום קליני שלה על ידי התקנה cytometer מעקב (CS & T) מבוסס זרימה cy, מערכת המערכת.

Introduction

לימפוציטים T ציטוטוקסיים הם מסוימים החיסון החיסונית האוכלוסייה המדיטים תגובות החיסון נגד סרטן. מספר אוכלוסיות של תאים מסוימים, כולל lymphokine המופעל הרוצח (לק) תאים, הגידול החדירה לימפוציטים (TILs), הרוצח הטבעי (NK) תאים, γδ T תאים, ו cytokine המושרה הרוצח (ק) תאים פותחו עבור טיפול תא T המאמצת (ACT) מטרות1. יש עניין הולך וגדל בתאי ק. ק., כי הם מייצגים תערובת של אוכלוסיות המושרה ציטוטוקסיים הנגרמת מפני הרחבה מתוך דם היקפי בתאי מונטובית (PMBCs)2.

הצמיחה בלתי מבוקרת של תאים מחולל הלימפה, מיאלואידית, ו lymphoblasts מוביל שלושה סוגים עיקריים של סרטן הדם (כלומר, לוקמיה, לימפומה, מיאלומה), גידולים מוצקים, כולל קרצינומות (למשל, סרטן ריאות, סרטן קיבה, סרטן צוואר הרחם), ו סרקומות, בין סרטן אחרים3. תאים ק הם תערובת של אוכלוסיות תאים המוצגים מגוון רחב של מורכבות היסטולוגית העיקריים (mhc)-פעילות אנטי סרטניים בלתי מוגבל ובכך להחזיק הבטחה לטיפול בגידולים המטולוגיים ומתקדמים4,5,6,7. תאי ק מהווים שילוב של תאים, כולל תאי T (CD3+CD56-), בתאי Nk-T (CD3+CD56+),ותאי nk (CD3–CD56+). אופטימיזציה של פרוטוקול האינדוקציה ק ' ק על ידי שימוש בלוח זמנים קבוע עבור התוספת של IFN-γ, anti-CD3 נוגדן, ו-IL-2, תוצאות ההרחבה של התאים קח 8. היכולת ציטוטוקסיני של תאים ק נגד תאים סרטניים בעיקר תלוי באירוסים של הקבוצה NK 2 חבר D (חבר של C-type-סוג לקטין משפחה הקולטן) NKG2D ligands על תאי הגידול, ועל ניקובים בתיווך מסלולים9. התוצאות של מחקר טרום קלינית גילה כי תאים ממריצים IL-15-מגורה המושרה הרעלת ציטופוטנטיות חזקות נגד קווי לוקמיה מיאלואידית חמורה וחריפה בתוך מבחנה והציגה alloreactivity נמוכה נגד PBMCs נורמלי ופיברופיצוצים9. לאחרונה, את התוצאה של התורם בריא חד פעמי הנגזר ק ג (1 x 108/ק"ג CD3+ תאים) אינפוזיה כמו איחוד בעקבות השתלת אלוגנאלומית nonmyeloablative לטיפול מיאלואידית הנאלדיליגיאמים במחקר קליני שלב II פורסמה10.

במחקר הנוכחי, פיתחנו הנוסחה האופטימיזציה של תרבות התא מורכב IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 נוגדן, ו-IL-2 התווסף למדיום התא המטפיאה כדי להגדיל את הייצור של ק. ק., וחקר את ההשפעה ציטוטוקסיני של תאים ק נגד כרונית אנושית לוקמיה מיאלואידית (K562) תאים וסרטן השחלות (OC-3) תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הקליני בוצע ואושר בהתאם להנחיות של מועצת הסקירה המוסדית של האוניברסיטה הרפואית בסין וועדת האתיקה של בית החולים. דגימות דם היקפיים נקצרו ממתנדבים בריאים עם הסכמתם הודיעו.

1. הכנת חומרים

  1. אחסן ריאגנטים, נוגדנים וכימיקלים כמתואר בגיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS). לפזר את התרופות או ציטוקינים בממיסים כמו פתרונות מניות ולאחר מכן סדרת מחלקים עבור אחסון ב-20 ° c או-80 ° c.
    הערה: מידע מפורט על הכנת החומר מצוין ברשימת החומרים.

2. בידוד PBMC

  1. חמם את התמיסה של מעבר הדחיסות (טבלת חומרים) עד 18 עד 20 ° צ' לפני השימוש. היפוך בקבוק הפתרון מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  2. לאסוף 3 על 5 מ ל של דגימת דם הורידים האנושי בבקבוקון heparinized ולערבב היטב על ידי היפוך בעדינות הצינור מספר פעמים.
  3. הכינו 4 מ ל של פתרון צפיפות מעבר צבע ב 15 מ"ל צינור סטרילי.
  4. בזהירות שכבה 1 mL של דגימת הדם על הפתרון הצפיפות מעבר הצבע.
  5. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 30 דקות ב 18 עד 20 ° צ' (כבה את ההפסקה).
  6. בזהירות ומיד מנושף את שכבת מעיל הבאפי של התאים המוננובית (כ-1 מ ל) בו כדי להימנע מהפרעה בשכבות ל-tube 15 מ ל סטרילי באמצעות פיפטה מסוג 1 mL סטרילי.
  7. הוסף לפחות 3 כרכים (~ 3 מ"ל) של תמיסת מלח מאגור פוספט (PBS) למעיל באפי בשפופרת הצנטריפוגה. להשעות את התאים על ידי בעדינות ללטף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילי.
  8. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 10 דקות ב 18 עד 20 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
  9. השהה את הגלולה הסלולרית עם 5 מ ל של בסיס הבסיס (טבלת חומרים) והעבר לבקבוקון. תרבות התאים בחממה של תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

3. השראה והרחבה

  1. ביום 0, התרבות PBMCs (1 x 106) בינונית בסיס טרי המכיל 1,000 IU/ML של ifn-γ עבור 24 שעות בחממה תרבות התא מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. ביום 1, לרענן את המדיום עם בינונית בסיס טרי המכיל 50 ng/mL של נוגדן anti-CD3, 1 ng/mL של rh IL-1α, ו 1,000 U/mL של rh IL-2. . תרענן את המדיום כל 3 ימים
  3. ביום 7, לרענן את המדיום עם מדיום בסיס טרי המכיל 1,000 U/mL של rh IL-2. רענן את המדיום כל 3 ימים עד לסיום התרחבות התא (יום 14).

4. immunophenotyping קלדה להערכת תאים ק. ו.

  1. שטוף את תאי הק עם 10 מ ל. של הערוץ הסטרילי צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 300 x g ו 18 על 20 ° c, לבשל את הסופרנטאנט, ולהשעות מחדש את התאים עם 10 מ ל של PBS. ספירת מספר התאים והכדאיות של תאי הבדיקה באמצעות השימוש בשיטת ההדרה הכחולה.
  2. מחלק את התאים של ק. ל. שישה צינורות 1.5 mL סטרילי בצפיפות של ~ 5 – 10 x 105 תאים/mL PBS. תווית ולטפל כדלקמן: Tube 1, ריק (אין נוגדן); Tube 2, להוסיף 20 μL של isotype IgG1-FITC; Tube 3, להוסיף 20 μL של isotype IgG1-APC mAbs; Tube 4, להוסיף 20 μL של CD3-FITC; Tube 5, להוסיף 20 μL של CD56-APC mAbs; ו Tube 6, להוסיף 20 μL של CD3-FITC ו 20 μL של CD56-APC mAbs.
  3. בעדינות לערבב את התאים ק עם נוגדנים על ידי בעדינות ללטף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם מיני צנרת סטרילית 1 mL, ולאחר מכן הדגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 10 דקות ב-300 x g ו-18-20 ° c. ומשהה את הגלולה פעם אחת. עם 1 מ ג של הערוץ הסלולרי בעדינות ללטף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם צנרת 1 mL סטרילי.
  5. חזור על שלב 4.4.
  6. השאירו את החצוצרות בחשכה לפני הזרמת האנליזה של הציטוטומטלי.

5. זיהוי סמן CD

  1. להעביר את ההשעיה התא כדי סטרילי 5 מ"ל פוליסטירן בצינור התחתון עם כובע תא מסננת (100 יקרומטר רשת שינוי) על ידי ליטוף בעדינות דרך הכובע. . שים את החצוצרות על הקרוסלה בסדר
  2. פתח את הזרימה cy, לנסות את תוכנת הניתוח וליצור תיקייה ניסיונית. לחץ על לחצן הדגימה החדשה כדי להוסיף דגימה ושפופרת לניסוי ולשם הצינורות כדלקמן: tube 1, ריק; צינורית 2, Isotype IgG1-CD3; צינורית 3, Isotype IgG1-CD56; שפופרת 4, CD3; שפופרת 5, CD56; . טורפדו 6, CD3CD56
  3. צור מערכת ליצירת מערכות פיזור עבור אוכלוסיות התא של ק. י. (איור 2א).
    1. בחר Tube 1 (ריק) ולחץ על לחצן נקודה העלילה כדי ליצור fsc-a/מיקוד-מגרש. צייר שער מלבן מעל לאוכלוסיית התאים כולה עם סף FSC-A > 5 x 104 כדי לכלול את הריסות התאים.
    2. בחר את הפרמטר של מחלקת המידע לקבלת ההתוויה בנקודה החדשה וצייר שער מצולע סביב כל התאים היחידים. בחר את הפרמטר count/FITC (CD3) ו- count/APC (CD56) עבור מזימת ההיסטוגרמה החדשה, בהתאמה. בחר את הפרמטר Fitc (CD3)/APC (CD56) עבור העלילה נקודה חדשה ולצייר ארבע הרבעים שער להגדיר את ארבע אוכלוסיות משנה.
    3. הקלט את הנתונים מ 20,000 תאים בודדים בכל אחד מהדגימות. לחץ על לחצן טען לדוגמה כדי לנתח תחילה את דגימת הפקד הריק. זהה את כל אוכלוסיית התא של מק באמצעות הפרמטרים של ערוץ CD56 ו-CD3.
  4. חזור על שלב 5.3 לחקירה של כל הדגימות.
  5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימה הבודדת כדי לנתח אוכלוסיות של תאי ק ק והדפס אותם לתוך קבצי ניתוח.

6. culturing וכתמים של האדם לוקמיה מיאלואידית כרונית K562 תאים סרטן השחלות OC-3 תאים

  1. תאים K562
    1. תרבות K562 תאים במדיה מלאה (RPMI בסיס הבסיס המכיל 10% סרום של שור עוברי [FBS] ו 50 U/mL אנטיביוטיקה ולהתאים גלוקוז ל 4.5 g/L) בצפיפות של 0.5 על 1 x 106 תאים/mL ב התרבות התא בקבוקון ו דגירה מחולל לחות ב-37 ° c ו 5% CO2.
    2. העבר את מדיית התרבות המכילה את התאים הK562 ל-50 mL סטרילית ומצננת את התאים ב-300 x g במשך 10 דקות ב-18 עד 20 ° c ביום הניסוי.
    3. ומערבבים היטב את התאים ב-5 מ ל.
    4. כדור התאים בשעה 300 x g עבור 10 דקות. מועשר את הסופרנטאנט, משהה מחדש את התאים ב-PBS, ומתאימים את התאים הK562 לריכוז של 0.5-1 x 106 תאים/mL.
    5. הוסף 0.5 μL של צבע CFSE ל 1 מ ל של השעיית תא K562 בצינור 15 mL סטרילי בריכוז הסופי של 5 μM. בעדינות לערבב את ההשעיה על ידי ליטוף למעלה ולמטה לפחות 3x.
    6. השאירו את הצינור בחממה של תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 10 – 15 דקות.
    7. הוסף 9 מ ל של PBS לצינור וכלה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות. decant הסופרנט ולאחר מכן להשעות את הגלולה תא ב 10 מ ל של מדיה מלאה. להעביר את ההשעיה התא לתוך הבקבוקון תרבות התא ומקום בחממה.
  2. התאים OC-3
    1. תרבות OC-3 תאים במדיה מלאה (Dמאמ/F12 בינונית המכילה 10% FBS ו 50 U/mL אנטיביוטיקה) בצפיפות של 0.5 – 1 x 106 תאים בבקבוקון תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    2. ולשטוף את התאים עם הערוץ 1. יום לפני הניסוי
    3. נתק את התאים על-ידי הוספת 1 מ ל של פתרון אנזים של דיסוציאציה של התאים (טבלת חומרים) ו-דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
    4. השהה את התאים על-ידי הוספת 5 מ ל של PBS ומערבבים היטב בעדינות. גלולה את התאים בשעה 300 x g עבור 10 דקות ומכה את supernatant. השהה מחדש את התאים ב-PBS והתאם את התאים לריכוז של 0.5 – 1 x 106 תאים/mL.
    5. הוסף 0.5 μL של צבע CFSE ל 1 מ ל של השעיית התא OC-3 בצינור 15 מ ל סטרילי בריכוז הסופי של 5 μM. בעדינות לערבב את ההשעיה על ידי ליטוף למעלה ולמטה לפחות 3x.
    6. השאירו את הצינור בחממה של תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 10 – 15 דקות.
    7. הוסף 9 מ ל של PBS לצינור וכלה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות. decant הסופרנט ולאחר מכן להשעות את הגלולה התא עם מדיה מלאה. זרע 5 x 105 תאים/גם לתוך 6 צלחת הבאר ו הדגירה בחממה מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 לילה.

7. שיטת הרעל הציטוטוקסיים

  1. קותרבות של ק. ו. K562 תאים (ק-K562)
    1. ספור את התאים הK562 משלב 6.1.7 ובדוק את הכדאיות של התא על-ידי מחלת אי הכללה כחולה. הוסף 1 מ ל של K562 תאים לכל טוב ב 6 צלחת הבאר בצפיפות של 5 x 105/Ml.
    2. להוסיף 1 מ ל של בסיס הבסיס עם או בלי תאים ק מ שלב 3.4 אל 6 צלחת הבאר משלב 7.1.1 כדלקמן: ובכן 1 = ריק, K562 תאים בלבד (5 x 105); טוב 2 = CFSE מוכתם תאים K562 בלבד (5 x 105); ובכן 3 = תאים ק ג (E [אפקטור], 25 x 105) + cfse-מוכתם תאים K562 (T [יעד], 5 x 105); ובכן 4 = תאים ק (ה, 50 x 105) + cfse-מוכתם תאים K562 (T, 5 x 105).
    3. מערבבים את השעיות התא על ידי בעדינות ללטף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x. מניחים את הצלחת. בחממה ל -24 שעות
  2. התרבות של ק ו-3 תאים (ק-OC-3)
    1. הוסף 1 מ ל של בסיס הבסיס עם או בלי תאים ק מ שלב 3.4 אל 6 צלחת הבאר משלב 6.2.7 כדלקמן: ובכן 1 = ריק, OC-3 תאים בלבד (5 x 105); ובכן 2 = CFSE-מוכתם OC-3 תאים בלבד (5 x 105); ובכן 3 = תאים ק ג (E, 25 x 105) + cfse-מוכתם OC-3 תאים (T, 5 x 105); טוב 4 = תאים ק ג (E, 50 x 105) + cfse-מוכתם OC-3 תאים (T, 5 x 105).
    2. מערבבים את השעיות התא על ידי בעדינות ללטף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x. שים את הצלחת בחממה. במשך 24 שעות
  3. 7-Aminoactinomycin D (7-עמ ') מכתים צבען
    1. לקצור את ההשעיה התא K562 משלב 7.1.3 ישירות לתוך שפופרת סטרילי 15 mL.
    2. הקציר הן בתאי ההשעיה ואת התאים חסיד מ ק-OC-3 קבוצות משלב 7.2.2.
      1. העבר את ההשעיה לתא ל 15 מ"ל צינור סטרילי. לשטוף את הבאר עם 1 מ ל של ה-PBS סטרילי, לאסוף את ה-PBS, ולהוסיף לצינור. הוסף 0.5 mL של הפתרון האנזים דיסוציאציה של התאים, ו הדגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
      2. הוסף 1 מ ל של הפתרון מן הצינור אותו היטב המתאים ובעדינות לערבב את התאים על ידי ליטוף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם צנרת 1 mL סטרילי. לאסוף את כל התאים באותה צינורית.
    3. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות, מרוב הסופרנטאנט, ולהשעות את התאים בתוך 1 מ ל של ה-PBS סטרילי. כדור התאים בשעה 300 x g עבור 10 דקות, משאת הסופרנטאנט, ומשהה מחדש את התאים ב 100 μl של ה-PBS סטרילי.
    4. הוסף 5 μL של צבע 7 עמ מ (50 ng/μL) להשעיה של התא. בעדינות לערבב את התאים על ידי ליטוף אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם צנרת 1 mL סטרילי. דגירה של 10 דקות ולעזוב בחושך לפני הניתוח.
  4. שיטת היכולת הציטולתית
    1. לערבב את ההשעיה התא משלב 7.3.4 ולחזור על שלבים 5.1 ו 5.2 פעם אחת.
    2. לחץ על לחצן הדגימה החדשה כדי להוסיף דגימה ושפופרת לניסוי ולשם הצינורות כדלקמן: tube 1, K562 (או OC-3) תאים בלבד; Tube 2, CFSE מוכתם K562 (או OC-3) תאים בלבד; שפופרת 3, E:T = 5:1; Tube 4, E:T = 10:1.
    3. צור מערכת ליצירת מערכות פיזור לצורך שינון הציטוטולוי (איור 3א).
      1. לבחור Tube 1 ולחץ על הכפתור נקודה העלילה כדי ליצור Fsc-a/אס. אס. מגרש. צייר שער מלבן מעל כל האירועים עם סף FSC-A > 5 x 104 כדי לכלול את הריסות התאים.
      2. בחר בפרמטר ה -, מחלקת האס. או CFSE עבור מזימת הנקודה החדשה. בחר את הפרמטר 7 עמ מ/CFSE עבור העלילה הנקודה החדשה וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע אוכלוסיות המשנה.
      3. לחץ על לחצן טען לדוגמה כדי לנתח תחילה את דגימת הפקד הריקה.
      4. התאימו את המתח של האס. אס. אס ו-FSC-A. זהה את אוכלוסיית התאים המתים באמצעות פרמטרי הערוץ CFSE ו-7 עמ מ. הקלט את הנתונים מ-> 20000 CFSE+ תאים בכל אחד מהדגימות.
    4. חזור על סעיף ה7.4.6. לחקירה של כל הדגימות
    5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של כל אחד מהדגימות הבודדות כדי לנתח את אוכלוסיות התאים הלא-מקיימא ולייצא את הנתונים לקבצי ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד ולהרחיב את הרוצח cytokine המושרה (ק) תאים מונוציטים דם היקפי ולהעריך את ההשפעה ציטוטוקסיק נגד ממאירות המטולוגית ותאים סרטניים מוצק, בהתאמה. האינדוקציה של ק. ק. זוהתה על-ידי הכרה CD3/CD56. איור 1A מראה את הפרוטוקול עבור השראה והתרחבות. תוצאות הנציג של האסטרטגיה לגבי ניתוח האוכלוסיה של CD3+CD56+ T מתורמים בריאים מומחש באיור 1ב. איור 1ג מציג את הניתוח הסטטיסטי של הג הפרופורציה משלושה אנשים.

איור 2מראה כי CD3+CD56+ התאים (0.65% עבור pbmc המקורי, שמאל הפאנל התחתון ו 27.4% עבור התאים ק שנקטפו ביום 14th, הלוח התחתון הימני) גדל באופן משמעותי לאחר 14 ימים של התרחבות. במערכת התרבות שלנו, תאי ה-ק הניבו כחצי שינויים מושתנים בהשוואה למספר המקורי של PBMCs (איור 2ב).

איור 3 מראה את ההשפעה ציטוטוקסיי של ק נגד האדם לוקמיה מיאלואידית כרונית K562 תאים וסרטן השחלות האנושי OC-3 תאים. K562 או OC-3 תאים (המטרה, T) היו מוכתמים בצבע שאינו פלורסנט (CFSE), אשר ביקע על ידי תאיים מוחק בתוך תאים קיימא ולאחר מכן הפך לצבע פלורסנט מאוד. במחקר coculture ציטוטוקסיים מחקר, CFSE-K562 או OC-3 תאים היו מטופלים עם תאים ק ב 24 h. בסוף הדגירה, התאים הכולל נקצרו והוכתם עם צבע 7-עמ מ, שהוא לצבוע מחייב חומצות גרעין המשמש כמכשיר הכדאיות להדרה תא מת. הגודל והצפיפות של התאים של ק ו CFSE+ מומחשים באיור 3א. התאים CFSE מוכתם K562 (תאים היעד, T) היו שיתוף מטופלים עם תאים ק. ק. ו. (התאים האחרים, E) ביחס של E/T = 0:1, 5:1, ו 10:1, בהתאמה. 7-עמ מ+ תאים של cfse+ תאים K562 הוערכו כולם. התוצאות הסטטיסטיות היו. משלושה ניסויים עצמאיים הליזה בסיס פירושה אחוז מוות התאים בהיעדר תאי אפקטור (E:T = 0:1). איור 3ב מראה את הרעילות הברורה של מק נגד מתאים OC-3 (e:t = 10:1) לאחר 24 שעות של דגירה.

Figure 1
איור 1: הזרימה תרשים של cytokine המושרה תאים הרוצח אינדוקציה הרחבה. (א) pbmcs מן הסכימו תורמים בריאים נחשפו בתחילה ל-ריזוfn-γ (Day 0), ואחריו rhil-2, rhil-1α, ו-ANTI-CD3 mab (יום 1) כל 3 ימים (יום 4). לאחר מכן, המדיום היה רענן עם rhIL-2 המכיל בינוני כל 3 ימים והתאים נקצרו ביום 14. (ב) מורפולוגיה של תאי ק ב 7 ימים של אינדוקציה. ההפעלה וההרחבה של תאי ק ב נערכו כמתואר בפרוטוקול. תאים נצפו תחת מיקרוסקופ קל בימים 1, 5, ו -7, בהתאמה (הגדלה = 40x, סרגל קנה מידה = 200 μm). (ג) ספירות תאים נערכו מדי שבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיעור התאים CD3+CD56+ T ממדגם של נציג pbmc. (A) לימפוציטים זוהו על ידי גודל ספציפי וצפיפות. שנבחרו אוכלוסיית תאים בודדת לניתוח על-ידי שטהזרימה. (ב) ניתוח סטטיסטי של יעילות הרחבת ק מ שלושה תורמים בריאים נערך באמצעות מבחן t (*, p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השפעות ציטוטוקסיים של תאים ק נגד האדם לוקמיה מיאלואידית כרונית K562 וסרטן השחלות האנושי OC-3 תאים. (א) לאחר התרבות הקובית עם התאים ק ל 24 שעות, K562 תאים היעד זוהו מגודרת על בסיס כתמים של צבע cfse. רבע איור של אוכלוסיית התאים הכוללת תחת הפרמטר 7 עמ מ/CFSE שנבחר ואת הרעילות המצטברת של תאים של ק. ב. המצוין ביחס E:T. (ב) ההשפעה הציטוטוקסיים של תאים ק נגד כנגד OC-3 תאים ב E:T = 10:1 יחס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת היא פרוטוקול מהיר, נוח ואמין עבור בידוד והתרחבות של הרוצח ציטוקין cy, הנגרמת המושרה (ק) תאים מדגימות דם שלמות של תורמים בריאים. זה גם מראה את ההשפעה ציטוטוקסיק נגד לוקמיה (K562) ו סרטן השחלות תאים (OC-3) באמצעות זרימה cy, התקנה ומעקב אחר (CS & T) מערכת. תאים ק יכול להיות המושרה והרחיב בשיטות manufactory טוב (GMP) בתנאים באמצעות ציטוקינים GMP בכיתה ומדיום ללא סרום עבור עירוי קליני נוסף11. עם זאת, היעילות של האינדוקציה ק ו הרחבה מציג הבדלים בודדים12,13,14. יתר על כן, בטיחות היא היתרון של העירוי של תאים מטופלים שנגזר מטופל עבור טיפול בתאים סרטניים. זה דווח כי תאי ק להפעיל השפעות cytolytic על תאים סרטניים מוצק סרטן בעיקר באופן תלוי NKG2D. בתאי הסרטן המטולוגיים, חסימת NKG2D עם נוגדן ספציפי מעכב באופן משמעותי את הרעילות הנגרמת של ק. נגד NKG2D-low K562 תאים; עם זאת, טיפול זה אין שום השפעה על התאים HL-60 חסרים NKG2D15. יתר על כן, תאים ק להציג פחות פעילות הריגת תאים נגד K562 תאים לעומת CD8+ ק תאים16. במחקר זה, מצאנו כי ק הציגו פוטנציאל ציטוטוקסיי גדול יותר נגד סרטן השחלות OC-3 תאים לעומת לוקמיה K562 תאים. הנתונים האלה מצביעים על כך שהמנגנונים המולקולריים המדויקים שדרכם הורגים את תאי הגידול לא ברורים עדיין.

מעקב אחר הכדאיות של תא היעד והערכת הפוטנציאל ציטוטוקסיט של תאים באמצעות הזרמת cy, הפכה לשיטה סטנדרטית וקונבנציונלית לבדיקה קלינית17. יש כבר הציע כי השפעה שלילית היא נצפתה על הכדאיות התא ואת הביטוי של סמני הפעלה, כגון CD3+ אוכלוסיה ב-cfse-לימפוציטים ויטראז ' עם זרימה cy try18,19. כך, להכתים את התאים הסרטניים היעד היא אסטרטגיה יעילה יותר להערכת ההשפעות ציטוטוקסיים של תאי ק הראשי. IFN-γ, OKT3 ו-IL-2 הם ציטוקינים גדולים או ממריצים עבור בידול ק. ק. והתפשטות. יתר על כן, גורמים אחרים כגון thymoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15, הם גם ממריצים. כיום, סרום אנושי, פלזמה עשיר בטסיות דם, ואפילו סרום של שור עוברי משמשים תוספי בינוני שיכולים לשפר את התפשטות של תאים ק. ו. למרות הסרום או פלזמה מועשר בחומרים מזינים וגורמי גדילה, תוספת של מוצרי בעלי חיים allogeneic מציג מקור, אצווה, וריאציות הרבה התוצאה בהבדלים ניסיוני, ובלתי נמנע לימודי לימודים עם תוצאות טיפוליות לתאים מתורבתים. במחקר זה, השתמשנו חינם סרום ללא מסחרית, אלבומין חינם, ו xeno-כיתה חינם GMP מדיה בתוספת ציטוקינים בכיתה קלינית לתרבות בהצלחה תאים ק. החיסרון של שימוש בתוספי xeno-חינם או אלוגנמית חינם הוא שהם מפחיתים את היעילות של הפצת תאים.

שיטות המעקב אחר תאים בשתי הצבעים המסופקות בפרוטוקולים המחושבים באופן עצמאי או בתאי יעד מתים הנמצאים בתוך שיטה ישירה של הרעלת ציטוזה. באסטרטגיות שלנו ה, CFSE+ תאים היעד יכול להיות מכובד בבירור מתאי התאים של ק. ק. (איור 3). והכי חשוב, התהליך של האינדוקציה ק. ק. והתרחבות חייב להיות מוסמך ולהראות יכולת הקיום הגבוהה. לקבלת מינון נוסף של חליטות, תנאי הקריוגנית, והכדאיות והרעילות לאחר הפשרה, הם אתגרים קריטיים אחרים. היחס הממשי של הפירוק המסוים שווה לפרופורציה של 100 x (% הליזה לדוגמה-% בסיס הליזה)/(100-% הליזה בסיס). בניגוד למחקרים אחרים18,20, מומלץ כי כל תאי היעד נחקרו כדי לחשוף את הרעילות המדויקת ובפועל של תאים ק.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר במחקר זה נועד להגדיל את מספר התאים הנגזרות PBMC-נגזר מתורמים בריאים כדי להעריך את הפונקציות הציטוטוקסינים שלהם נגד התאים הסרטניים עם שני צבעים מכשיר פוטוקטיביות עבור מעקב סלקטיבי של היעד תאים על ידי הזרימה cy, לנסות עם מערכת אבחון מבחנה (IVD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על סכסוכים מתחרים של אינטרסים פיננסיים.

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי סין רפואי החולים באוניברסיטת (DMR-תא-1809).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Amino Actinomycin D BD 559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody BD 555518 B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751 MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD 338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) BD 565082
D-(+)-Glucose solution SIGMA G8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 HyClone SH30023.02
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare Life Sciences 71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody BD 555332 UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555748 MOPC-21
Human anti-CD3 mAb TaKaRa T210 OKT3
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Proleukin NOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gamma CellGenix 1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alpha PEPROTECH 200-01A
RPMI1640 medium Gibco 11875-085
Sigma 3-18K Centrifuge Sigma 10295
TrypLE Express Enzyme Gibco 12605028
X-VIVO 15 medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
  2. Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
  3. Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
  4. Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
  5. Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
  6. Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
  7. Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
  8. Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
  9. Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
  10. Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
  11. Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
  12. Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
  13. Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
  14. Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
  15. Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
  16. Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
  17. Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
  18. Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
  19. Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  20. Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).

Tags

מחקר הסרטן סוגיה 155 המאמצת חיסוני הסלולר cy הנגרמת המושרה תא הרוצח דם היקפי מונמוננקה תאים סרטן המטולוגי ומוצק טיפול immunocellular השפעה ציטוטוקסיים לזרום cy לנסות
בידוד והתרחבות של Cy, ציטוטוקאין ציטוטופין המושרה הרוצח T תאים לטיפול בסרטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S.… More

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S. C., Cho, D. Y., Lee, L. M., Wen, Y. C., Li, J. J., Shih, P. H. Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment. J. Vis. Exp. (155), e60420, doi:10.3791/60420 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter