Summary
Her beskriver vi en vækst betingelse for at kultur den lille koloni variant af Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder til påvisning og kvantificering af exopolysaccharid alginat produceret af P. aeruginosa ved hjælp af en traditionel uroonsyre carbazole assay og en alginat-specifik monoklonal antistof (mAb) baseret ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriel patogen, kan overproducere en exopolysaccharide alginat resulterer i en unik fænotype kaldet mucoidy. Alginat er forbundet med kroniske lungeinfektioner resulterer i dårlig prognose hos patienter med cystisk fibrose (CF). Forståelse af de veje, der regulerer produktionen af alginat kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske strategier rettet mod alginat dannelse. En anden sygdomsrelateret fænotype er den lille kolonivariant (SCV). SCV skyldes den langsomme vækst af bakterier og ofte forbundet med øget resistens over for antimikrobielle stoffer. I dette papir viser vi først en metode til dyrkning af en genetisk defineret form for P. aeruginosa SCV på grund af pyrimidinbiosyntesemutationer. Tilskud af kvælstofholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale vækst til disse mutanter, der viser tilstedeværelsen af en bjærgningvej, der skyller fri baser fra miljøet. Dernæst diskuterer vi to metoder til måling af bakteriel alginat. Den første metode bygger på hydrolyse af polysaccharid til sin uronsyre monomer efterfulgt af fraivatisering med et kromogtisk reagens, carbazole, mens den anden metode anvender en ELISA baseret på en kommercielt tilgængelig, alginat-specifikke mAb. Begge metoder kræver en standardkurve for kvantificering. Vi viser også, at den immunologiske metode er specifik for alginatkvificering og kan anvendes til måling af alginat i de kliniske prøver.
Introduction
Kroniske lungeinfektioner med Pseudomonas aeruginosa er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed hos patienter med cystisk fibrose (CF). I den tidlige barndom, patienter er koloniseret af flere bakterielle patogener herunder nonmucoid isolater af P. aeruginosa1,2. Fremkomsten af den lille koloni variant (SCV) isolater samt mucoid isolater er en markør for debut til kroniske infektioner. SCV isolater er meget resistente3 på grund af deres langsomme vækstrater4, hvilket gør dem en alvorlig afskrækkende i behandlingen regimenter og andre kroniske infektioner5 af P. aeruginosa. Arbejde af Al Ahmar et al.6 viste en sammenhæng mellem SCV og slimhinde forbundet med de novo pyrimidin biosyntese. Pyrimidinsult, på grund af mutationer i gener involveret i pyrimidinproduktion, resulterede i SCV fænotype i nonmucoid referencestammen PAO1 og mucoid derivat, PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduktion er en vigtig sygdommarkør for kroniske lungeinfektioner i CF, er det ikke klart, om der er en direkte sammenhæng mellem mængden af alginat og lungepatologi, og det er uklart, om alginat kan bruges som prognosemarkør til behandling7. Alginatproduktionen reguleres hovedsagelig af to operoner, en regulerende operon (algUmucABCD)8,9 og den biosyntetiske operon(algD operon)10,11. Alginatproduktionen reguleres stramt af sigmafaktoren AlgU9,12 (også kendt som AlgT) og nedbrydningen af antisigmafaktoren MucA13. Evnen til at overvåge produktionen af alginat in situ fra patienternes spytprøver kan hjælpe med udviklingen af nye terapeutiske muligheder.
Her beskriver vi en væksttilstand, der registrerer tilstedeværelsen af SCV forårsaget af mutanter, der ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskud af uracil og/eller cytosin, den nitrogenholdige base af pyrimidin nukleotid, til mediet aktiverer bjærgning vej, og dermed genoprette den normale vækst i mutanter. Denne vækstmetode for disse specifikke SCV-mutanter kan anvendes som screeningsmetode til at identificere pyrimidinmutationer i patientprøver. Derudover diskuterer vi to metoder til påvisning og måling af alginat produceret og udskilles af P. aeruginosa. Den første er den traditionelle metode14,15,16 af nedværdigende polysaccharid ved hjælp af en høj koncentration af syre og derefter tilføje en kolorimetrisk indikator til at slukke koncentrationen i prøven. Den anden metode, der er udviklet i vores laboratorium, anvender Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ved hjælp af et antialginat monoklonalt antistof (mAb) udviklet af QED Biosciences. ELISA-metoden viser sig at være mere specifik og følsom end den uronsyreanalyse og giver mulighed for sikrere brug på grund af undgåelse af den stærkt koncentrerede svovlsyre. Med ELISA's evne til at blive brugt direkte på patientspytprøver til at måle alginat kan det udvikles som et overvågningsdiagnostisk værktøj til at følge mængden af alginat, der findes i lungerne i forskellige perioder af infektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SCV vækstbetingelser og fysiologiskaktivering af Bjærgning Pathway
- Påvisning af SCV.
- Stæs p. aeruginosastammerne PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 og PAO581ΔpyrD på forvarmede Pseudomonas isolationagarplader (PIA) og vokser ved 37 °C i 48 timer. På vækstpladen identificere en enkelt koloni isolere, der har SCV fænotype (koloni størrelse på 1−3 mm i modsætning til den normale 3−5 mm koloni størrelse).
- Gentag trin 1.1.1 for at opnå et rent isoleret isoleret scv.
BEMÆRK: Vækst kan kræve op til 72 timer på grund af den langsomme vækstrate i SCV kolonierne.
- Fysiologisk aktivering af bjærgningsvejen.
- Ved hjælp af en steril vaccinationsløkke skal du vælge SCV-kolonien fra PIA-pladen og striber på en forvarmet PIA suppleret med 0,1 mM uracil. Pladen vokser ved 37 °C i 24−48 timer.
BEMÆRK: Alle PIA-plader, der anvendes i denne protokol, indeholder 20 ml glycerol, der er tilsat blandingen før autoklavering. Efter autoklavering og efter blanding ser temperaturen på 55 °C 11,21 mg/l uracil (0,1 mM) til det flydende medie, før der hældes plader. Denne metode ville hjælpe med at identificere pyrimidin mutationer, der forårsager SCV fænotype i P. aeruginosa. Hvis SCV-fænotypen er et resultat af nævnte mutation, vil normal kolonivækst og -størrelse (3−5 mm) blive observeret på uracil-supplerede PIA-plader. Hvis stammer havde evnen til at producere alginat, så mucoid fænotype vil også vende tilbage ved uracil tilskud.
- Ved hjælp af en steril vaccinationsløkke skal du vælge SCV-kolonien fra PIA-pladen og striber på en forvarmet PIA suppleret med 0,1 mM uracil. Pladen vokser ved 37 °C i 24−48 timer.
2. Uronic Acid Carbazole Assay
- Fra en ren kultur af den ønskede stamme, der skal testes, identificere en enkelt koloni. Brug en steril tandstikker, vælge kolonien, og placere tandstikker i en kultur reagensglas, der indeholder 5 ml Pseudomonas isolation bouillon (PIB). Voks i en shaker rugemaskine ved 37 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Følgende stammer PAO581 (PAO1mucA25),PAO581carA, PAO581carBog PAO581pyrD blev dyrket på PIA-plader eller PIA-plader suppleret med 0,1 mM uracil til høst alginat til måling. - På en forvarmet PIA-plade tilsættes 150 μL dyrket PIB bouillon (for 15 mm x 100 mm plader) eller 450 μL bouillon (for 15 mm x 150 mm plader). Brug en steril cellespreder, sprede bouillon over pladen. Pladen dyrkes ved 37 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Aspirere eventuelle overskydende væske fra pladen ved hjælp af en pipet ved at vippe pladen til den ene side. Både PIB- og PIA-plader, der anvendes i protokollen, indeholder 20 ml glycerol, der anvendes af celler som kulstofkilde til støtte i alginatproduktionen. - Ved hjælp af en pipetteregulator og en steril 50 ml pipette tilsættes 0,85% NaCl til plænen dyrket og opsaml prøven ved at kassere pladen ved hjælp af en cellespreder. Aspirere prøven ved hjælp af en frisk 50 ml pipet i en 50 ml indsamling rør. Vortex prøven på høj til at blande og placere prøverne på is.
BEMÆRK: Mængden af tilsat 0,85% NaCl varierer afhængigt af pladens størrelse. Brug 10−30 ml til 15 mm x 100 mm plader, og brug 20−50 ml til 15 mm x 150 mm plader. - Fyld den optiske massefylde til 600 nm (OD600)af prøverne ved at tilføje 1 ml prøve til en engangscuvette og aflæse OD ved hjælp af et spektrofotometer. Gentag dette trin 2x for at opnå en treeksemplarer af læsninger for hver prøve.
- Tilsæt 3 ml svovlsyre/boratopløsning i kulturrør og lad sidde på is. Der tilsættes 350 μL af den opsamlede prøve LANGSOMT til syreblandingen i reagensglasog vortex på lav kort.
- Forbered borat lager ved at tilføje 10.099 g kalium hydroxid (KOH) pulver til 45 ml vand. Der tilsættes 24,74 g borsyre (H3BO3)til blandingen og tilbring volumen til 100 ml.
- Placer 1 L flaske i en vask med is og fyld flaske med 500 ml koncentreret svovlsyre. LANGSOMT tilføje 15 ml af den forberedte borat bestand. Lad flasken køle af.
- Tilføj yderligere 10 ml borat lager for i alt 25 ml. Når flasken er afkølet, skal du bringe lydstyrken til 1 L.
FORSIGTIG: Denne metode er afhængig af anvendelse af stærkt koncentreret svovlsyre. Der bør anvendes passende personlige værnemidler for at sikre prøvens sikkerheds- og bortskaffelsesprotokol.
BEMÆRK: For en positiv kontrol høstes og rensede en kendt koncentration af D-mannuroon og/eller kendte bakterielle alginatprøver, der er høstet og renset ved alginatproducerende stammer af P. aeruginosa (f.eks.: PAO581-PAO1mucA25). For en negativ kontrol brug 0,85% NaCl opløsning og / eller PAO1ΔalgD (In-frame sletning af algD-gen, der gør bakterierne helt ude af stand til at producere alginat). Der kan fremstilles flere rør fra hver prøve for at øge antallet af tekniske gentagelser til støtte i statistisk analyse. Der fremstilles 3−5 rør af hver prøve.
- Der tilsættes 100 μL på 0,1% carbazole i ethanolopløsningen til syre-/prøveblandingen. Tæbog vortex på medium indstilling til 5 s. Placer i et tørt bad ved 55 °C i 30 min.
- Efter inkubation, fjerne rørene og vortex kort på høj og lad det køle i 5 min.
BEMÆRK: Farve, der skal ses ville være en nuance af lilla. Farven forbliver stabil til måling i 1−2 timer. - Od530 af hvert rør ved at tilføje 1 ml af blandingen til en ren cuvette og aflæse OD af prøverne på 530 nm på et spektrofotometer. Brug røret med 0,85% NaCl som en tom til spektrofotometeret.
- Der fremstilles en standardkurve ved at måle OD530 af serielle fortyndinger af kendte koncentrationer af D-Mannuroon (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml). Gentag 2x. Uddrag en lineær ligning fra disse aflæsninger.
BEMÆRK: Standardkurven skal kun udføres én gang. Den lineære ligning udvundet af det kan bruges til senere test.- Alginatens koncentration i hver prøve beregnes ved hjælp af standardkurven, og alginatkoncentrationen fordeles fra lineær ligning med OD600 for at opnå den samlede mængde alginat pr.OD 600.
3. ELISA for Alginat quantitation
- Gentag trin 2.1−2.4 for at få prøver til alginatmåling.
BEMÆRK: Anvendte stammer var PAO1, PAO1ΔalgDog PAO1 med pHERD20T-algU. - Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 50 μL af den indsamlede prøve til en ubehandlet 96-brøndsplade. Der tilsættes 50 μL belægningsbuffer (karbonat/bikarbonat buffer pH 9.6) til brøndene. Inkuber pladen ved 37 °C i 2 timer.
BEMÆRK: For at sikre en positiv kontrol kan der anvendes en kendt koncentration af D-mannuroonog/eller en kendt stabil alginatproducerende stamme (f.eks. For en negativ kontrol brug 0,85% NaCl opløsning og / eller PAO1ΔalgD (in-frame sletning af algD-gen et gør bakterierne helt ude af stand til at producere nogen alginat). Der kan fremstilles flere brønde fra hver prøve for at øge antallet af tekniske gentagelser til støtte i statistisk analyse. Forbered 3−5 brønde af hver prøve. - Ved hjælp af en sprøjteflaske vaskes pladebrøndene 2x med 1x fosfatbuffersaltvand (PBS) med 0,05% Tween 20 (PBS-T) ved at fylde brøndene og derefter dræne dem ved at vende pladen over.
- Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 200 μL blokeringsbuffer (10% skummetmælk i PBS-T) til brøndene. Inkuber ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Wrap plade i paraffin film eller krympe wrap for at hjælpe med at undgå fordampning i køleskabet. - Ved hjælp af en sprøjteflaske vaskepladen brønde 2x med PBS-T ved at fylde brønde, og derefter dræne dem ved at vende plade over.
- Ved hjælp af et mikropipette tilsættes 100 μL fortyndet primært antistof (mus anti-alginatmonoklonalt antistof) til brøndene og inkubatet ved 37 °C i 1−2 timer.
BEMÆRK: Det primære antistof (mus antialginatmonoklonalt antistof) blev leveret ved en koncentration på 0,5 μg/ml (fortynding af 1:2.000 1 mg/ml lager) i antistoffortyndingsopløsning (1% skummetmælk i 1x PBS). - Ved hjælp af en sprøjteflaske vaskepladen brønde 3x med PBS-T ved at fylde brønde, og derefter dræne dem ved at vende plade over.
- Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 100 μL fortyndet sekundært antistof til brøndene og inkuberved 37 °C for 1−2 h.
BEMÆRK: Sekundært antistof anvendt var gennemboregeantimusepoly-HRP-antistof til en koncentration på 0,25 μg/ml (fortynding af 1:2.000 0,5 mg/ml lager) i antistoffortyndingsopløsning. - Ved hjælp af en sprøjteflaske vaskepladen brønde 3x med PBS-T ved at fylde brønde, og derefter dræne dem ved at vende plade over.
- Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 100 μL TMB-ELISA-opløsning (Materialetabel)og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
BEMÆRK: Farven på en positiv reaktion ville være en nuance af blå. - Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 100 μL stopopløsning (2 N svovlsyre).
BEMÆRK: Farven bliver fra blå til gul, når stopløsningen tilføjes. Farven er stabil i op til 30 minutter, efter at reaktionen er stoppet. - Ved hjælp af en pladelæser skal du læse OD'en på 450 nm.
- Der fremkommer en standardkurve ved at måle OD450 af serielle fortyndinger af kendte koncentrationer af D-Mannuroonsyre (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml). Gentag 2x. Fra disse aflæsninger udtrække en lineær ligning.
BEMÆRK: Standardkurven skal kun udføres én gang. Den lineære ligning udvundet af det kan bruges til senere test.- Alginatens koncentration i hver prøve beregnes ved hjælp af standardkurven, og alginatkoncentrationen fordeles fra lineær ligning med OD600 for at opnå den samlede mængde alginat pr.OD 600.
4. Statistisk analyse af alginatmåling
- I et grafisk softwareark skal du angive en kolonne med den lineære ligning, der er afledt af standardkurven. Indstil y-aksens resultater som alginatkoncentrationen og x-aksens resultater som OD530 for uronsyreanalyse og OD450 for ELISA for at opnå alginatkoncentrationerne i hver prøve.
- For at normalisere alginatmængden i hver prøve til mængden pr. 5,5 x108 CFU/ml (1 OD600)opdeles koncentrationen af hver prøve, der er opnået ovenfor, med den senesteOD 600-værdi. Hvis der blev målt flere OD600 for hver prøve, skal du dividere med den gennemsnitlige OD600.
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af foretrukken statistisk software (f.eks. GraphPad Prism 7.02).
- Åbn softwaren. Vælg Kolonne under Ny tabel og graf, og vælg det envejsANOVA-datasæt.
- Navngiv hver kolonne med den testede stamme, og tilsæt alginatkoncentrationerne nedenunder.
- Når du har indtastet alle data, skal du klikke på Analysér i den øverste menu. Dette åbner et analyseindstillingsvindue. Vælg de relevante parametre til test, og angiv, om der skal køres flere sammenligninger.
BEMÆRK: Efter analyse vil datasættet indeholde en p-værdi, der kan hjælpe med at bestemme dataenes statistiske betydning. Data vil blive betragtet som statistisk signifikante, hvis p-værdien er mindre end den indstillede α-værdi (normalt er α-værdien fastsat for p < 0,01). - Vælg søjlediagramtypen under fanen Graf. Dette vil automatisk kortlægge dataene med den angivne titel fra inputdataarket. Angiv statistisk signifikans af dataene efter behov ved at vise symbolet * over bindelinjer mellem interesselinjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser plader af PAO1 og PAO581 med eller uden sletning i rammen i pyrdgenet (et gen i pyrimidinbiosyntesevejen), som resulterer i SCV6. PAO1 SCV mutanten blev genoprettet til normal vækst som reaktion på uracil tilskud (figur 1A,B). Desuden blev PAO581ΔpyrDSCV-mutanten returneret til slimhinde med samme uracilbehandling, fordi moderstammen PAO581 har en yderligere mucA25-mutation (figur 1C,D). Resultaterne for den uronsyrecarbazoleassay er vist i figur 26. Dataene repræsenterer prøver af PAO581 og PAO581 med mutationer i gener, der regulerer pyrimidin de novo biosyntese dyrket på PIA og PIA suppleret med 0,1 mM uracil (figur 2A). Dataene viser, at tilstedeværelsen af uracil i medierne resulterer i konvertering af den mutante stamme tilbage til slimhinde (set ved den øgede/restaurerede alginatproduktion) (figur 2B). Resultaterne for det antialginatmonoklonale antistofbaserede ELISA er repræsenteret i figur 3. Dataene viser PAO1, PAO1 med en in-frame sletning af algD-genet, der koder nøglen alginat biosyntetisk enzym BNP-mannose dehydrogenase, og PAO1 bærer et udtryk plasmid pHERD20T med de vigtigste alginat-specifikke sigma faktor algU når dyrkes på PIA plader med arabinose til induktion pBAD promotor i pHERD20T. Disse data viser de ikke-mucoid-niveauer af alginat målt for PAO1 og PAO1ΔalgD versus de mucoid-niveauer af alginat målt for PAO1+pHERD20T-algU. Figur 4 sammenligner de to metoder til alginatmålinger sammen. Resultaterne var ikke statistisk signifikante sammenlignet med hinanden ved hjælp af en tovejs ANOVA med p < 0,01. Figur 5A sammenligner krydsreaktiviteten af anti-alginat mAb med andre polysaccharider, herunder amylopectin, amylose, kollagen og glykogen. Figur 5B viser sammenligningen i specificitet og følsomhed af den uronsyre carbazole assay til den nyudviklede anti-alginat monoklonale antistof-baserede ELISA med kontrol udnytte den meget rensede tang alginat ( Tabelover materialer). Figur 6 viser direkte test ning af ELISA på patientspytumprøver, der var positive for mucoid P. aeruginosa og patienter, der ikke indeholdt mucoid P. aeruginosa.
Figur 1: Repræsentative billeder af biosyntese mutationer af de novo pyrimidinbiosyntese, der resulterer i SCV-fænotype i PAO1 og PAO581. Billedet viser PAO1 (til venstre) og PAO1ΔpyrD (til højre) på PIA-plader (A) og PIA-plader suppleret med uracil (B) dyrket ved 37 °C for 48 h. Billedet viser PAO581 (venstre) og PAO581Δpyrd (højre) på PIA-plader (C) og PIA-plader suppleret med uracil (D) dyrket ved 37 °C i 48 timer. Dette tal er blevet ændret fra al Ahmar et al.6' arbejde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ graf over uronsyre carbazole assay. (A) Billedet af mucoid P. aeruginosa stamme PAO581 (PAO1mucA25)dyrket ved 37 °C for 24 timer på PIA plader (venstre) og PIA plader med uracil (højre). b) Alginatproduktion for PAO581, PAO581carA,PAO581carBog PAO581pyrD, når den dyrkes på PIA-plader med og uden uracil ved 37 °C for 24 h. Alginat blev indsamlet og målt ved hjælp af standardcarbazoleassay. De viste værdier er gennemsnitlig alginat ± standardafvigelse af treeksemplarer læsninger. (**** = p < 0,0001). Dette tal er blevet ændret fra al Ahmar et al.6' arbejde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ graf over anti-alginat mAb-baseret ELISA. Alginatproduktion til PAO1, PAO1ΔalgD og PAO1 med udtrykket vektor pHERD20T-algU dyrket på PIA med 0,1% arabinose ved 37 °C i 24 h. Alginat blev indsamlet og målt ved hjælp af anti-alginat ELISA med musen anti-alginat monoklonal antistof. De viste værdier er gennemsnitlig alginat ± standardafvigelse af treeksemplarer læsninger. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning mellem resultaterne fra uronsyreanalyse og antialginat mAb-baseret ELISA. Alginatproduktion fra fem forskellige mucoid P. aeruginosa proprietære stammer dyrket på PIA plader ved 37 °C i 24 timer. Alginat blev indsamlet og målt ved den uronsyre analyse og anti-alginat ELISA. De viste værdier er gennemsnitlig alginat ± standardafvigelse af treeksemplarer læsninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Specificitet og følsomhed af anti-alginat mAb baseret ELISA i forhold til den uronsyre carbazole assay. A) ELISA blev kørt med høj (800 μg/ml) og lav (100 μg/ml) intern analyse kontrol af tang alginat. Denne alginat blev også brugt som standard for ELISA. Andre polysaccharider testet, der kan krydse reagere med anti-alginat mAb var amylopectin, amylose, kollagen, og glykogen (500 μg/mL hver). (B) Uronsyrecarbazoleassay og ELISA blev drevet med samme interval af standardkoncentrationer med tangalginat: 50 μg/ml, 5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,05 μg/ml. De viste værdier er gennemsnitlig alginat ± standardafvigelse af treeksemplarer læsninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Direkte patientprøvetest. Anti-alginat ELISA blev testet på patienternes spytprøver uden forudgående vækst på plader. Tre CF-spytprøver, der havde vækst af mucoid P. aeruginosa blev brugt samt to patientspytprøver, der indeholdt enten ikke-mucoid P. aeruginosa (Neg 1) eller ingen P. aeruginosa vækst (Neg 2). De viste værdier er gennemsnitlig alginat ± standardafvigelse af treeksemplarer læsninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både SCV og alginat er vigtige sygdommarkører involveret i flere kroniske infektioner. Derfor er evnen til at dyrke SCV samt studere regulering og produktion af alginat af P. aeruginosa er en integreret del af opdagelsen af nye behandlinger for disse kroniske sygdomme.
SCV stammer er notorisk vanskelige at vokse på grund af deres langsomme vækstrate4 i forhold til andre P. aeruginosa stammer, som hjælper i deres antimikrobielle resistens3. Vores arbejde identificerer en særlig form for P. aeruginosa SCV, der er et resultat af mutationer i de novo pyrimidin biosyntese. Her diskuterer vi en vækstbetingelse for en sådan SCV at vende tilbage til en normal vækst fænotype, når nukleoside uracil leveres. Men da UMP/UTP blev føjet til mediet, blev den defekte vækst ikke genoprettet (data blev ikke vist). Den eller de poriner, der er ansvarlige for denne selektivitet, skal undersøges nærmere. Tilskud af vækstmedier med uracil hjulpet med at lindre stress forårsaget af pyrimidin sult (figur 1). På samme måde er tilsætning af fri cytosin til medierne i samme metode til sætning af uracil, hjulpet i relief af pyrimidin sult (data ikke vist). Både gratis uracil og gratis cytosin i medierne kommer ind i cellerne og hjælper med at returnere de normale niveauer af uridinmonphosphat (UMP) og uridine trifosfat (UTP)6 i cellen, hvilket er, hvordan SCV isolerer tilbage til normal vækst.
Der findes flere kritiske trin til alginatmålingerne, som kan hjælpe med at reproducerbarhed af resultaterne. I første omgang skal prøverne efter at være blevet kasseret fra pladerne forblive på is for at hjælpe med at blokere nedbrydningen af alginat i prøven og resultere i lavere målte koncentrationer. Før OD600-målinger er det desuden vigtigt at blande prøven grundigt for at opnå en homogen opløsning, da klumper dannes i prøver, der har siddet et stykke tid, og som kan forstyrre OD-målingen og dermed med de endelige koncentrationsberegninger. Når du bruger ELISA-metoden, kan det være nødvendigt at fortynde prøver fra vækstplader, især når der anvendes stammer, der producerer en stor mængde alginat, da resultaterne kan være uden for standardkurveområdet. Ved brug af den uronsyre, grundigt vortex kulturrørene efter tilsætning af carbazole og efter inkubationen for at sikre en homogen prøve. Når du arbejder med den uronsyre analyse, er det vigtigt at være forsigtig, når håndtering af syre blandingen og bortskaffe prøverne korrekt.
Den traditionelle metode til måling, der kræver syrehydrolyse af alginat beskrevet ovenfor har vist stort potentiale og er blevet udnyttet af mange forskere i flere år. I dette arbejde viser vi proceduren for den traditionelle analyse sammen med en internt udviklet ELISA ved hjælp af et anti-alginat monoklonalt antistof. Disse antistoffer blev udviklet i mus og kan genkende alginat på en endnu ikke identificeret epitope. ELISA-metodens specificitet blev grundigt testet mod alginat fra P. aeruginosa samt fra tang. Desuden var ELISA sammenlignelig med den uronsyreanalyse, der kvantificerede alginat i testede bakterieprøver (figur 3). Desuden blev det testet mod andre polysaccharider, der kan resultere i falske positive resultater. Vores arbejde viste en høj specificitet af antistoffet til at alginat og dets evne til at skelne mellem alginat og de andre testede polysaccharider(figur 5A). ELISA-protokollen har større følsomhed i forhold til den uronsyreanalyse (figur 5B), da vi var i stand til at påvise sporniveauer af alginat ved hjælp af ELISA, som ikke blev opdaget ved hjælp af uroonsyreanalysen ved test af patientspytprøver (figur 6). ELISA-metoden kan tilpasses til in vivo-måling af alginat fra patienternes spyt (figur 6). Både vækstbetingelser ved hjælp af uracil tilskud samt den nyudviklede ELISA ville være kraftfulde værktøjer til bedre at forstå P. aeruginosa patogenese i CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Hongwei D. Yu er Chief Science Officer og medstifter af Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C.
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
