Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.
Abstract
A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.
Introduction
As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de pacientes humanos fornecem novos insights sobre várias doenças. Além disso, progenitor e células diferenciadas derivadas de hESCs podem ser úteis para pesquisas envolvendo terapia com células-tronco e triagem de medicamentos1,2,3,4.
hESCs podem ser induzidos a se diferenciar em células progenitoras neurais (NPCs), que são células multipotenciais com uma extensa capacidade de auto-renovação. Posteriormente, essas células podem ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos5,6. Npcs também oferecem um sistema celular para estudos in vitro de biologia do neurodesenvolvimento e várias doenças neurológicas. No entanto, os métodos atuais de cultura do tipo colônia envolvendo hESCs e sua diferenciação em NPCs são ineficientes e muitas vezes envolvem cocultura, bem como o corpo embrionário (EB) e formação de rosetas5,7,8,9. Esses protocolos apresentam menores taxas de sobrevida e diferenciação espontânea e são mais demorados.
Apresentado aqui é um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável e usa cultura de alta densidade tipo unicelular de hESCs10. A inclusão do inibidor roh-kinase (ROCK) contribuiu para aumentar significativamente a eficiência de sobrevivência durante a cultura do tipo unicelular do hESC10,11,12,13,14. Neste sistema de cultura, hESCs podem ser facilmente mantidos e expandidos. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para gerar NPCs a partir da cultura do tipo unicelular de hESCs, que permite a produção de NPCs altamente puros. Inibição de BMP/TGFβ/activin sinalização vias com inibidores alk eficientemente induzir diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs15,16, que então pode ser induzido a se diferenciar em linhagens neurais funcionais, tais como neurônios dopaminérgicos e astúcias.
Em resumo, o protocolo de cultura do tipo unicelular usando hESCs oferece um modelo atraente para estudar a diferenciação dessas células em várias linhagens, incluindo NPCs. Este protocolo é facilmente escalável e, portanto, adequado para a geração de células para pesquisas envolvendo terapia regenerativa e triagem de medicamentos.
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Protocol
1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana de porão qualificadas por hESC
- Descongele lentamente a matriz de membrana de porão qualificada ao hESC (ver Tabela de Materiais)solução em 4 °C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel.
- Para preparar placas revestidas de matriz de membrana de porão, diluir matriz em DMEM/F12 a frio para uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da solução de matriz diluída.
- Incubar as placas revestidas de matriz de membrana do porão à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 3 h ou a 4 °C durante a noite.
NOTA: Placas com matriz de membrana de porão podem ser armazenadas a 4 °C por 1 semana antes que a solução da matriz seja removida e as placas sejam usadas.
2. Adaptação de hESCs tipo colônia para cultura hESC unicelular
- Para passar as culturas livres de alimentador do tipo colônia H9 (WA09) hESCs cultivadas na matriz de membrana do porão, aspirar o meio dos poços (Figura 1A)9.
- Lave 1x com 1 mL de DPBS. Adicione 1 mL de solução dispase (1 U/mL) por poço e incubar a 37 °C por 20 min.
- Retire a dispase, lave as células 1x suavemente com 2 mL de DMEM/F12, retire o meio e adicione 2 mL de DMEM/F12 a cada prato.
- Delicadamente separar colônias por suavemente tubulação para cima e para baixo e transferir para um tubo de 15 mL.
- Centrífugaas as pelotas para 2 min em 370 x g e aspiram o meio.
- Para dissociar as pelotas celulares em células individuais, adicione 2 mL de solução de desprendimento celular (concentração de 1x, ver Tabela de Materiais)e incubar a 37 °C por 10 minutos.
- Células centrífugas por 2 min a 370 x g e remover a solução de desprendimento.
- Adicione o mTeSR1 médio humano esc fresco e dissociar as células em células individuais por tubulação suave para cima e para baixo.
- Para adaptar os hESCs do tipo colônia a uma cultura do tipo unicelular, placa de aproximadamente 1,5-2,0 x 106 hESCs em cada poço da placa de 6 poços revestida smatrea de membrana do porão em 2 mL de mTeSR1 contendo 10 μM inibidor DE ROCHA por 24 h (Figura 1A).
- Após 24 h, substitua o meio hESC por mTeSR1 fresco sem inibidor DE ROCHA e permita que os hESCs cresçam como um tipo unicelular por 3 dias. Mude o meio diariamente.
- No dia 4, quando as culturas atingem quase 100% de confluência, dissociam as células em solução de desprendimento e, em seguida, reformulam conforme descrito no passo 2.6.
NOTA: O inibidor da ROCHA melhora a sobrevivência celular durante os 24 h iniciais da cultura hESC do tipo unicelular.
3. Formação embrionária do corpo e diferenciação em três camadas germinas(Figura 2)
- Para formar EBs, primeiro resuspender as células em 3 mL de mTeSR1 médio com inibidor de ROCHA 10 μM durante as primeiras 24 h, em seguida, incubar durante a noite em 60 milímetros pratos de baixa fixação em uma incubadora de 37 °C para permitir a gregação.
- Após 24 h, os pequenos EBs são transferidos para um tubo de 15 mL. Deixe os EBs resolver até o fundo do tubo e retire suavemente o meio com uma pipeta. Transfira EBs para o meio EB (nocaute-DMEM complementado com substituição de soro de 20% por nocaute, suplemento de glutamina 1x [ver Tabela de Materiais],1% NEAA [aminoácidos não essenciais; ver Tabela de Materiais], e 0,2% β-mercaptoetanol) e permitir-lhes expandir em pratos de baixa fixação por 7 dias. O meio pode ser alterado a cada dois dias, conforme descrito acima (Figura 2A).
- No dia 7, recolher os EBs dos pratos e transferi-los para um tubo de 15 mL. Retire suavemente o meio com uma pipeta e transfira os EBs para uma placa de 6 poços revestida de matriz de membrana do porão.
- Permita que os EBs se anexem à placa e incubam por 12 dias no meio eb, durante os quais eles se diferenciarão nas três camadas germinas(Figura 2B). Mude o médium a cada dois dias.
NOTA: Durante a agregação de células, o prato de baixa fixação ajuda a evitar o apego EB.
4. Diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs(Figura 3)
- Para induzir a diferenciação de NPC, dissociar hESCs do tipo unicelular com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubação de 10 min a 37 °C.
- Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de DMEM/F12 e resuspenda as células por tubulação suave.
- Células de placa em uma placa de 6 poços revestidas de matriz de membrana do porão a uma densidade de 2 x 105 células/poço em 2 mL de mTeSR1 contendo inibidor de ROCHA de 10 μM.
- Após 24 h, substitua o meio de cultura pelo meio de indução neural (DMEM por 1% B27 menos vitamina A) complementado por 1 μM dorsomormorfina e 5 μM SB431542.
- Mude o meio a cada dois dias durante os primeiros 4 dias de indução neural, em seguida, todos os dias até chegar a confluência no dia 7(Figura 3B).
NOTA: (1) Dorsomorphin inibe a via BMP, visando ALK2,3,6 receptores e também inibe AMPK; SB431542 é um inibidor da via TGFβ/Activin, visando ALK5,7. (2) O mesmo protocolo foi testado com outra linha ESC (WA01), que produziu resultados semelhantes aos WA0916. (3) Nós usamos geralmente Matrigel para a matriz da membrana do porão; no entanto, as células podem ser cultivadas em Geltrex e, em seguida, diferenciadas em NPCs com resultados muito semelhantes, como indicado pela expressão de vários marcadores npc (Figura 4D,E). Lidar com Geltrex da mesma forma que Matrigel (ver seção 1).
5. Expansão npc e criopreservação
- Após 7 dias de indução neural, dissociar as células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar para 10 min em 37 °C.
- Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de npc expansão média (ver tabela de materiais)e resuspender as células por tubulação suave.
- Placa 1 x 105 células em 2 mL de npc de expansão média em membrana do porão matriz revestida 6 placas de poço.
- Passagem npcs várias vezes, conforme necessário, quando as culturas atingem quase 90% de confluência. Durante as primeiras passagens 3-4, adicione 10 μM inibidor de ROCHA durante as 24 h iniciais para prevenir a morte celular. Após essas passagens, as células podem ser passagens e cultivadas sem inibidor de ROCHA. Mude o meio a cada dois dias durante a expansão.
- Criopreservar NPCs quando as culturas atingem a confluência.
- Para criopreservação, dissociar as células em 1 mL de solução de desprendimento (1x) para 5 min a 37 °C, em seguida, suspensão centrífuga por 2 min em 370 x g para remover a solução de desprendimento.
- Adicione a solução de congelamento celular (ver Tabela de Materiais)para NPCs dissociados em 1 x 106 células/mL e distribua 1 mL alíquotas para crioviais.
- Coloque os crioviais em recipiente de congelamento e armazená-los durante a noite em um freezer -80 °C.
- Guarde os crioviais no nitrogênio líquido.
6. Preparação de placas revestidas poli-L-ornitina (OLP) e Laminin
- Para preparar placas revestidas de OLP/laminina, diluir a solução de estoque da OLP em PBS ou água para uma concentração final de 10 μg/mL. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de OLP diluída.
- Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
- Lave cada poço com PBS.
- Diluir a solução de estoque de laminina em PBS frio ou água em 10 μg/mL. Misture bem a solução de laminado. Retire o PBS e revestir imediatamente cada bem com 1 mL da solução de laminado. Mantenha as placas a 4 °C e use dentro de 1 semana. Lave com PBS e adicione imediatamente o meio da cultura.
NOTA: Não deixe que as placas revestidas de OLP/laminina sequem.
7. Diferenciação de NPCs derivados do hESC em neurônios dopaminérgicos(Figura 6A)
- NPCs de placa em plo/pratos revestidos de laminina em meio de expansão npc em uma densidade de aproximadamente 50%.
- Após 24 h, mude o meio para o meio DA1 (médio neurobasal contendo suplemento de glutamina 2 mM, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH e 100 ng/mL FGF8) e mude o meio a cada dois dias.
- Culturas de passagem quando atingem a confluência. Dissociar células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar por 10 min a 37 °C.
- Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de da1 médio e resuspender as células por pipetting suave.
- Placa 1 x 105 células em 2 mL de da1 médio em PLO/ laminado revestido 6 placas de poço.
- Após 10 dias, alteração para da2 médio (médio neurobasal contendo 2 mM suplemento de glutamina, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM ácido ascórbico, 20 ng/mL BDNF, e 20 ng/mL GNDF) e mudar médio a cada dois dias por mais 20 dias (Figura 6A).
NOTA: Adicione o ácido ascórbico fresco diariamente ao meio DA2. Nos primeiros 14 dias, as células diferenciadas devem ser passadas quando atingem 90% de confluência, mas não mais depois disso.
8. Diferenciação de NPCs derivados do ESC em Astrócitos
- Células progenitoras neurais de placa em placas revestidas de OLP/laminina no meio de expansão do NPC a uma densidade de aproximadamente 50%.
- Após 24 h, mude o meio para o meio astrocito (dmem/f12 médio incluindo 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin β-1, e 8 ng/mL bFGF) e alterar o meio a cada dois dias.
- Culturas de passagem quando atingem a confluência. Dissociar células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar por 10 min a 37 °C.
- Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de médio astrócito e resuspender as células por pipetting suave.
- Placa 1 x 105 células em 2 mL de meio de astrócito em PLO/estratificação revestida de 6 pratos bem.
- Permitir que a diferenciação continue por um total de 5-6 semanas(Figura 6B).
9. Mancha de imunofluorescência
- Células culturais em 35 mm μ-pratos como descrito acima para cada tipo de célula. Aspirar o meio e adicionar 1 mL de 4% pfa solução por prato e incubar por 20 min em RT.
- Lave 2x por 5 min com PBS.
NOTA: Uma vez que as células são fixas, as placas de ensaio podem ser seladas com parafilme e armazenadas a 4 °C. Mancha com um anticorpo dentro de 1 semana após a fixação. - Adicione 300 μL de solução de bloqueio (soro de cabra ou burro na PBS) por prato e incubar em RT por 30-60 min.
- Lave o prato 2x com PBS por 5 min.
- Adicione 300 μL de anticorpo primário (Tabela 1)solução (diluída em solução de bloqueio) e incubação em RT para 1,5 h ou durante a noite em 4 °C.
- Lave 2x com PBS por 10 min.
- Adicione 300 μL de anticorpo secundário fluorescente conjugado(Tabela 1)na solução de bloqueio e incubação no escuro por 1 h na RT.
- Lave as células 2x por 10 min com PBS.
- Adicione a solução de coloração Hoechst (1 μM concentração final em PBS) para manchar núcleos. Incubar as células no escuro por 5 min em RT.
- Lave as células 1x com PBS por 5 min e, em seguida, adicione 500 μL de PBS. Mantenha os pratos no escuro, em seguida, observar a fluorescência com um microscópio confocal (Figura 2B, Figura 5C, Figura 6A,e Figura 7B).
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Representative Results
Apresentado aqui é um protocolo melhorado para a manutenção e expansão da cultura do tipo unicelular de hESCs e sua diferenciação eficiente em células progenitoras neurais, que posteriormente se diferencia em várias linhagens neurais a jusante, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos.
Imagens representativas de contraste de fase mostram morfologia celular em diferentes etapas durante a adaptação de hESCs tipo colônia para a cultura do tipounicelular( Figura 1A). Através da condição de cultura unicelular, verificou-se que os hESCs adaptados foram capazes de ser mantidos em alta densidade, então facilmente e eficientemente subculturados ao atingir a confluência (Figura 1A,B). Essas células mantiveram as características do ciclo celular (ou seja, uma fase G1 curta e alta proporção de células em fase S) típicas de hESCs tipo colônia(Figura 1C,D). Eles também expressaram os marcadores ESC (ou seja, OCT4, TRA 1-81, SOX2 e NANOG) em níveis comparáveis aos dos hESCs tipo colônia, como indicado por QRT-PCR e análise de imunocoloração (Figura 7, Tabela 2). Além disso, foi demonstrado que hESCs unicelulares foram capazes de formar corpos embrionários contendo células de todas as três camadas germinas: endoderm (expressão SOX17), mesoderme (expressão de SMA) e ectoderm (expressão tuj-1) (Figura 2).
Em seguida, foi demonstrado que hESCs tipo unicelular eficientemente diferenciados em células progenitoras neurais usando um protocolo NPC (Figura 3A), como indicado pela perda de morfologia hESC típica e aparência de morfologia NPC (Figura 3B)16. A diferenciação do NPC foi apoiada pelo aumento da expressão dos marcadores npc exclusivos (ou seja, SOX1, OTX2, ZIC1 e OTX1; Figura 5A, Tabela 2)e confirmada por imunocoloração e análise FACS. A mesma análise também mostrou que mais de 90% das células manchadas positivas para a proteína SOX1, PAX6 e NCAM (Figura 5B,C). Para examinar a capacidade de NPCs derivados de hESC unicelulares de se diferenciarem em várias linhagens neurais a jusante, a diferenciação dessas células em neurônios e astrócitos dopaminérgicos foi examinada. Como mostrado na Figura 6A,B, NPCs derivados de hESC unicelular foram capazes de se diferenciar em neurônios dopaminérgicos e astrócitos, como indicado pelo aparecimento de morfologias características e expressão de marcadores dopaminérgicos específicos da linhagem (ou seja, TH; Figura 6A) e marcadores de astrócito (ou seja, GFAP e S100B; Figura 6B).
Figura 1: Adaptação de hESCs tipo colônia para cultura do tipo unicelular. (A)Imagens representativas de contraste de fase de culturas unicelulares de H9 hESCs em momentos diferentes após o revestimento em 2% de pratos revestidos de matriz de membrana de porão. Ampliação baixa (esquerda) e alta (direita). Painel superior: imagem representativa de hESCs tipo colônia. Outros painéis mostram imagens representativas de culturas em momentos diferentes durante a adaptação a hESCs do tipo unicelular. Barra de escala = 200 μm. (B) As curvas de crescimento dos H9 hESCs foram monitoradas em placas revestidas de matriz de membrana de porão de 2% com inibidor de 10 μM ROCK para os primeiros 24 h durante a condição de cultura unicelular. (C,D) Análise do ciclo celular do tipo colônia (C)e tipo unicelular (D)H9 hESCs por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Diferenciação in vitro de hESCs adaptados do tipo unicelular em três camadas germinativas. (A)Imagens de fase representativa de corpos embrionários (EB) derivadas do tipo de hESCs unicelulares. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagens imunofluorescentes de hESCs diferenciados analisados para a expressão dos três marcadores diferentes da camada de germes: SOX17 (endoderm), SMA (mesoderm) e Tuj-1 (ectoderm). Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Diferenciação de hESCs do tipo unicelular em células progenitoras neurais por diferenciação direta. (A)Esquemático do protocolo de diferenciação de hESCs em células progenitoras neurais (NPCs). hESCs foram tratados com dorsomorfina (DMH) e SB431542 (SB) 1 dia após o revestimento. (B) Imagens representativas de contraste de fase da morfologia celular durante a diferenciação neural. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: cultura hESC em diferentes produtos de matriz de membrana de porão. (A)hESCs cultivados em Matrigel ou Geltrex exibiram uma capacidade de crescer e diferenciar em NPCs que era semelhante à única cultura celular. As células estavam manchadas com um anticorpo NESTIN. Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 50 μm. (B) hESCs cultivados em Matrigel ou Geltrex mostraram potencial semelhante para se diferenciar em NPCs, como indicado pela porcentagem de células NESTIN e PAX6-positivas. As células foram analisadas por citometria de fluxo no dia 7 de diferenciação de NPC. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Expressão de marcadores de NPC. (A)Após 7 dias de diferenciação neural, a expressão de genes de marcadores NPC (ou seja, OTX1, OTX2, SOX1 e ZIC1) foi analisada pela QRT-PCR. Os valores foram normalizados para GAPDH e calculados em relação aos valores dos hESCs (p < 0,05). (B) A porcentagem de células SOX1- NESTIN-, SOX2-e NCAM-positivas foi determinada pela citometria de fluxo no dia 7 de diferenciação npc. (C)No dia 7 NPC diferenciação, as células foram manchadas com anticorpos contra os marcadores neurais SOX1, NESTIN, NCAM, OTX2 e PAX6. Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Neurônio dopaminérgico e diferenciação astrocícito de NPCs derivados de hESCs do tipo unicelular. (A)Imagem representativa do contraste da fase de neurônios dopaminergic (painel superior). Barra de escala = 100 μm. Células diferenciadas foram manchadas com anticorpos contra o neurônio dopaminérgico marcador TH (hidroxilase tirosina) como indicado. Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 50 μm. (B) Imagem representativa de contraste de fase de astrócitos (painel superior). Barra de escala = 100 μm. Células diferenciadas foram manchadas com anticorpos contra o marcador astrócito GFAP (proteína ácida fibrilária glial) e S100-B (proteína de ligação ao cálcio S100 B), conforme indicado. Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 7: Caracterização de hESCs do tipo de célula única. (A)hESCs adaptados à cultura do tipo unicelular foram analisados para a expressão de marcadores ESC (ou seja, OCT4, NANOG e SOX2) por QRT-PCR. Os valores foram normalizados para GAPDH (p < 0,05). (B) Imagens imunofluorescentes de hESCs manchados para a expressão dos marcadores de pluripotência OCT4, TRA-1-81 e SSEA-1. Os núcleos foram manchados com DAPI. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Anticorpos primários | Espécie | Diluição | Número do catálogo | Empresa |
| 4 DE OUTUBRO | Mouse | 1:1000 | sc-5279 sc-5279 | Santa Cruz |
| TRA 1-81 TRA 1-81 TRA 1-81 | Mouse | 1:500 | sc-21706 sc-21706 | Santa Cruz |
| SSEA-1 SSEA-1 | Mouse | 1:500 | sc-21702 sc-21702 | Santa Cruz |
| SOX1 SOX1 | Cabra | 1:500 | AF-3369 AF-3369 | P&D |
| SOX2 SOX2 | Coelho | 1:1,000 | sc-20088 | Santa Cruz |
| Sma | Coelho | 1:500 | ab-5694 ab-5694 | Abcam Abcam |
| Tuj1 Tuj1 | Mouse | 1:1000 | T8578 T8578 | Sigma |
| NESTIN NESTIN | Mouse | 1:1000 | ab-22035 ab-22035 | Abcam Abcam |
| OTX2 OTX2 | Mouse | 1:250 | ab-21990 ab-21990 | Abcam Abcam |
| hNCAM HNCAM | Mouse | 1:200 | sc-106 sc-106 | Santa Cruz |
| hPAX6 HPAX6 | Mouse | 1:250 | 561664 | Bd |
| TH TH | Mouse | 1:500 | T1299 T1299 | Sigma |
| S100b S100b | Mouse | 1:250 | ab4066 ab4066 | Abcam Abcam |
| GFAP GFAP | Coelho | 1:1,000 | ab7260 ab7260 | Abcam Abcam |
| Anticorpos secundários | ||||
| Anti-rato | Cabra | 1:1,000 | AF 488 ou 647 | Tecnologias da vida |
| Anti-coelho | Cabra | 1:1,000 | AF 488 ou 647 | Tecnologias da vida |
Tabela 1: Anticorpos utilizados na imunocitoquímica e na análise facs.
| Nome Primer | Sequência primer | |
| 4 DE OUTUBRO | F: GGAAGGTATTCAAACG | |
| R: CTCCAGGTTGCCTCTCC | ||
| NANOG NANOG | F: GGTTCCAGAACCATGA | |
| R: ATTGGAAGGTTCCCAGTCG | ||
| SOX1 SOX1 | F: CCTTAGGTTTCCCCTCGCTTTT | |
| R: CAGGCTGAATTCGGTTCTCATT | ||
| OTX1 OTX1 | F: AAGATCAACCTGCCGGAGTCT | |
| R: CGTGAATTGGCCACTGCTTT | ||
| OTX2 OTX2 | F: TGGAAGCACTGTTTGCCAAG | |
| R: TAAACCATACCTGCACCCTCG | ||
| ZIC1 ZIC1 | F: AACCCCAAAAAGTCGTGCAAC | |
| R: TCCTCCCAGAAGCAGATGTGA | ||
| GAPDH GAPDH | F: CCCATCACCATCTTCCAGGAG | |
| R: CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG | ||
Tabela 2: Lista de cartilhas usadas na análise QRT-PCR.
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Discussion
Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia17,18,19,20,21. O protocolo ESC unicelular, que se baseia parcialmente em métodos publicados anteriormente19,20,21,22,gera e mantém culturas hESC do tipo único e impede a cultura do tipo hESC do tipo colônia. Inclui revestimento de célulaúnica de alta densidade, associação multicelular, crescimento de monocamadas e subcultura eficiente (Figura 1). Este último foi alcançado pela adição de inibidor de ROCHA durante as 24 h iniciais da cultura do tipo unicelular de hESCs, o que melhora a sobrevivência celular17,18,19,20,21. Este protocolo é mais facilmente escalável e permite a expansão dessas células para aplicações terapêuticas no rastreamento de drogas e células-tronco.
É ainda demonstrado que hESCs tipo unicelular pode eficientemente diferenciar a linhagem NPC (Figura 3) sem o uso de um estágio intermediário, como EB e formação de roseta23,24,25. A conversão neural elevada dos hESCs do tipo unicelular foi conseguida com a inibição de caminhos de sinalização de BMP/TGFβ/activin pelo tratamento com os inibidores do ALK, dorsomorphin, e SB43154215,16,26. Com este protocolo, os hESCs adaptados do tipo unicelular podem diferenciar eficientemente em NPCs sem a necessidade de formação eB e roseta (Figura 5)e ou ser induzidoa a diferenciar-se em neurônios dopaminérgicos e astrócitos (Figura 6).
Em resumo, a cultura do tipo unicelular de hESCs fornece um sistema rápido e eficiente para estudar os mecanismos moleculares que regulam a diferenciação de vários passos para várias linhagens. Especificamente, este protocolo utilizou NPCs e descreveu sua diferenciação subseqüente em linhagens neurais adicionais, tais como astrócitos e neurônios dopaminérgicos. O protocolo fornece uma plataforma para a produção simples, robusta e escalável de progenitor esquenta e células diferenciadas que podem ser adequadas para estudos básicos, triagem de medicamentos e aplicações em medicina regenerativa.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por sua ajuda na análise facs. Esta pesquisa contou com o apoio do Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, dos Institutos Nacionais de Saúde, Z01-ES-101585 à AMJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
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