Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica

Il trascrittoma rappresenta l'insieme completo di trascrizioni dell'acido ribonucleico (RNA) espresse dal genoma di un organismo in un dato momento e in particolari condizioni ambientali e di crescita. Ogni cellula ha il suo trascrittoma individuale, che riflette il suo attuale stato fisiologico e metabolico. Una raccolta di cellule derivate da un tessuto o un organo simile viene utilizzata in un tipico studio del trascrittoma, ma la trascrittomica a cella singola e risolta nello spazio sta diventando popolare¹. Le analisi trascrittomiche iniziano con l'estrazione dell'RNA totale da un tessuto selezionato in un determinato momento e in condizioni di crescita definite. A tale scopo, raccomandiamo l'uso di un metodo appena sviluppato per l'estrazione dell'RNA totale da campioni ad alto contenuto di amido o di zucchero, come i semi di cereali². Il confronto dei trascrittomi tra diversi campioni determina l'identificazione di molecole di RNA con abbondanza diversa. Queste molecole di RNA sono considerate come geni espressi in modo differenziale (DEG). L'abbondanza di trascrizioni derivate da specifici geni marcatori può quindi essere utilizzata per stimare lo stato di sviluppo o determinare la risposta di un organismo alle fluttuazioni ambientali. I geni senza cambiamenti rilevabili nella loro abbondanza di trascrizioni nei punti temporali di sviluppo studiati sono spesso usati come geni di riferimento o di pulizia.

L'RNA viene tipicamente rilevato e quantificato con vari metodi, come il blotting del nord e la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ma gli attuali metodi di transcriptomica ad alto rendimento si basano pesantemente sull'ibridazione dell'acido nucleico utilizzando la tecnologia microarray e il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq). RNA-Seq è molto popolare al momento perché fornisce diversi vantaggi per applicazioni trascrittomiche ad alta velocità effettiva come esaminato altrove^3,4. Anche se una tecnologia più vecchia, la profilazione dell'espressione genica con chip di microarray è ancora ampiamente utilizzata perché è una tecnologia più consolidata, che richiede meno background in bioinformatica. Rispetto all'RNA-Seq, i set di dati generati dagli esperimenti di microarray sono più piccoli e più facili da analizzare. Inoltre, è più conveniente, soprattutto se si tratta di grandi numeri di campione. Nel nostro laboratorio, utilizziamo regolarmente analisi trascrittomiche utilizzando la tecnologia microarray per determinare il ruolo dei centri normativi centrali che governano le reti molecolari e i percorsi coinvolti nella crescita, nello sviluppo e nel metabolismo dei cereali^5,6,7,8,9. Lo usiamo regolarmente anche per condurre studi di profilazione dell'espressione genica a livello di genoma per ottenere una comprensione meccanicistica della risposta dei cereali alle sollecitazioni abiotiche¹⁰, così come nella conduzione dell'associazione trascrittoma (TWAS) e nella mappatura delle collegamenti per identificare i geni responsabili della qualità dei cereali e della nutrizione^11,12. Altri gruppi hanno anche utilizzato la tecnologia microarray nel fornire atlante di espressione genica specifica dello sviluppo in orzo¹³, riso^14,15,^16,sorgo¹⁷e grano¹⁸.

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di fornire una breve sintesi testuale e una descrizione visiva dettagliata del metodo che attualmente impieghiamo nel nostro laboratorio per la profilazione trascrittomica dei cereali utilizzando una piattaforma di microarray Agilent. Si prega di notare che altre piattaforme microarray sono disponibili, ma non saranno coperti in questo metodo. Iniziamo il protocollo presentando una descrizione dettagliata dell'estrazione dell'RNA dallo sviluppo o dalla germinamento di semi di cereali. Sulla base della nostra esperienza, ottenere un trascrittoma di alta qualità e ad alta quantità suscettibile di analisi trascrittomica a valle è spesso il collo di bottiglia quando si utilizzano tessuti di semi di cereali. Abbiamo provato diversi kit di estrazione dell'RNA disponibili in commercio, ma nessuno ha fornito risultati soddisfacenti. Quindi, abbiamo sviluppato un protocollo di estrazione chimica per ottenere un estratto di RNA grezzo che viene poi sottoposto alla purificazione della colonna utilizzando un kit disponibile in commercio. Utilizzando questo metodo, otteniamo regolarmente e riproducibilmente RNA² di alta qualità (Figura 1), che può essere utilizzato per diverse applicazioni a valle per generare un profilo di trascrittoma.

1. Estrazione e purificazione totale dell'RNA

NOTA: Lavorare sempre sotto il cofano del fume in quanto questo metodo comporta l'uso di solventi organici volatili nocivi. Preriscaldare un tubo di microfuge di acqua priva di nuclenonazione in un blocco termico di 50 gradi centigradi prima di iniziare l'esperimento. Questa acqua priva di nuclea sarà utilizzata per eluire l'RNA totale dalla colonna di spin nel passo 1.8.

1. A terra separatamente i campioni, ciascuno con almeno tre repliche biologiche, in una polvere fine utilizzando un mortaio sterilizzato e pestello pre-raffreddati in azoto liquido.
   1. Scoop i campioni in polvere utilizzando una piccola spatola metallica immersa in azoto liquido e posizionare i campioni in polvere in tubi di microfuge senza nucale da 2,0 mL, anch'impolerati in azoto liquido. Conservare immediatamente i campioni nel congelatore a temperatura ultrabassa (-80 gradi centigradi) fino al giorno allocato per l'estrazione dell'RNA in batch (STOP POINT).
      NOTA: I campioni di semi possono essere macinati in polvere fine con o senza dehusking. Per il riso, macinare regolarmente i campioni senza dehusking perché la buccia contiene silice che può aiutare durante il processo di macinazione.
      AVVISO: Questo passo deve essere fatto velocemente e in condizioni strettamente criogeniche. Un'opzione per l'automazione è quella di macinare i campioni utilizzando un mulino a sfera criogenico per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA e il deterioramento della qualità.
2. Ottenere un estratto di RNA grezzo utilizzando circa 200 mg del campione in polvere originale. Aggiungere singolarmente ogni campione a un tubo di microfuge privo di nuclenonleasing contenente 750 pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoetanolo) e 500 - L of phenol:chloroforma:isoamyl (25:24:1).
   1. Mescolare tutti i campioni contemporaneamente per 5 min a temperatura ambiente utilizzando un miscelatore vortice multi-tubo impostato ad alta velocità. Tenere immediatamente tutti i tubi sul ghiaccio per due min.
      AVVISO: Lavorare sempre all'interno della cappa di fumi, soprattutto per tutti i passaggi che coinvolgono fenolo, cloroformio e altri solventi organici. Idealmente, utilizzare un'ampia cofatura a fumi che può ospitare una centrifuga di panchine, mixer vortice, mixer vortice multi-tubo, e mixer rotante multi-tubo.
3. Separare l'estratto di RNA grezzo dai detriti con la centrifugazione a 14.000 x g per 10 min. Eseguire tutti i passaggi di centrifugazione nelle stesse impostazioni per questa sezione.
   1. Trasferire circa 800 l di supernatante su un nuovo tubo di microfuge da 2,0 mL contenente 400 -L di 1,2 M NaCl e 700 -L di isopropanolo. Mescolare delicatamente la soluzione per inversione 5x.
   2. Far precipitare l'RNA incubando in un congelatore regolare (-20 gradi centigradi) o a temperatura ultrabassa (-80 ) per almeno 1 h (o durante la notte).
      STOP o PAUSE point: basta tenere i campioni in normale congelatore -20 sC per mettere in pausa per alcune ore. Per una notte o un punto di arresto più lungo, conservare i campioni in congelatore a temperatura ultrabassa (-80 gradi centigradi).
4. Ottenere un pellet di RNA grezzo con la centrifugazione a 18.800 x g per 15 min. Dopo aver scartato il supernatante, purificare il pellet di RNA grezzo per purificazione colonna utilizzando un Mini Kit (Tabella dei Materiali).
   1. Sciogliere il pellet in un buffer rLT appena preparato di 450 oL (prima dell'uso, aggiungere 100 L di z-mercaptoetanolo per 100 mL di buffer RLT, preparato fresco ogni giorno). Migliorare la dissoluzione di tutti i pellet mescolando tutti i tubi a temperatura ambiente in un mixer vortice multi-tubo per almeno 5 min.
5. Purificare il pellet di RNA disciolto passando attraverso la colonna mini spin viola con un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifuga a temperatura ambiente per 1 min a 9.000 x g e scartare la colonna mini spin viola.
   1. Aggiungete 0,5 di volume di etanolo assoluto (225 gradi) al lisato cancellato nel tubo di raccolta da 2 mL. Mescolare la soluzione utilizzando la stessa punta di plastica pipetting su e giù un paio di volte.
6. Raccogliere l'RNA purificato trasferendo immediatamente la soluzione in una colonna mini spin rosa con un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifuga a 9.000 x g per 15 s per raccogliere l'RNA sulla membrana di silice della colonna di spin min rosa. Scartare il flusso attraverso e lavare l'RNA con 350 l of Buffer RW1 per centrifugazione a 9.000 x g per 15 s.
7. Rimuovere il DNA genomico contaminante aggiungendo 80 luna di DNase diluita 1 (50 litri di d'essere DNase congelati , 350 l di RDD utilizzando il set DNase) direttamente sulla membrana e digerire incubando a temperatura ambiente per almeno 15 min (PAUSE POINT).
   1. Lavare il DNase 1 aggiungendo 350 luna di RW1 e girando verso il basso a 9.000 x g per 15 s. Ripetere due volte, ma questa volta lavare con 500 .L di Buffer RPE. Trasferire in un nuovo tubo di raccolta 2 mL e girare a 9.000 x g per 2 min ad asciugare.
8. Trasferire la colonna di spin essiccata in un nuovo tubo di raccolta senza nuclesio da 1,5 ml. Iniziare il processo di eluizione per l'estratto di RNA purificato aggiungendo 50 -L di acqua priva di nucleasi (preriscaldata a 50 gradi centigradi) e incubando per 3 minuti a un blocco di calore di 50 gradi centigradi.
   1. Dopo l'incubazione, evita reie' l'estratto totale di RNA centrifusando a 9.000 x g per 1 min.
9. Determinare la quantità e la qualità dell'estratto totale di RNA eseguendo diluizioni appropriate (di solito 1:10) in Nanodrop e BioAnalyzer utilizzando i rispettivi protocolli del produttore. Gli estratti di RNA dovrebbero avere almeno un valore RIN di 8,0 e una concentrazione di 50 ng/L. La Figura 1 mostra un risultato tipico per gli estratti di RNA ottenuti da foglie d'orzo e semi.
   STOP POINT: Conservare i campioni in -80 gradi centigradi fino all'uso.

2. sintesi cDNA seguita dalla trascrizione e dall'etichettatura del cRNA

NOTA: questo passaggio è adatto per l'elaborazione simultanea di 24 campioni. Si suggerisce che l'intero passaggio venga eseguito continuamente in un giorno, ma vengono identificati i punti di stop e pausa facoltativi. Assicurarsi di preriscaldare tre blocchi di calore del tubo di microfuge a 80 , 65 e 37 gradi centigradi prima di iniziare i passaggi seguenti. Queste impostazioni di temperatura verranno modificate come indicato nei passaggi seguenti. Ad esempio, il blocco di calore da 37 gradi centigradi sarà impostato su 40 gradi centigradi dopo la preparazione del Mix di Spike (o se è già stato preparato in precedenza). Preparare un colore Spike Mix, T7 Promoter Mix e cDNA master mix utilizzando il Low Input Quick Amp Gene Expression Labeling Kit (vedi Tabella dei materiali) in base alle istruzioni del produttore. Questa preparazione dipende dalla quantità di estratti di RNA iniziali, che di solito vanno da 10 a 200 ng per l'RNA totale o 5 ng per PolyA RNA. Usiamo abitualmente 50 ng RNA totale come materiale di partenza per l'ibridazione microarray² e per il metodo che verrà descritto di seguito. Nella preparazione di un master mix per 24 campioni, aggiungere 2 reazioni extra per tenere conto delle variazioni di pipettaggio. Utilizzare sempre tubi di microfuge privi di nuclea e acqua priva di nucle in questo passaggio.

1. A causa dell'alta resa, in genere diluire l'estratto di RNA 100 volte per adattarsi all'interno della gamma 50-100 ng. Sulla base dei risultati della quantificazione dell'RNA nella Fase 1.9, effettuare una diluizione di 1:100 aggiungendo 1 L di Estratto di RNA purificato a 99 - L di acqua priva di nucleato in un tubo di microfuge da 1,5 ml. Determinare l'effettiva concentrazione di questa diluizione utilizzando un Nanodrop.
   1. Fare un secondo campione di diluizione di ogni campione totale di RNA in tubo di microfuge da 1,5 ml per fare 50 ng di RNA totale in un volume finale di 1,5 . Conserva tutti i campioni sul ghiaccio.
2. Preparare il mix Spike da in base alle istruzioni del produttore. Questo passo è riassunto anche nel 2019^2. Utilizzare un blocco di calore di 37 gradi centigradi per questo. Conservare la prima e la seconda diluizione dei controlli positivi del mix di picchi monocolore in un congelatore a temperatura ultrabassa (-80 gradi centigradi) e passare solo attraverso otto cicli ripetuti di congelamento/scongelamento.
   1. Preparare la terza e la quarta diluizione fresca ogni giorno. Scongelare e conservare la terza e la quarta diluizione della miscela di picchi sul ghiaccio prima dell'uso.
      NOTA: Quando il Mix di Spike è stato preparato (o se è stato preparato in precedenza, è stata possibile convertire la temperatura del blocco termico da 37 gradi centigradi a 40 gradi centigradi).
3. Preparare il Mix Di promotore T7 e conservarlo sul ghiaccio prima dell'uso. Quanto segue è sufficiente per 24 campioni:
   20,8 l di Promotore T7
   26,0 l di acqua priva di nuclenon
   46,8 l del volume totale T7 Promoter Mix
4. Aggiungete 1,8 l di T7 Promoter Primer Mix (Fase 2.3) in ogni tubo di microfuge contenente 1,5 : l of 50 ng campione di RNA dal passo 2.1. Mescolare correttamente i componenti pipettando più volte. Denaturare il mix modello-primer dell'RNA incubando in un blocco di calore di 65 gradi centigradi per 10 min.
5. Durante la deformazione del mix template-primer (Passaggio 2.4), preriscaldare il 5x First Strand Buffer a 80 gradi centigradi per almeno 4 min. Preparare rapidamente la sintesi cDNA Master Mix dal kit di etichettatura a amplificatore rapido a basso input (vedere Tabella dei materiali)in base alle istruzioni del produttore. Per 24 reazioni è sufficiente quanto segue:
   52,0 l di cuscinetto preriscaldato 5 x Primo Strand (Fase 2.5)
   26,0 Litri di 0,1 M DTT
   13,0 Litri di miscela dNTP da 10 mM
   31,2 - L di RNase Block Mix
   122,2 - L di sintesi cDNA volume totale Master Mix
   1. Scongelare ogni componente sul ghiaccio. Mescolare ogni componente con un leggero pipettaggio. Mantenere il Master Mix a temperatura ambiente prima dell'uso.
      AVVISO: Il mix di blocchi RNase deve essere immediatamente rimesso nel congelatore -20 gradi dopo l'uso.
6. Rimuovere il mix MODELLO-primer dell'RNA sul ghiaccio (Passaggio 2.4) e centrifugare brevemente a temperatura ambiente per far girare giù tutto il contenuto sul fondo del tubo di microfuge. Distribuisci 4,7 l del cDNA Master Mix (Passo 2.5) ad ogni tubo, mescolando accuratamente pipetting su e giù. Il volume totale quando vengono aggiunti tutti i componenti deve essere di 8,0 l.
   1. Sintetizzare il cDNA per 2 h in blocco di calore a 40 gradi centigradi. Durante l'incubazione di 2 h, spostare la temperatura del blocco di calore di 65 gradi centigradi a 70 gradi centigradi in preparazione per l'inattivazione del calore (fase 2,7).
      PUNTO DI PAUSA OPZIONALE: Conservare i campioni a -80 gradi durante la notte. L'esperimento può continuare il giorno successivo dopo l'inattivazione del calore (passaggio 2.7).
7. Incubare ogni tubo in un blocco di calore di 70 gradi centigradi per 15 minuti per inattivare il mix rNase Block. Trasferire immediatamente i tubi sul ghiaccio e incubare per almeno 5 min.
8. Mentre i campioni sono su ghiaccio per 5 min (Passaggio 2.7), preparate rapidamente il Master Mix di trascrizione. Tutti i componenti possono essere combinati a temperatura ambiente, ma i componenti di scongelo sul ghiaccio. Quanto segue è sufficiente per 24 campioni:
   19,5 litri di acqua priva di nuclenon
   83,2 l di 5x Buffer di trascrizione
   15,6 Litri di 0,1 M DTT
   26,0 l di mix NTP
   5,5 l di miscela di polimerasi t7 RNA
   6,2 - L di Cianina 3-CTP (Cy3)
   156,0 l del volume totale Trascrizione Master Mix
   AVVISO: La miscela di polimerasi t7 RNA deve essere conservata nel congelatore -20 gradi centigradi e riposta immediatamente dopo l'uso. Inoltre, Cy3 è sensibile alla luce. Quindi, la miscelazione (passo 2.9) e l'erogazione (Passaggio 2.10) deve essere fatto in condizioni di scarsa illuminazione. Per questo, di solito spegniamo qualsiasi luce direttamente sopra il banco del laboratorio.
9. Poiché i tubi sono stati sottoposti a bruschi riscaldamento e raffreddamento (Fase 2.7), brevemente girare verso il basso il contenuto di ogni campione utilizzando una microcentrifuga per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore di ogni tubo microfuge. Aggiungere 6 - L di Transcription Master Mix (Passaggio 2.8) pipettando delicatamente su e giù. Il volume totale di questa reazione dovrebbe essere di 16 anni. Incubare i tubi a 40 gradi centigradi per 2 h per generare il cRNA con etichetta Cy3.
   OPTIONAL STOP POINT: I tubi possono essere conservati a -80 gradi dopo la trascrizione.
10. Durante la generazione del cRNA (Passaggio 2.9), impostare la temperatura del blocco di calore a 55 gradi centigradi. Aggiungere almeno un tubo di microfuge di acqua priva di nuclesione nel blocco termico. Questa acqua priva di nuclea sarà utilizzata per l'eluizione di cRNA purificato.
11. Dopo la trascrizione e l'etichettatura del cRNA, purificare il cRNA etichettato utilizzando un Kit Mini RNeasy come descritto nel passaggio 3.

3. Purificazione cRNA

1. Purificare il cRNA etichettato utilizzando un RNeasy Mini Kit (vedere Tabella dei materiali). Preparare i buffer in base alle istruzioni del produttore. Ad esempio, Buffer RPE viene fornito nel kit in forma concentrata. Prima dell'uso, aggiungere 4 volumi di biologia molecolare grado etanolo assoluto (96-100%).
2. Aggiungete 84 l di acqua priva di nuclenono ad ogni campione per regolare il volume totale a 100 l. Quindi aggiungere 350 l di Buffer RLT e 250 L di etanolo assoluto ad ogni tubo. Mescolare accuratamente con il pipettaggio.
3. Trasferire 700 l' di ogni miscela su una colonna mini spin con un tubo di raccolta da 2 mL. Raccogliere il cRNA etichettato sulla membrana con la centrifugazione a 4 gradi centigradi per 30 s a 7.534 x g. Scartare il liquido attraverso il flusso.
4. Lavare ogni campione in 500 s. di Buffer RPE. Centrifuga e scartare il flow-through come nel passaggio precedente. Ripetere questo passaggio una volta, quindi passare al passaggio successivo.
5. Trasferire la colonna mini spin in un nuovo tubo di raccolta. Asciugare i campioni per centrifugazione come nel punto 3.3.
6. Trasferire la colonna mini spin in un tubo di microfuge senza nuclesi 1,5 mL fornito con il kit. Elute esogliare ogni campione di cRNA etichettato aggiungendo 30 -L di acqua priva di nuclesiera (preriscaldata a 55 gradi centigradi) direttamente nel filtro della membrana. Migliorare l'eluizione incubando in un blocco termico da 55 gradi centigradi per 60 s.
7. Raccogliere il cRNA etichettato con la centrifugazione a temperatura ambiente per 30 s a 7.535 x g. Eliminare la colonna di spin e chiudere ogni tubo di microfuge. Mettere immediatamente ogni tubo sul ghiaccio.
   OPTIONAL STOP POINT: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi dopo l'eluizione.
8. Quantificare il cRNA con Nanodrop utilizzando la funzione microarray. Impostare il campione su RNA-40. Ottenere i seguenti valori e registrare in un foglio di calcolo: concentrazione di cianine 3 (pmol/L, rapporto di assorbimento dell'RNA (260 nm/280 nm) e concentrazione di cRNA (ng/L).
   STOP POINT: Conservare immediatamente i campioni di cRNA a -80 gradi centigradi dopo la lettura.
9. Calcolare la resa del cRNA e l'attività specifica come descritto in²Pàffeld et al.

4. ibridazione e scansione microarray

NOTA: Questo passaggio richiede solo 3-4 h e quindi l'ibridazione di 24 campioni può essere avviata dopo pranzo. Un operatore può eseguire comodamente fino a 4 vetrini (32 campioni). La mattina del giorno successivo viene assegnata per il lavaggio e la scansione di diapositive microarray. Ulteriori esecuzioni possono quindi essere eseguite nel pomeriggio del secondo giorno. Questo passaggio viene ripetuto fino a quando tutti i campioni vengono ibridati e analizzati. Si consiglia vivamente di utilizzare guanti di lattice senza colore e senza polvere per la manipolazione e l'elaborazione dei vetrini per garantire che i campioni non siano contaminati da pigmenti colorati che possono interferire con le analisi dei microarray. Oltre ai microarray disponibili in commercio, i seguenti array personalizzati sono progettati dal nostro gruppo e disponibili per l'ordine da Agilent: Codice ordine 028827 per Orzo (Hordeumvulgare), 054269 per Riso (Oryzasat subivas. Japonica), 054270 per Riso (Oryzasativa subs. )e 048923 per Il grano (Tricomaestivo).

1. Eseguire l'ibridazione dei microarray utilizzando il Kit di ibridazione gene Expression (vedere Tabella dei materiali). Preparare 10x Blocking Agent secondo le specifiche del produttore². Aliquota 10x Agente di blocco in 200 porzioni L e conservare a -20 gradi centigradi fino all'uso. Ogni aliquota è sufficiente per fino a 40 ibridazioni ed è stabile fino a 2 mesi.
2. Il giorno assegnato per l'ibridazione microarray, scongelare una aliquota 200 di 10 volte l'agente di blocco sul ghiaccio. Inoltre, preriscaldare il forno di ibridazione a 65 gradi centigradi e preriscaldare un blocco di calore a 60 gradi centigradi per l'uso durante la frammentazione del cRNA.
3. Preparare la combinazione di frammentazione per ogni campione come descritto dal produttore². Nel nostro laboratorio, usiamo abitualmente 600 ng di cRNA con etichetta Cy3 amplificato linearmente per l'ibridazione in un microarray da 8 confezioni. In questo caso, l'elenco seguente riepiloga i componenti della combinazione di frammentazione per esempio:
   600 ng di cRNA linearmente amplificato, cianina 3-etichetta
   5 - L di 10 volte L di 10 volte L
   Regolare il volume a 24 gradi con acqua priva di nuclenon
   1 L di 25x Buffer di frammentazione
   25 l del volume totale Fragmentation Mix
   1. Mescolare delicatamente i campioni utilizzando un mixer vortice. Girare brevemente tutti i campioni utilizzando una microcentrifuga.
4. Incubare tutti i campioni nel blocco di calore di 60 gradi centigradi per esattamente 30 min. Raffreddare immediatamente ogni tubo sul ghiaccio per un minuto, quindi procedere rapidamente alla fase successiva.
5. Per arrestare completamente la reazione di frammentazione, aggiungere 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM a ogni tubo. Mescolare delicatamente pipeting su e giù, facendo molta attenzione a non introdurre bolle durante la miscelazione. Usiamo regolarmente 25 l di Hybridization Buffer per arrestare la reazione di frammentazione per il formato microarray a 8 pacchetti.
6. Centrifugare tutti i tubi per 1 min a 15.750 x g a temperatura ambiente. Posizionare rapidamente tutti i tubi sul ghiaccio e caricare ogni campione il più velocemente possibile.
7. Prima di lasciare il laboratorio per l'incubazione notturna di 17 h, preparare l'assemblaggio di ibridazione² come descritto nel video.
   1. FASE CRITICA: Trasferire ogni miscela di ibridazione e erogare lentamente al centro di ogni guarnizione, osservando grande attenzione a non introdurre bolle durante l'erogazione. Usiamo abitualmente 44 l di mix di ibridazione per il formato microarray da 8 confezioni. Posizionare anche 44 l di 1x Buffer di ibridazione in tutti i pozze inutilizzate.
   2. Mettere immediatamente la diapositiva microarray con il corretto orientamento sopra la scivolo della guarnizione. Questo deve essere fatto con molta attenzione al fine di non versare alcun liquido. Chiudere saldamente l'assieme di ibridazione e ruotarlo per verificare se non sono state introdotte bolle d'aria permanenti. Tutte le bolle dovrebbero muoversi all'interno dello scivolo della guarnizione.
8. Posizionare l'assieme della camera di ibridazione nel rotatore del forno di ibridazione. Se si utilizza il buffer di ibridazione GEx 2x, impostare la velocità di rotazione a 10 rpm e ibridare a 65 gradi centigradi per esattamente 17 h.
9. Lavare microarray ibridati utilizzando il Kit buffer di lavaggio Gene Expression (vedere Tabella dei materiali). Preparare i buffer di lavaggio dell'espressione genica 1 e 2 in base alle istruzioni del produttore². Aggiungere 2 mL di 10% Triton X-102 a entrambi i buffer (puramente opzionali ma altamente consigliati per ridurre l'incidenza di manufatti di lavaggimicroarray)².
10. Preparare tre gruppi di camere da bagno come descritto nella precedente pubblicazione². I dettagli di ogni camera di lavaggio sono tabulati di seguito (Tabella 1).
11. Aliquota 500 mL di Wash Buffer 1 in una bottiglia da 1 L reagente e lasciare a temperatura ambiente ambiente. Preparare una bottiglia di reagente da 1 L extra ed etichetta con "Wash Buffer 1 Reuse" per salvare il buffer di lavaggio dalla prima camera. Inoltre, aliquota 500 mL di Wash Buffer 2 in una bottiglia di reagente e incubare in un bagno d'acqua 37 C durante la notte.
    NOTA: non lasciare il laboratorio senza preparare i passaggi da 4.9 a 4.11. Sono necessari per i passaggi di lavaggio il giorno successivo.
12. Il giorno successivo, preparare i tamponi di lavaggio come descritto nella tabella 2. Riempire ogni piatto a tre quarti del buffer corrispondente. Ogni tampone di lavaggio è buono per un massimo di 4-5 vetrini.
13. Dopo esattamente 17 h di ibridazione, ottenere una camera di ibridazione e smontare sul banco di laboratorio rivestito con carta senza laminetta come descritto nella precedente pubblicazione².
    1. STEP CRITICO: Trasferire il sandwich microarray al piatto 1. Assicurarsi che il codice a barre microarray sia rivolto verso l'alto in una posizione inclinata ed evitare di immergere l'intera diapositiva nel buffer. Gestire ogni diapositiva microarray dalle loro estremità ed evitare di toccare il lato attivo del vetrino.
    2. Separare i due vetrini di vetro con una pinze². Lasciare scivolare delicatamente la guarnizione sul fondo del piatto 1, assicurando allo stesso tempo che il vetrino del microarray sia tenuto saldamente per il passo successivo.
14. FASE CRITICA: Sollevare lentamente i vetrini microarray lateralmente e trasferirli immediatamente nel rack microarray in Dish 2, come descritto nella precedente pubblicazione². È fondamentale che i vetrini del microarray siano minimamente esposti all'aria.
    1. Ripetere i passaggi 4.13 e 4.14 fino a quando gli otto scivoli sono nel rack. Distribuire i vetrini microarray in modo uniforme lungo il rack. Questo passaggio può essere eseguito da un operatore non assistito per un massimo di 4 vetrini. Attaccare il supporto rack e trasferire l'intero setup Dish 2 al primo agitatore magnetico. Mescolare delicatamente per esattamente 1 min.
15. Mescolando per 1 min (Passo 4.14), trasferire il Piatto 3 dall'incubatrice mini a 37 gradi centigradi e posizionarlo sopra il secondo agitatore magnetico. Posizionare delicatamente Lavare il buffer 2 (dal bagno d'acqua a 37 gradi centigradi) sul piatto 3. Evitare la formazione di bolle durante la colata.
    1. Dopo 1 min di agitazione è fatto (Passo 4.14), sollevare delicatamente e lentamente il portavetto dal piatto 2 e trasferire al piatto 3. Rimuovere il supporto del rack e mescolare per esattamente 1 min.
16. Sollevare lentamente e delicatamente il rack scorrevole dal piatto 3. Assicurarsi di evitare la formazione di goccioline tampone². Asciugare i lati di ogni diapositiva toccando delicatamente su carta senza lamino. Posizionare ogni vetrina essiccata in una scatola di scorrimento e ripetere il passaggio 4.16 fino a quando tutti i vetrini microarray sono nella scatola di scorrimento. Asciugare per circa 15 min.
    PUNTO DI ARRESTO OPZIONALE
17. Posizionare ogni diapositiva microarray in un supporto scorrevole, assicurandosi che il codice a barre sia rivolto verso l'alto.
    NOTA: I livelli di ozono all'interno della stanza microarray devono essere pari o inferiori di 100 g/m^3. Questo è puramente facoltativo, ma è altamente raccomandato: utilizzare una copertura di scorrimento barriera all'ozono per evitare la degradazione indotta dall'ozono di coloranti cianini.
18. Posizionare i supporti di scorrimento assemblati nel carosello di scansione. Caricare i campioni in sequenza, in base al numero di codice a barre. Eseguire immediatamente la scansione delle diapositive utilizzando uno scanner microarray (vedere Tabella dei materiali), come descritto nella pubblicazione precedente².
19. Dopo l'esecuzione, sottoporre i dati all'estrazione delle funzionalità e alla convalida del controllo qualità, come descritto nella pubblicazione precedente².

Questo metodo è ottimizzato per l'estrazione di campioni di semi di cereali contenenti quantità significative di amido o zuccheri contaminati. È progettato per estrarre l'RNA totale da 24 campioni di semi al giorno. Dovrebbe essere condotta continuamente in un giorno, ma i punti di stop e pausa opzionali sono identificati in tutto il protocollo. In alternativa, il lettore può utilizzare i loro kit di estrazione dell'RNA preferiti o il metodo di estrazione chimica manuale. Tuttavia, sulla base della nostra precedente esperienza, i kit di estrazione dell'RNA vegetale disponibili in commercio non sono appropriati per i semi a causa di quantità significative di amido, proteine, zucchero e/o contaminazione dei lipidi. Nel metodo descritto, un'estrazione chimica dell'RNA grezzo è seguita dalla purificazione delle colonne utilizzando un kit commerciale per l'estrazione dell'RNA. Questo fornisce in genere all'RNA una qualità e una resa più elevate. Figura 1 Mostra il risultato di un'esecuzione BioAnalyzer per testare la qualità dell'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo descritto di seguito. I risultati sono presentati per foglia d'orzo (campioni 1 e 2 che rappresentano campioni di contenuto di amido basso) e semi di orzo (campioni 3 e 4 che rappresentano campioni di alto contenuto di amido). Il valore di integrità dell'RNA (RIN) per tutti i campioni è 10.

La figura 1 mostra un gel rappresentativo dell'estratto di RNA purificato, dove la qualità è stata testata utilizzando un Bioanalyzer. I campioni 1 e 2 sono risultati tipici per campioni a basso contenuto di amido come le foglie d'orzo, dove sono evidenti bande di rRNA aggiuntive da cloroplasti. I campioni 3 e 4 sono risultati rappresentativi per campioni ad alto contenuto di amido come i semi d'orzo, che mostrano 18S e 28S rRNA. Si prega di notare che nessun valore RIN automatizzato può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi come i campioni di foglie, a causa del rRNA cloroplasto. Tuttavia, l'integrità e l'alta qualità possono essere accertate visivamente dall'assenza di qualsiasi prodotto di degradazione, che in genere appare come basso striscio molecolare. Il valore di RIN per campioni di semi ad alto amido come i semi d'orzo è tipicamente 10 utilizzando il protocollo descritto in questo documento.

Inoltre, presentiamo qui anche i dati rappresentativi di un esperimento di corso temporale di due linee inbred orzo d'elite (Sofiara e Victoriana) utilizzato per l'analisi della qualità del malto19. Durante il processo di maltamento, l'amido viene convertito in zucchero. Pertanto, i campioni rappresentano tessuti con proporzioni variabili di amido e contenuto di zucchero. Poiché il processo di maltaggio industriale è simile al processo di germinazione, sono stati analizzati i trascrittomi di due linee di orzo, diverse per la loro qualità di malto. Gli RNA sono stati estratti dai semi germinanti a 2, 24, 48, 72, 120, 144 e 196 h dopo l'imbibitiazione nei triplicati biologici. La preparazione dell'RNA e l'ibridazione al chip personalizzato per microarray di orzo sono state eseguite come descritto sopra. La figura 2 indica la griglia normalizzata letta dall'ibridazione di microarray fornita nel rapporto di controllo qualità (QC) (Figura 3) e nel grafico dell'istogramma per i segnali rilevati. La griglia fornisce l'esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, inclusi i punti di lettura di sfondo e spike-in utilizzati per la calibrazione. L'istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Un'ibridazione di successo dà un'ampia curva a forma gaussiana con solo piccoli outlier, come mostrato nella figura. Le ibridazioni fallite possono provocare un forte spostamento verso un lato ("mostri verdi").

Infine, un risultato rappresentativo dei valori accettabili è riportato nella colonna 4 della figura 3. Per indicare l'affidabilità degli esperimenti eseguiti, i risultati vengono ulteriormente valutati utilizzando il software GeneSpring. I dati raccolti sono presentati come analisi dei componenti principali (PCA). Il PCA integra i valori dei punti (geni) selezionati come vettore. Il numero di punti valutati utilizzati può variare da diverse centinaia all'intero chip e dipende dal software utilizzato. Ogni chip (campione) produce un valore (vettore) risultante dall'intensità del segnale integrato per i punti analizzati. Pertanto, la posizione relativa nel grafico (PCA) indica la somiglianza dei campioni tra loro. Più i campioni sono vicini, più simili sono. Le repliche tecniche dovrebbero essere più vicine rispetto a quelle biologiche, e le repliche biologiche di un campione dovrebbero raggrupparsi più vicine, rispetto a campioni provenienti da diversi punti temporali, tessuti o condizioni.

Figura 1: Riepilogo dell'esecuzione del file di elettroforesi ottenuto dopo aver controllato la qualità dell'RNA con Bioanalyzer. I campioni 1 e 2 sono tessuto fogliare d'orzo come indicato da bande ribosomiche aggiuntive da cloroplasti. I campioni 3 e 4 sono tessuti di semi d'orzo con bande di rRNA 18S e 28S mostrate. Un fattore RIN non è sempre calcolato per i tessuti verdi come la foglia, ma secondo il gel, la qualità dell'RNA è molto buona. Il valore RIN per i campioni 3 e 4 è 10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rapporto QC da ibridazione di microarray di orzo di successo. A: indica i segnali rilevati sulla rete da tutti gli angoli del chip. L'istogramma mostra il numero di segnali classificati in base all'intensità del segnale (fluorescenza) come logaritmo dopo la sottrazione di fondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Riepilogo del controllo qualità (QC) dopo l'ibridazione e la scansione. I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna 2 (valore) e l'intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione degli assiemi della camera di lavaggio.

Tabella 2: Temperatura di incubazione e tempo per gli assiemi della camera di lavaggio.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.