Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica
May 21st, 2020
Viene presentato un metodo per la profilazione trascrittoma dei cereali. La profilazione dell'espressione genica basata su microarray inizia con l'isolamento dell'RNA totale di alta qualità dai cereali e continua con la generazione di cDNA. Dopo l'etichettatura cRNA e l'ibridazione dei microarray, vengono fornite raccomandazioni per il rilevamento del segnale e il controllo della qualità.
Questo metodo di ibridazione del microarray è utile per confrontare un gran numero di campioni di un organismo con un genoma noto. Rispetto a un approccio di sequenziamento ad alta velocità effettiva, la quantità di dati generati da questo metodo è molto più facile da gestire e, inoltre, può essere analizzata in modo più conveniente. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Christiane Seiler, scienziata post-dottorato che lavora nel gruppo di ricerca di Rosis presso l'IPK di Gatersleben.
Prima di eseguire l'ibridazione dei microarray utilizzando il kit di ibridazione dell'espressione genica, preparare l'agente bloccante 10X in base alle specifiche del produttore e aliquotare l'agente bloccante risultante in volumi di 200 microliter. Quindi, conservare l'agente di blocco a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Il giorno dell'ibridazione del microarray, scongelare un'aliquota di 200 microliter dell'agente bloccante 10X sul ghiaccio e prewarm il forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e un blocco termico a 60 gradi Celsius.
Preparare la miscela di frammentazione per ciascun campione come descritto dal produttore e mescolare delicatamente i campioni su un vortice. Dopo il vortice, far girare brevemente i campioni in un microcentrifugo prima di incubare esattamente per 30 minuti nel blocco termico di 60 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raffreddare immediatamente ogni tubo sul ghiaccio per un minuto prima di fermare la frammentazione con 25 microlitri di tampone di ibridazione dell'espressione genica 2X, giri elevati al minuto per tubo.
Mescolare con pipettazione delicata, facendo molta attenzione a non introdurre bolle e centrifugare i tubi a temperatura ambiente. Alla fine dello spin posizionare immediatamente tutti i tubi sul ghiaccio e caricare ogni campione nello scivolo del microarray il più rapidamente possibile. Successivamente, erogare lentamente 44 microlitri di ogni mix di ibridazione al centro di ogni guarnizione, facendo attenzione a evitare l'introduzione di bolle e aggiungere 44 microlitri di tampone di ibridazione in eventuali pozzi inutilizzati.
Posizionare immediatamente lo scivolo microarray con l'orientamento corretto sopra lo scivolo della guarnizione, facendo attenzione a non versare alcun liquido e chiudere saldamente l'assieme di ibridazione. Ruotare l'assieme per confermare la mancanza di bolle d'aria stazionarie e posizionare l'assemblaggio della camera di ibridazione nel rotatore del forno di ibridazione. Impostare la velocità di rotazione su 10 giri al minuto, quindi avviare l'ibridazione a 65 gradi Celsius per esattamente 17 ore.
Mentre i campioni si ibridano, preparare tre gruppi di lavapiatti nei tamponi di lavaggio appropriati come indicato nelle tabelle. Dopo esattamente 17 ore di ibridazione, smontare una camera di ibridazione su un banco da laboratorio foderato con carta priva di pelucchi e trasferire un sandwich di microarray su un piatto contenente tampone di lavaggio uno con il codice a barre microarray rivolto verso l'alto in posizione inclinata senza immergere l'intero scivolo nel buffer. Utilizzando le pinze, separare i due vetrini e lasciare che la guarnizione scivoli delicatamente nella parte inferiore del piatto mantenendo una presa ferma sullo scivolo del microarray.
Sollevare lentamente lo scivolo microarray lateralmente per un trasferimento immediato nel rack microarray nel piatto due con una minima esposizione all'aria. Quando tutte e otto le diapositive sono state posizionate uniformemente lungo il rack, fissare il portapacchi e trasferire l'intera configurazione del piatto due all'agitatore magnetico. Mescolare delicatamente la configurazione per esattamente un minuto.
Mentre i campioni vengono mescolati, trasferire il piatto tre dall'incubatore di 37 gradi Celsius su un secondo agitatore magnetico. Quindi aggiungere delicatamente 37 gradi Celsius tampone di lavaggio due al piatto tre senza formare bolle. Al termine dell'incubazione mescolando, trasferire delicatamente e lentamente il portapacchi per pararegliare tre e rimuovere il supporto del rack.
Dopo aver mescolato esattamente per un minuto, rimuovere lentamente e delicatamente il porta scorrevole dal piatto e utilizzare carta priva di pelucchi per asciugare accuratamente entrambi i lati di ogni diapositiva, posizionando ogni diapositiva in una scatola scorrevole mentre viene asciugato. Dopo aver permesso alle diapositive di asciugarsi per 15 minuti, trasferire ogni microarray scivolare in un porta scorrevole con il codice a barre rivolto verso l'alto e caricare i supporti di scorrimento assemblati in un carosello di scansione e sequenza in base al numero del codice a barre. Quindi, scansiona immediatamente le diapositive.
In questa figura, viene mostrato un risultato rappresentativo di una corsa per testare la qualità dell'estrazione dell'RNA. Nelle analisi tipiche di campioni a basso contenuto di amido, come le foglie d'orzo, sono evidenti ulteriori bande di RNA ribosomiale dai cloroplasti. Campioni ad alto contenuto di amido, come i semi d'orzo, mostrano RNA ribosomiale 18 e 28S.
Si noti che nessun valore automatizzato del numero di integrità dell'RNA può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi, come i campioni fogliari, a causa dell'RNA ribosomiale cloroplasto. In questa analisi rappresentativa, sono stati eseguiti una preparazione dell'RNA e l'ibridazione su un chip microarray d'orzo personalizzato come dimostrato. La griglia mostra un esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, incluso lo sfondo e il picco nei punti di lettura utilizzati per la calibrazione.
L'istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Come osservato, un'ibridazione di successo dà un'ampia curva a forma gaussiana con solo valori anomali minori. Di seguito è riportato il rapporto sul controllo qualità per i segnali rilevati.
I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna due e l'intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna quattro. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare qualsiasi insieme sperimentale per qualsiasi organismo in cui siano disponibili informazioni sostanziali sul genoma. L'uso di questa tecnica nel nostro laboratorio ci ha permesso di confrontare e analizzare i cambiamenti trascrittomici nel riso e nell'orzo che si verificano dopo l'induzione dello stress da crescita.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo basato su microarray per la profilazione del trascrittoma dei cereali, concentrandosi sull'isolamento di RNA di alta qualità e sulla successiva generazione di cDNA. La procedura include raccomandazioni dettagliate per il rilevamento del segnale e il controllo di qualità durante l'ibridazione dei microarray.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia delle piante
- Analisi dell'espressione genica
Contesto
- L'ibridazione dei microarray permette il confronto di campioni multipli di organismi con genomi noti.
- Questo metodo è più gestibile e conveniente rispetto al sequenziamento ad alto rendimento.
- È particolarmente utile per analizzare i cambiamenti trascrittomici nei cereali come riso e orzo.
- Le misure di controllo di qualità sono cruciali per garantire risultati affidabili.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per la profilazione del trascrittoma nei cereali.
- Fornire un protocollo dettagliato per l'isolamento dell'RNA e l'ibridazione dei microarray.
- Facilitare l'analisi dei cambiamenti dell'espressione genica in varie condizioni di crescita.
Metodi utilizzati
- Isolamento dell'RNA totale dai cereali.
- Generazione di cDNA ed etichettatura di cRNA.
- Ibridazione dei microarray con protocolli specifici per la preparazione dei campioni.
- Valutazioni di controllo di qualità durante e dopo l'ibridazione.
Risultati principali
- Una ibridazione di successo produce una curva a forma di Gaussiana ampia nell'intensità del segnale.
- I rapporti di controllo di qualità indicano intervalli di segnale accettabili per le diapositive ibridizzate.
- I risultati rappresentativi dimostrano la qualità dell'estrazione dell'RNA e l'efficacia dell'ibridazione.
- Il metodo permette l'analisi comparativa dei cambiamenti trascrittomici in risposta allo stress.
Conclusioni
- Questo metodo di microarray è efficace per la profilazione del trascrittoma nei cereali.
- Fornisce un approccio affidabile per analizzare l'espressione genica in varie condizioni.
- Le future applicazioni potrebbero estendersi ad altri organismi con informazioni genomiche disponibili.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds is critical for target validation in agricultural biotechnology, where starch and sugar content often compromise RNA integrity. This method enables reliable gene expression profiling under varying developmental and stress conditions, supporting mechanistic de-risking of trait-associated targets. By delivering quantitative, reproducible transcriptomic measurements, it strengthens predictive confidence in early discovery workflows for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses in cereal models with known genomes, clarifying pathway involvement in stress response.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and hybridization workflows that reduce variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports identification of differentially expressed genes (DEGs) and gene regulatory networks, improving confidence in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates transcriptome-wide data suitable for biomarker discovery and phenotypic screening in grain development models.
- Operational Value: Delivers consistent signal intensity profiles with quality control metrics, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Compatible with microarray platforms allowing parallel processing of multiple seed genotypes or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular phenotypes in developing seeds to field-relevant traits through transcriptome-wide association study (TWAS) readiness.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene expression dynamics during germination and abiotic stress, reducing uncertainty in target mechanism.
- Predictive Confidence: Enables cross-condition comparison of transcriptomic changes, supporting go/no-go decisions in trait validation pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in crop trait validation where genomic resources exist.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via DEG analysis and gene network characterization in cereal models under stress or developmental cues.
- Screening: Enables assay-ready transcriptome profiling with quality-controlled cRNA labeling and hybridization outputs suitable for comparative screening.
- Analytics: Produces signal intensity data with Gaussian distribution and spike-in controls, allowing statistical comparison of expression levels across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and TWAS applications by providing high-quality transcriptome data from germinating, developing, and mature seeds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across cereal species with available genome sequences, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from low-quality RNA in high-starch tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking agent use, fragmentation timing, and wash buffer protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling cost-effective transcriptome analysis compared to sequencing, especially for large sample sets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing reliable expression data for prioritizing targets in abiotic stress tolerance or yield improvement programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and microarray techniques to prevent degradation and ensure proper fragmentation.
- Dependent on access to hybridization ovens, magnetic stirrers, slide scanners, and microarray-compatible consumables.
- Necessitates cross-team standardization of RNA quality metrics and hybridization timing for multi-site reproducibility.
- Adaptation to non-cereal models may require validation of RNA extraction efficacy due to varying starch, sugar, or secondary metabolite content.
- Practical limitation: Manual slide handling increases risk of bubble introduction or cross-contamination during hybridization assembly.
