Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica
21 maggio 2020
Viene presentato un metodo per la profilazione trascrittoma dei cereali. La profilazione dell'espressione genica basata su microarray inizia con l'isolamento dell'RNA totale di alta qualità dai cereali e continua con la generazione di cDNA. Dopo l'etichettatura cRNA e l'ibridazione dei microarray, vengono fornite raccomandazioni per il rilevamento del segnale e il controllo della qualità.
Questo metodo di ibridazione del microarray è utile per confrontare un gran numero di campioni di un organismo con un genoma noto. Rispetto a un approccio di sequenziamento ad alta velocità effettiva, la quantità di dati generati da questo metodo è molto più facile da gestire e, inoltre, può essere analizzata in modo più conveniente. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Christiane Seiler, scienziata post-dottorato che lavora nel gruppo di ricerca di Rosis presso l'IPK di Gatersleben.
Prima di eseguire l'ibridazione dei microarray utilizzando il kit di ibridazione dell'espressione genica, preparare l'agente bloccante 10X in base alle specifiche del produttore e aliquotare l'agente bloccante risultante in volumi di 200 microliter. Quindi, conservare l'agente di blocco a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Il giorno dell'ibridazione del microarray, scongelare un'aliquota di 200 microliter dell'agente bloccante 10X sul ghiaccio e prewarm il forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e un blocco termico a 60 gradi Celsius.
Preparare la miscela di frammentazione per ciascun campione come descritto dal produttore e mescolare delicatamente i campioni su un vortice. Dopo il vortice, far girare brevemente i campioni in un microcentrifugo prima di incubare esattamente per 30 minuti nel blocco termico di 60 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raffreddare immediatamente ogni tubo sul ghiaccio per un minuto prima di fermare la frammentazione con 25 microlitri di tampone di ibridazione dell'espressione genica 2X, giri elevati al minuto per tubo.
Mescolare con pipettazione delicata, facendo molta attenzione a non introdurre bolle e centrifugare i tubi a temperatura ambiente. Alla fine dello spin posizionare immediatamente tutti i tubi sul ghiaccio e caricare ogni campione nello scivolo del microarray il più rapidamente possibile. Successivamente, erogare lentamente 44 microlitri di ogni mix di ibridazione al centro di ogni guarnizione, facendo attenzione a evitare l'introduzione di bolle e aggiungere 44 microlitri di tampone di ibridazione in eventuali pozzi inutilizzati.
Posizionare immediatamente lo scivolo microarray con l'orientamento corretto sopra lo scivolo della guarnizione, facendo attenzione a non versare alcun liquido e chiudere saldamente l'assieme di ibridazione. Ruotare l'assieme per confermare la mancanza di bolle d'aria stazionarie e posizionare l'assemblaggio della camera di ibridazione nel rotatore del forno di ibridazione. Impostare la velocità di rotazione su 10 giri al minuto, quindi avviare l'ibridazione a 65 gradi Celsius per esattamente 17 ore.
Mentre i campioni si ibridano, preparare tre gruppi di lavapiatti nei tamponi di lavaggio appropriati come indicato nelle tabelle. Dopo esattamente 17 ore di ibridazione, smontare una camera di ibridazione su un banco da laboratorio foderato con carta priva di pelucchi e trasferire un sandwich di microarray su un piatto contenente tampone di lavaggio uno con il codice a barre microarray rivolto verso l'alto in posizione inclinata senza immergere l'intero scivolo nel buffer. Utilizzando le pinze, separare i due vetrini e lasciare che la guarnizione scivoli delicatamente nella parte inferiore del piatto mantenendo una presa ferma sullo scivolo del microarray.
Sollevare lentamente lo scivolo microarray lateralmente per un trasferimento immediato nel rack microarray nel piatto due con una minima esposizione all'aria. Quando tutte e otto le diapositive sono state posizionate uniformemente lungo il rack, fissare il portapacchi e trasferire l'intera configurazione del piatto due all'agitatore magnetico. Mescolare delicatamente la configurazione per esattamente un minuto.
Mentre i campioni vengono mescolati, trasferire il piatto tre dall'incubatore di 37 gradi Celsius su un secondo agitatore magnetico. Quindi aggiungere delicatamente 37 gradi Celsius tampone di lavaggio due al piatto tre senza formare bolle. Al termine dell'incubazione mescolando, trasferire delicatamente e lentamente il portapacchi per pararegliare tre e rimuovere il supporto del rack.
Dopo aver mescolato esattamente per un minuto, rimuovere lentamente e delicatamente il porta scorrevole dal piatto e utilizzare carta priva di pelucchi per asciugare accuratamente entrambi i lati di ogni diapositiva, posizionando ogni diapositiva in una scatola scorrevole mentre viene asciugato. Dopo aver permesso alle diapositive di asciugarsi per 15 minuti, trasferire ogni microarray scivolare in un porta scorrevole con il codice a barre rivolto verso l'alto e caricare i supporti di scorrimento assemblati in un carosello di scansione e sequenza in base al numero del codice a barre. Quindi, scansiona immediatamente le diapositive.
In questa figura, viene mostrato un risultato rappresentativo di una corsa per testare la qualità dell'estrazione dell'RNA. Nelle analisi tipiche di campioni a basso contenuto di amido, come le foglie d'orzo, sono evidenti ulteriori bande di RNA ribosomiale dai cloroplasti. Campioni ad alto contenuto di amido, come i semi d'orzo, mostrano RNA ribosomiale 18 e 28S.
Si noti che nessun valore automatizzato del numero di integrità dell'RNA può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi, come i campioni fogliari, a causa dell'RNA ribosomiale cloroplasto. In questa analisi rappresentativa, sono stati eseguiti una preparazione dell'RNA e l'ibridazione su un chip microarray d'orzo personalizzato come dimostrato. La griglia mostra un esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, incluso lo sfondo e il picco nei punti di lettura utilizzati per la calibrazione.
L'istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Come osservato, un'ibridazione di successo dà un'ampia curva a forma gaussiana con solo valori anomali minori. Di seguito è riportato il rapporto sul controllo qualità per i segnali rilevati.
I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna due e l'intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna quattro. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare qualsiasi insieme sperimentale per qualsiasi organismo in cui siano disponibili informazioni sostanziali sul genoma. L'uso di questa tecnica nel nostro laboratorio ci ha permesso di confrontare e analizzare i cambiamenti trascrittomici nel riso e nell'orzo che si verificano dopo l'induzione dello stress da crescita.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo basato su microarray per il profilo del trascrittoma di cereali, concentrandosi sull'isolamento di RNA di alta qualità e sulla successiva generazione di cDNA. La procedura include raccomandazioni dettagliate per il rilevamento del segnale e il controllo di qualità durante l'ibridazione su microarray.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia vegetale
- Analisi dell'espressione genica
Sfondo
- L'ibridazione con microarray permette il confronto di numerosi campioni provenienti da organismi con genomi noti.
- Questo metodo è più agevole e conveniente rispetto al sequenziamento ad alto rendimento.
- È particolarmente utile per analizzare le variazioni trascrittomiche in cereali come riso e orzo.
- Misure di controllo della qualità sono fondamentali per garantire risultati affidabili.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per il profilo del trascrittoma nei cereali.
- Fornire un protocollo dettagliato per l'isolamento dell'RNA e l'ibridazione su microarray.
- Facilitare l'analisi dei cambiamenti nell'espressione genica in diverse condizioni di crescita.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di RNA totale da cereali.
- Generazione di cDNA e marcatura di cRNA.
- Ibridazione su microarray con protocolli specifici per la preparazione del campione.
- Valutazioni di controllo qualità durante e dopo l'ibridazione.
Risultati principali
- L'ibridazione riuscita produce una curva ampia a forma gaussiana nell'intensità del segnale.
- I rapporti di controllo qualità indicano intervalli di segnale accettabili per i vetrini ibridati.
- Risultati rappresentativi dimostrano la qualità dell'estrazione dell'RNA e l'efficacia dell'ibridazione.
- Il metodo consente l'analisi comparativa dei cambiamenti trascrittomici in risposta allo stress.
Conclusioni
- Questo metodo di microarray è efficace per il profilo del trascrittoma nei cereali.
- Fornisce un approccio affidabile per analizzare l'espressione genica in diverse condizioni.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri organismi per i quali è disponibile informazione genomica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il reperimento di dati trascrittomici di alta qualità da semi di cereali è fondamentale per la validazione degli obiettivi nella biotecnologia agricola, dove il contenuto di amido e zuccheri compromette spesso l'integrità dell'RNA. Questo metodo consente un'analisi affidabile del profilo di espressione genica in diverse condizioni di sviluppo e di stress, supportando l'identificazione meccanicistica degli obiettivi associati ai tratti. Fornendo misurazioni trascrittomique quantitative e riproducibili, aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta per i programmi di miglioramento delle colture.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi trascrizionali in modelli di cereali con genomi noti, chiarificando il coinvolgimento delle vie di risposta allo stress.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati per l'estrazione dell'RNA e l'ibridazione, riducendo la variabilità negli studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Favorisce l'identificazione di geni differenzialmente espressi (DEG) e di reti di regolazione genica, migliorando la fiducia nella priorizzazione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati su scala trascrittomica adatti alla scoperta di biomarcatori e allo screening fenotipico in modelli di sviluppo del chicco.
- Valore operativo: Fornisce profili di intensità del segnale costanti con metriche di controllo qualità, consentendo la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
- Scalabilità: Compatibile con piattaforme a microarray, che permettono l'elaborazione in parallelo di multipli genotipi di semi o condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i fenotipi molecolari nei semi in via di sviluppo a caratteri rilevanti per il campo mediante la prontezza per studi d'associazione a livello trascrittomico (TWAS).
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce la dinamica dell'espressione genica durante la germinazione e lo stress abiotico, riducendo l'incertezza sul meccanismo bersaglio.
- Conferma Predittiva: Permette il confronto incrociato delle variazioni trascrittomiche in diverse condizioni, supportando decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di validazione dei caratteri.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, in particolare nella validazione di caratteri agronomici in cui sono disponibili risorse genomiche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante analisi dei geni differenzialmente espressi e caratterizzazione delle reti geniche in modelli di cereali sottoposti a stress o a stimoli legati allo sviluppo.
- Screening: Permette un'analisi trascrittoma pronta per saggi, con etichettatura di cRNA controllata per qualità e risultati di ibridazione adatti a screening comparativi.
- Analisi: Produce dati di intensità del segnale con distribuzione gaussiana e controlli con RNA di aggiunta (spike-in), consentendo il confronto statistico dei livelli di espressione tra campioni.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento di biomarcatori e le applicazioni di TWAS fornendo dati trascrittoma di alta qualità ottenuti da semi in germinazione, in sviluppo e maturi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi del trascrittoma in diverse specie di cereali dotate di sequenze genomiche disponibili, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo il rumore derivante dall'RNA di bassa qualità nei tessuti ricchi di amido.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso l'uso standardizzato di agenti bloccanti, dei tempi di frammentazione e dei protocolli di lavaggio con tampone.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale permettendo analisi trascrittomiche economicamente vantaggiose rispetto al sequenziamento, specialmente per set di campioni di grandi dimensioni.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento con rischio calibrato fornendo dati affidabili sull'espressione per la selezione di obiettivi nei programmi di tolleranza allo stress abiotico o di miglioramento della resa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nella manipolazione dell'RNA e nelle tecniche di microarray per prevenire il degrado e garantire una corretta frammentazione.
- È subordinato all'accesso a forni per ibridazione, agitatori magnetici, scanner per vetrini e materiali di consumo compatibili con i microarray.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai parametri di qualità dell'RNA e ai tempi di ibridazione, al fine di assicurare la riproducibilità in più sedi.
- L'adattamento a modelli non appartenenti ai cereali può richiedere la validazione dell'efficacia dell'estrazione dell'RNA a causa del diverso contenuto di amido, zuccheri o metaboliti secondari.
- Limitazione pratica: la manipolazione manuale dei vetrini aumenta il rischio di formazione di bolle o di contaminazione incrociata durante l'assemblaggio dell'ibridazione.
