Summary
该协议描述了使用激光切割神经血管植入物对血液接触装置的全面血液相容性评估。采用新鲜肝化人血的流循环模型模拟血流。灌注后,对各种造血标记进行分析,并将与采血后直接获得的值进行比较,对被测装置进行血液相容性评价。
Abstract
医疗设备(例如血管移植物、支架和心脏导管)越来越多地用于暂时或永久目的,这些装置仍留在人体的循环系统中,需要一种可靠和多参数化的方法,评估这些设备(即血液成分的激活和销毁)可能造成的造血并发症。血液接触植入物的体外血相容性综合测试是成功实施体内的第一步。因此,在临床应用之前,必须根据国际标准化组织 10993-4 (ISO 10993-4) 进行广泛的分析。所述的流回路描述了一个敏感模型,用于分析支架的止血性能(在本例中为神经血管),并揭示不利影响。使用新鲜的人类全血和温和的血液取样对于避免血液的预活化至关重要。血液通过含测试标本的肝化管中渗透,在37°C下以150 mL/min的速度使用蠕动泵60分钟。灌注前后, 血液学标记(即血细胞计数、血红蛋白、血细胞和血浆标记),指示白细胞(多态核[PMN]-弹性酶)、血小板(β-血栓球蛋白[-TG])、凝血系统(通宾-抗血栓III[TAT])和补数级联(SC5b-9)的。最后,在临床应用之前,我们提出了支架和其他血液接触装置广泛血液相容测试的基本可靠模型。
Introduction
植入物和生物材料与人的血液相互作用,在体内应用,需要严格的临床前测试,重点是调查止血系统的各种标记。国际标准化组织 10993-4 (ISO 10993-4) 规定了血液接触装置(即支架和血管移植物)评估的核心原则,并考虑了设备设计、临床效用和所需材料1。
人血是一种含有各种血浆蛋白和细胞的液体,包括白细胞(白细胞[WBCs])、红细胞(红血球[RBC])和血小板,在人体中执行复杂的功能2。异物与血液的直接接触可引起不良影响,如免疫或凝固系统的激活,可导致炎症或血栓并发症和植入后严重问题3、4、5。因此,体外血合一验证提供了在植入前发现和排除血液接触时可能引起的任何血液并发症的机会。
提出的流回路模型是为评估神经血管支架和类似装置的血管相容性而建立的,在管材中应用150 mL/min的流速(直径为3.2毫米),以模拟大脑流动条件和动脉直径2、7。除了需要一个最佳的体外模型外,血液来源是分析生物材料8的血液相容性时获得可靠和不变结果的重要因素。采集的血液应在取样后立即使用,以防止长时间储存引起的变化。一般来说,应使用21 G针进行无停滞的温和采集血液,以尽量减少血小板的预活化和血脉叠。此外,捐赠者排除标准包括吸烟、怀孕、健康状况不佳或在过去14天内服用口服避孕药或止痛药的人。
本研究描述了在流动条件下对支架植入物进行广泛溶容性测试的体外模型。当比较未涂覆的纤维布林-肝素涂层支架时,全面的溶性测试结果反映了纤维蛋白-肝素涂层支架9的溶性增强。相反,未涂层支架诱导凝固级联的激活,如血小板附着到支架表面引起的汤宾-抗血栓三 (TAT) 浓度增加和血小板数损失。总体而言,建议将此血效相容性模型集成到临床前测试中,以检测设备对止血系统造成的任何不利影响。
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Protocol
血液取样程序经图宾根大学医学院道德委员会批准(项目识别代码:270/2010BO1)。所有科目均提供书面、知情同意,供在参与前加入。
1. 准备肝素装载的单体
- 将未稀释的肝素 (5,000 IU/mL) 与氯化钠(NaCl,0.9%) 混合溶液,并准备一个溶液,结果浓度为15 IU/mL的肝素。
- 在每个中性单体(9 mL)中加入900μL的稀释肝素溶液,在血液取样后获得最终肝素浓度为1.5 IU/mL。每个供体准备三个单体,外加三个备用单体,并将肝素加载的单体在4°C下储存,直到抽血。
2. 血液取样
- 在抽血前30分钟,将装有肝素的单体从冰箱中拿出来。
- 通过静脉穿刺,从每个健康捐献者(n = 5)收集27 mL血液样本,以进行流循环。只应用光滑的血小板,以避免血小板过早激活和血液凝固级联。
- 在三个单体中收集血液样本,其中含有 900 μL 的肝素溶液 (1.5 IU/mL),并将所有三个单体在一个塑料容器中集中,以确保所有部件均均匀分布。
- 将池化血直接输送到三种不同的单体,含有EDTA(1.2 mL)、西酸(1.4 mL)或西酸、异氨酸、腺苷和二恶银(CTAD,2.7 mL)的混合物,以收集基线值。按照第 5 节第 8 节中所述的样品进行操作。
注:为了保证不受影响的凝血行为,捐赠者应避免在过去14天内摄入影响血吸力的药物(如乙酰水杨酸、纳普罗森和卡白霉素),以及口服避孕药和吸烟。
3. 准备流循环
- 切割三个肝素涂层聚氯乙烯管,长度为75厘米,内径为3.2毫米。记得把一个浴缸作为控制而卸载。
- 将管的一端放在装有 0.9% NaCl 的储液罐中,将油管连接到泵头,然后将另一端插入测量缸中。
- 在检查测量油缸中的填充液位时,使用定时器调整蠕动泵的设置,以达到 150 mL/min 的流速。
4. 赫莫容性测试的性能
- 使用 12 mL 注射器将管子充满血液。让6 mL的血液顺利流入每个管包含样品或卸载控制。
- 形成电路,并使用 0.5 厘米长的硅胶连接管紧密关闭管。将管子放入 37 °C 的水浴中,开始灌注 60 分钟。
5. 全血计数分析
- 取样后(基线)或灌注后将1.2 mL的血液放入含有EDTA的单体,并小心地反转管子5倍。
- 将单体卡片插入血液分析仪,并针对每个样本进行血液计数分析。然后,在血数测量后,在冰上孵育单体15~60分钟,以便进一步分析,如第7节所述。
6. 酸等离子体收集
- 将装有西酸的单体用1.4 mL血液(新鲜抽取或循环后)填充,并小心地反转5倍。
- 在室温 (RT) 下,在 1,800 x g下将管离心 18 分钟。将血浆馏分的三个250μL样品放入1.5mL反应管中,并将血浆样品冻结在液氮中。将它们储存在-20°C,直到分析。
7. EDTA 等离子体集合
- 在血液计数测量后,将单体孵育在冰上 15-60 分钟。然后,在 2,500 x g和 4 °C 下使管离心 20 分钟。
- 离心后,将血浆馏分的三个250μL样品放入1.5mL反应管中,并将管冻结在液氮中。将它们储存在-80°C,直到分析。
8. 收集CTAD等离子体
- 将含有CTAD混合物的单体用2.7 mL血液(新鲜抽取或孵育后)填充,并小心反转5倍。之后,在冰上孵育单体15~60分钟。然后,在 2,500 x g和 4 °C 下使管离心 20 分钟。
- 将中间等离子体馏分的700μL转移到1.5mL反应管中,在2,500 x g和4°C下将填充反应管离心20分钟。
- 离心后,将中间部分的两个100 μL样品放入1.5mL反应管中,并将管冻结在液氮中。将它们储存在-20°C,直到分析。
注:EDTA 等离子体和 CTAD 等离子体的集合可以一起执行,因为工作条件相同。
9. 从酸度等离子体测量人类TAT
- 在37°C的水浴中解冻西度血浆。
- 根据制造商的说明,使用 TAT 酶相关免疫吸附剂测定 (ELISA) 试剂盒。重建等离子体标准,控制并稀释洗涤液、抗人-TAT过氧化物酶(POD)结合抗体和色原溶液。在开始测试之前,将所有试剂和微量板留在 RT (15~25 °C) 处 30 分钟。
- 将样品缓冲液的50μL移入微化板的每个孔中,在孔板中重复添加样品缓冲液(空白)、等离子体标准、等离子体控制和未稀释的等离子样品50μL。密封板,在37°C孵育15分钟,轻轻摇动。然后,用 300 μL 的洗涤液清洗板 3 倍。
- 在每个孔中加入 100 μL 的 POD 结合抗人-TAT 抗体。密封板,在37°C孵育15分钟,轻轻摇动。然后,用 300 μL 的洗涤液清洗板 3 倍。
- 在每个井中加入100 μL新鲜制备的色原溶液。密封板,在 RT 孵育 30 分钟。
- 拆下密封膜,在每个井中加入 100 μL 止挡溶液。使用光度计读取光学密度 (OD), 光度计为 490×500 nm。将标准曲线数据拟合为趋势线,并计算样本的浓度。
10. 从酸血浆中测量PMN-电酶
- 在37°C的水浴中解冻西度血浆。
- 根据制造商的说明,使用多态核 (PMN)-变酶 ELISA 套件:重建 PMN-去聚酶控制和 PMN-去聚酶标准,使用套件的稀释缓冲液制备标准曲线。
- 根据制造商的说明稀释洗涤液。在开始测试之前,将所有试剂和微量板留在RT上 30 分钟。用稀释缓冲液将西酸血浆样品稀释至1:100。
- 将样品缓冲液(空白)、PMN-电化酶标准曲线(15.6~1,000纳克/mL)、PMN-电化酶控制(高浓度和低浓度)和稀释的等离子体样品(重复)添加到井板中。密封板,在RT孵育60分钟,轻轻摇动。之后,用 300 μL 的洗涤液清洗板 4x。
- 在每个孔中加入150μL的酶结合抗体。密封板,在RT孵育60分钟,轻轻摇动。之后,用 300 μL 的洗涤液清洗板 4x。
- 在每个井中加入3,3',5'-四甲基苯丁(TMB)基质溶液的200μL。密封板,在黑暗中在RT孵育20分钟。然后,拆下密封膜,并将停止溶液的 50 μL 添加到每个井中。
- 使用 450 nm 的光度计读取 OD,参考读数为 630 nm。将标准曲线数据拟合为趋势线,并计算样本的浓度。
11. EDTA 等离子体终端补品复合物(TCC)的测量
- 在37°C的水浴中解冻EDTA等离子体,解冻后储存在冰上。
- 根据制造商的说明,使用补联级联 SC5b-9 ELISA 套件:稀释制造商协议中所述的洗涤液。在开始测试之前,将所有试剂和微量板留在RT上 30 分钟。使用试剂盒的稀释缓冲液将 EDTA 血浆样品稀释到 1:10。
- 在每个孔中加入300μL的洗涤液,以补充表面,并在2分钟后吸气。 加入100 μL的样品缓冲液(空白)、SC5b-9标准、SC5b-9控制(高浓度和低浓度),以及稀释的等离子样品重复到井板。
- 密封板,在 RT 孵育 60 分钟。接下来,用 300 μL 的洗涤液清洗板 5 倍。
- 在每个孔中加入50μL的酶结合抗体。密封板,在 RT 孵育 30 分钟。然后,用 300 μL 的洗涤液清洗板 5 倍。
- 在每个油井中加入 100 μL 的 TMB 基底溶液。密封板,在黑暗中在RT孵育15分钟。
- 拆下密封膜,将停止溶液的 100 μL 添加到每个井中。使用 450 nm 的光度计读取 OD。将标准曲线数据拟合为趋势线,并计算样本的浓度。
12. CTAD血浆中β-血栓球蛋白的测量
- 在37°C的水浴中解冻CTAD等离子体。
- 根据制造商的说明,使用β-血栓球蛋白(β-TG)ELISA试剂盒:重建β-TG控制和β-TG标准,并使用蒸馏H2O稀释洗涤液。在开始测试之前,将所有试剂和微量板留在RT上 30 分钟。
- 使用随附的磷酸盐缓冲液根据制造商的说明准备标准曲线和控制。将 CTAD 血浆样品稀释到 1:21。
- 将磷酸盐缓冲液(空白)、β-TG 标准、β-TG 控制(高浓度和低浓度)和稀释的等离子样品在孔板中重复添加 200 μL。密封板,在RT孵育60分钟。之后,用300μL的洗涤液清洗板5倍。
- 在每个孔中加入200μL的酶结合抗体。密封板,在RT孵育60分钟。之后,用300μL的洗涤液清洗板5倍。
- 在每个油井中加入 200 μL 的 TMB 基底溶液。密封板,在黑暗中在RT孵育5分钟。拆下密封膜,并在每口井中加入 50 μL 的 1 M 硫酸 (H2SO4) 来阻止反应。
- 离开板 15-60 分钟,然后在 450 nm 处使用光度计读取 OD。将标准曲线数据拟合为趋势线,并计算样本的浓度。
13. 扫描电子显微镜的样品制备
- 使用钳子将植入物从管子中取出,然后将其浸入 0.9% NaCl 溶液 3 倍中,短暂冲洗植入物。
- 储存在谷醛溶液(2%谷醛在磷酸盐缓冲盐水[PBS缓冲器没有Ca2+/Mg2+])过夜在4°C。
- 其次,在PBS缓冲液中孵育植入物10分钟,通过每粒浓度增加10分钟的乙醇孵化样品:40%、50%、60%、70%、80%、90%、96%和100%。将脱水样品储存在100%乙醇中,直到进一步分析。
- 在扫描电子显微镜 (SEM) 之前,根据干燥装置或文献10的说明执行关键点干燥。
14. 扫描电子显微镜
- 将干燥的植入物连接到扫描显微镜的样品载体上,然后用金块溅出样品。
- 将溅出的植入物引入样品室。使用具有代表性的表面和细胞粘附性的区域放大 100 倍、500 倍、1,000 倍和 2,500 倍放大倍数拍摄照片。
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Representative Results
简要总结,人类整个血液被收集在肝素加载的单体,然后汇集,并用于评估细胞计数的基线水平以及血浆血相容性标记。
随后,装有神经血管植入样本的管子被填充,血液在150mL/min和37°C使用蠕动泵被灌注60分钟。再次,对所有组细胞数进行分析,并为ELISA分析制备血浆样本(图1)。血细胞和血液参数的定量,如血红蛋白和血细胞,直接在采血后,以及灌注后灌注在流循环模型的所有样品类型和控制。未检测到关于 WBC(图 2A)、RBC(图 2B)或造细胞值(图 2C)的变化。然而,与基线值相比,在流循环模型中孵育血液后,血红蛋白水平有所下降,这是因为血液在流循环系统中注入(图2D)。此外,由于血液灌注,血小板数量减少。此外,当管中存在未涂层支架时,这种效果也有所增加,这表明血小板与生物材料的粘附性。然而,它清楚地证明,当未涂层支架用血液孵育时,血小板的流失明显更高,而不是纤维蛋白-肝素涂层支架(图2E)。
灌注后,在测试组中也调查了造血血浆标记物的潜在变化,并将与新鲜抽取的血液的基线值进行比较。反映凝血系统的活化状态的TAT复合浓度,由于血液灌注而略有增加(图3A)。然而,在裸机支架组中,检测到TAT显著增加,这表明凝固系统严重激活。纤维蛋白-肝素涂层支架阻止了凝固系统的激活,因为未确定TAT增加。
灌注导致补数级联的激活增加,这是通过测量SC5b-9确定的(图3B)。然而,用未涂层或纤维蛋白-肝素涂层支架孵育并没有进一步增加SC5b-9浓度。通过定量PMN-乳酶浓度分析中性粒细胞的活化情况时,也得出了类似的结果(图3C)。
使用SEM对支架表面进行可视化。在血液孵育后检测到两个支架组之间的明显差异。在未涂层支架的表面存在密集的血细胞和蛋白质网络,但在纤维蛋白-肝素涂层支架的表面未检测到蛋白质或细胞的粘附(图4)。
图1:在完善的流循环模型中支架的血容性评估的原理图概述。新鲜的人类全血从含有肝素的血管的健康献血者中收集,用于抗凝。对于每个供体,空管以及预装样品材料的管随后充满新鲜血液,并在37°C下以150 mL/min的速度孵育在流循环中60分钟。 此外,血浆样本从新鲜抽取的血液中制备,以获得每个供体的基线值。孵育后,使用特定的ELISA制备和分析测试管中的血浆样本,包括样品材料和无样品材料。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2:在流回路模型中分析不同支架植入物孵育前后的不同细胞类型和血液参数。对白血球(A)、红血球(B)、血细胞(C)、血红蛋白(D)和血小板(E)进行了测定。数据显示为平均值 = SEM(n = 5,p= < 0.5,p= < 0.001)。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3:使用神经血管植入物孵育前后确定血小板或免疫系统激活标记物。使用ELISA对血液凝固(TAT)、 (B) 补补系统 (SC5b-9) 和 (C) 嗜中性粒细胞 (PMN-血清酶) 的标记物进行量化。对在流回路模型中用不同支架孵育的新鲜抽血或血液采集的血浆样本进行分析。数据显示为均值 = SEM(n = 5,p= < 0.5)。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:扫描用血液孵育后支架的电子显微分析。观察到未涂层支架材料上的血浆蛋白和血小板的聚集。相比之下,纤维蛋白-肝素涂层的支架材料没有显示细胞或其他血液成分在表面上的粘附性(放大倍率为500倍、1,000倍和2,500倍)。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议描述了一种全面可靠的方法,用于在模拟人类血流的剪切流模型中,根据ISO 10993-4对血液接触植入物进行血液相容性测试。这项研究基于激光切割神经血管植入物的测试,但可以通过各种样本进行。结果表明,该方法能够广泛分析各种参数,如血细胞计数、几种血合性标记的患病率以及血液接触后设备表面的微观可视化。使用此协议,可以检测到不同设备与系统相容性的潜在差异。
体外性同质性评估的替代方案包括体内动物试验,这与一些缺点有关,例如由于组织损伤的压倒性短期影响而导致设备相关效应的变异性较高和失真。
对于体外血合一测试,有三种类型的模型可供选择:(1)静态血液孵化模型,(2)激动血液孵化模型,(3)剪切流模型。静态模型提供了一种简单而快速的方法,通过直接用血液孵化设备来确定血栓的成因性,但它只会导致关于血合性11的基本结果。为了克服静态模型(即血细胞沉淀和大型空气接触表面)的主要缺点,可以使用搅拌血液孵化模型,其中含有植入物的试验室充满血液,并在摇落平台上孵育12。但是,与现有的剪切流模型(如此处介绍的流循环)相比,这些模型类型仍然较差。这些模型的精髓是血管人血流可以模仿;因此,可以显示植入物和血细胞之间真实相互作用的紧密描述。除了流回路模型外,钱德勒环或多个渗透流室等模型存在14、15、16。
钱德勒环是一个封闭的管系统,部分填充空气,并夹在旋转装置,导致血液循环通过管17。在目前的流循环系统中,管子完全充满血液,并且使用蠕动泵强制流动。使用 Chandler 循环模型时,由于要求将空气纳入测试管,操作员面临两大缺点。首先,众所周知,血液和空气的不断相互作用触发白细胞和血小板的聚集,以及蛋白质变性18,19。第二,血液循环率是有限的,因为空气总是保持在循环20的最高点。
使用流循环系统时,可以克服这些缺点。由于系统中不存在空气-液体接口,因此不会发生血小板激活。因此,该模型对血栓事件的背景较低,因此,即使应用了高流速,抗凝剂的低浓度(通常为 1 IU/mL 或肝素为 1.5 IU/mL)也足以防止凝血。可调节泵调节的血流速率和自由选择的管径使操作者能够模拟静脉或动脉的生理条件,与要测试的植入物相对应,并取得相关测试结果21。然而,这一优势同时是一个限制,由于机械应力施加到血液通过泵,和红细胞的破坏(即溶血)可能发生2。这种产生的内在血液损伤降低了方法的敏感性,并阻碍了长期接触血液21。然而,一些研究表明,流回路模型有效地用于同感评价22,23,24。
然而,所有体外模型和体内机制之间的主要差距包括缺失的内皮,它表示细胞因子、抗血栓成分和粘附分子;因此,该成分在植入物和循环血液25的相互作用中起着至关重要的作用。总之,流回路模型是可调的,高效,可靠,并且具有成本效益,用于评估植入物在临床使用前的共性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
对于扫描电子显微镜的性能,我们感谢来自图宾根大学医院医学材料科学和技术部分的恩斯特·施魏泽。这项研究得到了国家可持续发展方案二(BIOCEV-FAR LQ1604项目)和捷克科学基金会第18-01163S项目(BIOCEV-FAR LQ1604)中CR的青年和体育部的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
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