Summary
We beschrijven een methode om harige wortels te induceren door Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie in Tartary boekweit(Fagopyrum tataricum). Dit kan worden gebruikt om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten in Tartary boekweit te onderzoeken, worden aangenomen voor elke genetische transformatie, of gebruikt voor andere geneeskrachtige planten na verbetering.
Abstract
Tartary boekweit (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] bezit verschillende biologische en farmacologische activiteiten omdat het overvloedige secundaire metabolieten zoals flavonoïden, vooral rutine bevat. Agrobacterium rhizogenes zijn geleidelijk wereldwijd gebruikt om harige wortels in medicinale planten te induceren om genfuncties te onderzoeken en de opbrengst van secundaire metabolieten te verhogen. In deze studie hebben we een gedetailleerde methode beschreven om A. rhizogenes-gemedieerde harige wortels in tbc te genereren. Cotyledons en hypocotyledonaire as op 7-10 dagen werden geselecteerd als explants en besmet met A. rhizogenes die een binaire vector, die onvoorziene harige wortels die verscheen na 1 week veroorzaakt. De gegenereerde harige worteltransformatie werd geïdentificeerd op basis van morfologie, resistentieselectie (kanamycine) en reporter genexpressie (groen fluorescerend eiwit). Vervolgens werden de getransformeerde harige wortels naar behoefte zelf gepropageerd. Ondertussen werd een myeloblastose (MYB) transcriptiefactor, FtMYB116, omgezet in het TB-genoom met behulp van de A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels om de rol van FtMYB116 in het synthetiseren van flavonoïden te verifiëren. De resultaten toonden aan dat de expressie van flavonoïde-gerelateerde genen en de opbrengst van flavonoïde verbindingen (rutine en quercetine) aanzienlijk waren (p < 0,01) gepromoot door FtMYB116, wat aangeeft dat A. rhizogenes-bemiddelde harige wortels kunnen worden gebruikt als een effectief alternatief instrument om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten te onderzoeken. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol dat in deze studie wordt beschreven voor het genereren van harige wortels kan worden aangenomen voor elke genetische transformatie of andere geneeskrachtige planten na aanpassing.
Introduction
Tartary boekweit (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) is een soort dicotyledon behorend tot het geslacht Fagopyrum en de familie Polygonaceae1. Als een soort van Chinese geneeskunde homologe voedsel, tbc heeft aanzienlijke belangstelling ontvangen als gevolg van de onderscheidende chemische samenstelling en diverse bio-activiteiten tegen ziekten. Tbc is voornamelijk rijk aan koolhydraten, eiwitten, vitaminen en carotenoïden, evenals in polyfenolen zoals fenolzuren en flavonoïden1. Verschillende biologische en farmacologische activiteiten van flavonoïden, waaronder antioxidatieve, antihypertensieve2, en ontstekingsremmende evenals antikanker en antidiabetische eigenschappen, zijn aangetoond3.
Agrobacterium rhizogenes is een bodembacterie die bijdraagt aan de ontwikkeling van harige wortelziekte in verschillende hogere planten, vooral dicotyledons, door het infecteren van wondplaatsen4,5. Dit proces wordt geïnitieerd door de overdracht van het T-DNA in het wortelopwekkende (Ri) plasmid5,6 en gaat vaak gepaard met de integratie en expressie van een exogen eergen uit de Ri plasmid en de daaropvolgende stappen van het genereren van het harige wortelfenotype7. A. rhizogenes-gemedieerde transgene harige wortels, als krachtig instrument op het gebied van plantaardige biotechnologie, zijn het meest gebruikt vanwege hun stabiele en hoge productiviteit en gemakkelijke verkregen in een korte periode. Bovendien onderscheiden harige wortels veroorzaakt door A. rhizogenes zich efficiënt door hun plagiotropische wortelontwikkeling en een sterk vertakkende groei in een hormoonvrij medium8. Ze kunnen worden gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waaronder kunstmatige zaadproductie, wortelknobbelonderzoek, en bij het bestuderen van de interacties met andere organismen zoals mycorrhizal schimmels, aaltjes en wortelpathogenen7,9. Bovendien zijn harige worteltransformatieculturen op grote schaal gebruikt als experimenteel systeem om de biochemische trajecten en chemische signalering te onderzoeken en om secundaire metabolieten van planten te produceren die worden gebruikt als farmaceutische producten, cosmetica en levensmiddelenadditieven8,10. De waardevolle secundaire metabolieten, waaronder indole alkaloïden, aconites, tropane alkaloïden, terpenoïden en flavonoïden, gesynthetiseerd in wilde harige wortels zijn onderzocht voor meerdere decennia in tal van soorten, zoals ginsenoside in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, en fenolverbindingen in TB2,13.
Harige wortels zijn geproduceerd met behulp van A. rhizogenes in 79 plantensoorten uit 27 families14. Bijvoorbeeld, A. rhizogenes-gemedieerde harige wortel transformatie is gemeld in sojabonen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, en witloof(Cichorium intybus L.) 20. TB harige wortel transformatie is ook onderzocht2. Weinig gedetailleerde protocollen zijn beschikbaar met betrekking tot de ontwikkeling van harige wortels bemiddeld door A. rhizogenes ofwel het dragen van een binaire vector of niet. Zo introduceerden Sandra et al.21 een methode voor de productie van transgene aardappelharige wortels die in wilde scheuten worden ondersteund. De volledig ontwikkelde harige wortels kunnen 5-6 weken na de injectie van A. rhizogenes worden gevisualiseerd die het gus reporter gen in de stengelinternodes van aardappelplanten vervoeren. Een andere studie had ook gemeld een transgene harige wortelstelsel geïnduceerd door A. rhizogenes herbergen de gusA reporter gen in jute(Corchorus capsularis L.) 22. Bovendien verkregen Supaart et al.23 transgene tabaksharige wortels met behulp van A. rhizogenes getransformeerd met de expressievector pBI121 die het gen van Δ1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase draagt om THCA te produceren.
Echter, een stap-voor-stap proces voor een effectieve generatie van harige wortel transformatie, vooral in TB, is relatief minder aangetoond. In deze studie hebben we beschreven een gedetailleerd protocol met behulp van A. rhizogenes die de reporter gen (GFP), een selectieve marker (Kan), en een gen van belang (b4, een geïdentificeerd uit onze groep, maar ongepubliceerd gen uit fundamentele helix-loop-helix(bHLH) familie) om harige wortel genetische transformatie in TTb te genereren. Het experiment duurde 5-6 weken, van de inenting van zaden tot het genereren van harige wortels, waarbij de explant voorbereiding, infectie, coculturing, subculturing, en de daaropvolgende voortplanting. Bovendien werd A. rhizogenes die een binaire plasmid bevat die het tbc-transgene van myeloblastosetranscriptiefactor 116(FtMYB116)draagt, gebruikt om te bepalen of FtMYB116 de accumulatie van flavonoïden, met name rutine, in tbc kan bevorderen op gen- en metabolisch niveau door de tbc-harige worteltransformatie. FtMYB116, dat is een licht-geïnduceerde transcriptie factor, regelt de synthese van rutin ei onder verschillende lichtomstandigheden5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoïde-3'-hydroxylase (F3'H), en flavonol synthase (FLS)24 zijn belangrijke enzymen die betrokken zijn bij de metabole route van rutine biosynthese. Daarom toont deze studie de overexpressie van FtMYB116 bij tbc harige wortels en de expressie van belangrijke enzymgenen, evenals de inhoud van rutine en andere flavonoïden zoals quercetine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De tbc gebruikt in deze studie werd genoemd als BT18, die afkomstig is van het ras van "JinQiao No.2" geteeld door het Research Center of Small Miscellaneous Grain van Shanxi Academy of Agricultural Science. De primaire stappen van dit protocol worden geïllustreerd in figuur 1.
OPMERKING: Bedien explants-gerelateerde manipulatie snel, en waar mogelijk, houd de petrischaaltjes gesloten om verwelking en verontreiniging te voorkomen. Tenzij anders vermeld, werden alle explant incubaties uitgevoerd onder de voorwaarde van een 14-h licht en een 10-h donkere fotoperiode bij 25 °C. Tenzij anders vermeld, alle explants- of bacteriën-gerelateerde operaties werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden in een laminaire stroom kap. Alle media-ingrediënten voor A. rhizogenes en in vitro plantenculturen zijn opgenomen in tabel 1. Na het aanpassen van de pH, werden alle media autoclaved bij 120 °C voor 20 min. Gestolde media werden voorbereid door 25 mL van middel in een Petrischaal van 9 cm diameter te vullen en het toe te staan om te stollen.
LET OP: Stort alle genetisch gemodificeerde bacteriën en planten in de juiste afvalcontainer. Bedien alle gevaarlijke chemicaliën in een rookkast en deponeren ze in de container met gevaarlijk afval.
1. Bereiding van tbc-explanten
- Bereiding van tbc-zaden
- Selecteer mollige en onbeschadigde tbc-zaden(figuur 1A1) die gedurende niet meer dan 2 jaar bij een temperatuur van minder dan 20 °C zijn bewaard gebleven.
- Week de zaden ongeveer 20 m in water bij 28 °C, zodat de zaadlaag gemakkelijk kan worden afgepeld (figuur 1A2). Gebruik indien nodig een schaar om een sleuf op de zaden te snijden om de peeling te vergemakkelijken.
- Sterilisatie van tbc-zaden
- Doe 100-200 geschilde zaden in een gesteriliseerde conische kolf van 100 mL.
- Desinfecteer de zaden met 75% ethanol gedurende 30 s.
- Vervang de ethanol door 5% natriumhypochloriet en desinfecteer gedurende 15 min.
OPMERKING: Desinfectie met kwikbichloride bij een concentratie van 1 g/L gedurende 8 min kan worden gebruikt als alternatieve sterilisator ter vervanging van natriumhypochloriet in geval van ontoereikende sterilisatie.
LET OP: Kwikbichloride is gevaarlijk en geen milieuvriendelijk materiaal. Bedien het in de fumingkast en deponeren in de container voor gevaarlijk afval, als kwikbichloride in ieder geval wordt gebruikt. - Giet het natriumhypochloriet uit.
- Was de zaden 5 keer met steriel gedeïoniseerd water.
- Dep de zaden droog met een steriel bibulous papier.
- Bereiding van tbc-zaailingen
- Bereid 50 mL Murashige en Skoog (MS) basale medium (1962) aangevuld met 30 g/L sacharose en 7 g/L agar poeder (MSSA) (Tabel 1) in een 300 mL plant weefsel cultuur fles.
- Pas de pH aan tot 5,8 voor het autoclaven.
- Verdeel 10 zaden gelijkmatig per fles MSSA medium.
- Ontkiem de zaden in een kweekruimte bij 25 °C ± 1 °C onder de lichtconditie gedurende 7-10 dagen.
- Bereiding van steriele explants
- Selecteer robuuste zaailingen van tbc(figuur 1C),wanneer de 2 stukken cotyledons worden uitgeklapt.
- Snijd de zaailingen van de wortels (Figuur 1C roodstreepje pijlpunten),het vermijden van contact met het medium.
- Leg ze in een steriele petrischaal.
- Snijd de hypocotylen in segmenten van 0,8-1 cm en shoor de cotyledons in stukken van ongeveer 0,5 cm.
- Precultuur deze explants op MSSA medium onder de lichtvoorwaarde voor 24 uur.
- Breng ze in een 100 mL gesteriliseerde conische kolf, die nu klaar zijn voor infectie.
2. Voorbereiding van A. rhizogenes voor transformatie
OPMERKING: De A. rhizogenes stam ACCC10060 werd vriendelijk verstrekt door het Instituut voor Medicinale Plantenontwikkeling en bewaard bij −80 °C. A. rhizogenes werd getransformeerd met de binaire vector pK7GWIWG2D (II) die een T-DNA herbergt dat het b4-gen bij een GFP als indicatorgen en het Kan-resistentiegen als selecteerbare marker draagt. Het gen b4 is een lid van de transcriptiefactor bHLH familie, die nog niet is gepubliceerd. Om het potentieel van tbc harige wortels te evalueren, werd A. rhizogenes getransformeerd met de binaire vector pK7WG2D die het MYB116-gen bevat om het effect ervan op de productie van secundaire metabolieten zoals flavonoïden op het niveau van genexpressie en door metabole analyses te onderzoeken. Geactiveerde A. rhizogenes moet tegelijkertijd goed voorbereid zijn met de explants.
- Activering van A. rhizogenes
- Dooi A. rhizogenes op ijs
- Dompel de bacteriën en lijn ze gelijkmatig op gist mannitol medium (YEB) aangevuld met 15 g/L agar poeder, 50 mg/L rifampicin, en 50 mg/L spectinomycine (YEBARS, pH 7.0).
- Incubeer de bacterie bij 28 °C gedurende 12-16 uur.
- Kies een monoklonale kolonie en cultuur het in een andere petrischaal op dezelfde hierboven beschreven manier.
- Selecteer monoklonale kolonies en kweek ze in een gesteriliseerde conische kolf van 100 mL met 20 mL YEB-medium aangevuld met 50 mg/L rifampicin en 50 mg/L spectinomycine (YEBRS, pH 7.0) bij 28 °C en 200 tpm voor 16-18 uur tot de OD600-waarde 2,0 bereikt.
- Incubeer 2%–4% van de bovengenoemde cultuur in een andere conische kolf van 100 mL met 20 mL YEBRS-medium bij 28 °C en 200 tpm voor 4-5 uur totdat de OD600-waarde ongeveer 0,5 (figuur 1D) bereikt.
3. Infectie en screening van tbc-explants
OPMERKING: Het doel van dit protocol is het verkrijgen van genetisch getransformeerde harige wortels. De wilde wortels werden gebruikt als de negatieve controle om de transgene expressie te beoordelen. In dit protocol werd A. rhizogenes getransformeerd met binaire vector ofwel pK7WG2D die het gen van FtMYB116 of pK7GWIWG2D (II) droeg het gen van b4 op voorhand.
- Resuspension van A. rhizogenes
- Breng de cultuur verkregen in stap 2.1.6 in een 50-mL gesteriliseerde centrifugaalbuis.
- Draai op 4.000 x g voor 10 min bij 20 °C.
- Verwijder de supernatant en breveer de bacteriële pellet met MS-medium aangevuld met 30 g/L sacharose en 300 μM acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5.8) tot OD600 ∙ 0,2.
- Infectie van explants
- Breng de in stap 3.1.3 verkregen bacteriële suspensie in een conische kolf met de explants die in stap 1.4.6 voor 10 min zijn bereid (figuur 1E).
- Haal de explants eruit en dep ze droog met een steriel bibulous papier.
4. Cocultuur van explants met A. rhizogenes
- Plaats een steriel filterpapier met een diameter van 9 cm op het MS-medium, dat is gestold met 7 g/L agarpoeder aangevuld met 30 g/L sacharose en 100 μM AS (MSSAAS medium, pH 5.2).
- Overlay de explants op het filterpapier op 25 °C gedurende 3 dagen in het donker (figuur 1F).
5. Inductie en selectieve cultuur
- Plaats ongeveer 20 besmette explants op het MSSA-medium aangevuld met 500 mg/L cefotaxime en 50 mg/L kanamycine (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (figuur 1G).
- Bebroed ze verticaal onder de lichttoestand bij 25 °C ± 1 °C. De harige wortels komen ongeveer 1 week na incubatie voor(Figuur 1H black-dash pijlpunten geven het optreden van harige wortels aan).
LET OP: Vervang MSSACK medium om de 15 dagen indien nodig.
6. Subculturing TB harige wortels
OPMERKING: Deze procedure is gericht op het oogsten van krachtige harige wortels. Observeer regelmatig de groei van harige wortels tijdens de voortplanting, en verwijder de besmette en geïnactiveerde degenen in een tijdige wijze. Herhaal indien nodig de volgende stappen om meer harige wortels te verspreiden. Het duurt ongeveer 10-14 dagen van subculturing tot oogst.
- Selecteer de harige wortels met een wit uiterlijk en snelle groei.
- Snijd ze in stukken van 2-3 cm.
- Duidelijk nummer ze op een schone bank.
- Subkweek ze in een 100 mL gesteriliseerde conische kolf met 5 mL MS medium aangevuld met 30 g/L sacharose en 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) bij een roterende snelheid van 80 rpm bij 25 °C in het donker totdat ze overspread naar de bodem van de kolf (figuur 1I).
7. Identificatie van getransformeerde harige wortels en conservering
OPMERKING: Getransformeerde harige wortels kunnen worden geïdentificeerd op basis van de aspecten van morfologie en genniveau. Identificatie kan ook worden uitgevoerd volgens het harige wortelgenoom en de weerstand, die niet in dit protocol worden behandeld. Deze procedure richt zich voornamelijk op reporter gen en doel gen identificatie.
- Verwijder tawny en verontreinigde harige wortels en selecteer die met witte uitstraling.
- Evalueren of er groene fluorescentie onder een blauw / licht dual ultraviolet transilluminator.
- Selecteer de harige wortels vertonen een sterke fluorescentie signaal in de genummerde buizen of verpakt met behulp van een gemarkeerd aluminiumfolie na het uitdrogen van hen uit met een absorberend papier.
- Lyophilize ze in vloeibare stikstof, gevolgd door het opslaan van alle oogst op −80 °C voor verder onderzoek.
- Genidentificatie
- Trituraat 0,1 g van de harige wortels in fijn poeder in vloeibare stikstof.
- Bereid het genomische DNA van onafhankelijke transgene lijnen van tbc met behulp van de gewijzigde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) methode25 volgens de instructie van de fabrikant van de plant genomische DNA kit.
- Polymerase kettingreactie (PCR) uitvoeren met behulp van 100 ng genomische DNA-sjabloon en primers vermeld in tabel 2.
- Voer de versterkingscyclus als volgt uit: predenaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, denaturatie bij 94 °C voor 30 s, primer annealing bij 55 °C voor 30 s en primeruitbreiding bij 72 °C voor 30 s. Na 36 cycli en een laatste uitbreidingsstap bij 72 °C gedurende 10 min, analyseer de versterkingsproducten op 1% agarosegels.
- Vlek de gels met nucleïnezuur vlekken en visualiseren ze onder UV-licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde TB harige worteltransformatie
Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol dat is ingesteld om genetisch getransformeerde harige wortels te verkrijgen met behulp van A. rhizogenes. Het duurde ongeveer 5-6 weken van de inenting van tbc-zaden tot het oogsten van de geïdentificeerde harige wortels, en enkele belangrijke stappen zijn afgebeeld in figuur 1 (A-H). Kort werden gesteriliseerde gepelde zaden ingeënt(figuur 1B) om een snellere steriele kieming te bereiken. A. rhizogenes (figuur 1D) en steriele explants moeten respectievelijk van tevoren worden geactiveerd en bereid. Dit wordt gevolgd door enkele belangrijke stappen, waaronder infectie van explants met geactiveerde A. rhizogenes (figuur 1E),cocultuur (figuur 1F), en selectieve cultuur (figuur 1G). De besmette explants moeten gelijkmatig op het gestolde MS-medium worden geplaatst en er moet ruimte tussen hen worden gehouden om de verschillende transgene lijnen gemakkelijk te scheiden. Harige wortels verschijnen met een pluizige witte kleur op een plagiotropische manier in de wondplaatsen van de explants (Figuur 1H). De harige wortels vormen een sterk vertakte en een met elkaar verbonden matrix en kunnen naar behoefte worden gepropageerd(figuur 1I). De geoogste harige wortels kunnen worden gebruikt om de genfunctie of de gen- of eiwit-eiwit interactie te onderzoeken. Als alternatief kunnen de tbc harige wortels massaal worden gepropageerd om secundaire metabolieten zoals rutine in aangewezen bioreactoren op te leveren.
De methode om transgene harige wortels in tbc te induceren is onderbouwd met behulp van een binaire vector(pK7GWIWG2D (II)die de genen GFP en b4 (een lid van de transcriptiefactor bHLH-familie, nog niet gepubliceerd) draagt. Het reportergen GFP werd gebruikt om de transgene harige wortels gemakkelijk te onderscheiden van de niet-transgene wortels door het signaal te visualiseren onder een blauw/licht dubbele ultraviolette transilluminator (figuur 2) of door het doelgen te identificeren (figuur 3). De getransformeerde harige wortels vertoonden groene fluorescentie wanneer ze onder blauw of ultraviolet licht worden verlicht (vertegenwoordigd met behulp van mee-eters in figuur 2A),terwijl de niet-getransformeerde harige wortels de groene fluorescentie niet vertoonden(figuur 2B). De harige wortels met een hoog GFP-signaal werden twee weken lang gepropageerd, zoals blijkt uit figuur 2C.
Om verder te bepalen of de binaire vector met succes is omgezet in het TB-genoom, werden genidentificaties uitgevoerd. Kortom, plant genomic DNA van de TB harige wortels werd voorbereid voor PCR-analyse op basis van de gewijzigde CTAB methode25. PCR werd uitgevoerd door het versterken van de genen (Kan, GFP, en b4), die aanwezig was in figuur 3, respectievelijk. De primers zijn opgenomen in tabel 2. De aanwezigheid van de 3 genen in alle transgene lijnen (Figuur 3, rijstroken 5–11) gaf aan dat de binaire vector met succes is omgezet in het tbc-genoom. Kan en GFP waren afwezig in de wortels van het wilde type (figuur 3, rijstrook 3) en experimentele negatieve controle(figuur 3, rijstrook4), terwijl b4 werd gedetecteerd in de wilde wortels. Deze 3 genen werden ongetwijfeld gepresenteerd in de positieve controle (Figuur 3,rijstrook 2), maar waren blijkbaar afwezig in de negatieve controle ( Figuur3,lane 4).
Evaluatie van de lichtgeïnduceerde transcriptiefactor FtMYB116 in TB met behulp van het eerder genoemde harige wortelstelsel
FtMYB116 werd uitgedrukt door gebruik te maken van het bovengenoemde protocol van harige wortelinductie. Dit werd bereikt door het gen FtMYB116 vooraf in de binaire vector pK7WG2D te plaatsen en vervolgens te infecteren met A. rhizogenes om genoverexpressie te bereiken. Kort, harige wortels van 0,1 g werden triturated in fijn poeder met behulp van vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd door het volgen van de instructies van de fabrikant van plant RNA isolatie kit26. Vervolgens reverse-transcriptie PCR en real-time PCR werden uitgevoerd om FtMYB116 en rutin synthesizing pad gerelateerde genen te versterken. Vervolgens werden de regulerende effecten van FtMYB116 op rutinsynthesegerelateerde genexpressie en de opbrengst van rutine geverifieerd.
Figuur 4A toont de relatieve expressie van FtMYB116 in de transgene lijnen van tbc harige wortels. Vergeleken met de controlegroep vertoonde de relatieve expressie van FtMYB116 een aanzienlijke toename van alle 3 onafhankelijke transgene lijnen. Figuur 4B en figuur 4C illustreren de bevordering van de biosynthese van rutine en quercetine op het metabolische niveau door middel van FtMYB116 overexpressie. De inhoud van rutine en quercetine in de transgene waren aanzienlijk (p < 0,01) steeg in vergelijking met die in het wild-type, het bereiken van 40 en 0,5 mg /g FW, die 8 keer die in het wild-type. De relatieve genexpressies van CHS, F3H, F3'Hen FLS in alle drie de transgene lijnen waren opmerkelijk hoger dan die in de controlegroep (figuur 4D). Samen bevestigden deze resultaten dat de strategie die in deze studie werd beschreven met succes kan worden gebruikt om harige worteltransformatie bij tbc te genereren en de genexpressie en metabolische opbrengst van secundaire metabolieten te onderzoeken.
Figuur 1: Processen om A. rhizogenes-gemedieerdetransgene harige wortels in tbc te induceren. Representatieve beelden van kritieke fasen worden weergegeven: (A1) en (A2) vertegenwoordigen voor en na het afpellen van de zaadlagen; bB) vertegenwoordigt elk 10 zaden die zijn ingeënt in een weefselfles met MSSA-medium; cC) duidt op de zaailingen van tbc op 7-10 dagen na inenting, en de pijlpunten met rood streepje tonen de snijpunten; (D) enE) geven respectievelijk het preparaat van A. rhizogenes (OD600 = 0,5) en de infectie van explanten aan; fF) eng) symboliseren coculturing met geactiveerde A. rhizogenes op MSSAAS medium en selectief kweken op respectievelijk MSSACK-medium; harige wortels komen voort uit (H), zoals blijkt uit de black-dash pijlpunten; eni) de voortplanting van harige wortelvorming aantoont; de black-dash pijlpunten geven de geïnduceerde harige wortels aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Transformatie van de binaire vector die het GFP-reportergen draagt. (A) duidt op de geïnduceerde harige wortels na selectieve cultuur onderzocht onder de blauw / licht dubbele ultraviolettransilluminator. bB) enc) vertegenwoordigen respectievelijk wortel van wilde aard en vermeerdering van getransformeerde harige wortels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: PCR-versterking van genen (Kan, GFPen b4) van genomisch DNA geïsoleerd van wilde wortel en harige wortels van tbc in 7 onafhankelijke transgene lijnen. (A): Kan,b): GFP, (C):b4. Lane 1: molecular size markers (white arrowarrow indicates 750 bp), lane 2: plasmid (binary vector pK7GWIWG2D (II) carrying Kan, GFP, and b4 genes) as the positive control, lane 3: wild-type root, lane 4: purified H2O as the negative control, and lanes 5–11: the 7 independent transgenic lines. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Relatieve expressie van FtMYB116 in de transgene lijnen van tbc harige wortels. (A) en het promotive effect van de overexpressie van FtMYB116 op de biosynthese van (B) rutine en (C) quercetin (Dit cijfer is gewijzigd van Dong et al.5). Experimenten werden uitgevoerd in drievoud en uitgevoerd 3 keer. "**" geeft een significant verschil aan bij p < 0,01 met behulp van student'st-test. (D) Expressie van genen die verband houden met flavonoïde synthesetrajecten in transgene lijnen. Het relatieve expressieniveau werd genormaliseerd tot dat van de actine controle. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Media | Medium ingrediënten | ||
| MSSA | Murashige en Skoog (MS) medium met sacharose in 30 g/L en agarpoeder in 7 g/L, pH 5,8 | ||
| YEBARS (YEBARS) | Gist Mannitol Medium (YEB) met agarpoeder bij 15 g/L, rifampicin bij 50 mg/L en spectinomycine bij 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| YEBRS YEBRS | YEB met rifampicïne bij 50 mg/L en spectinomycine bij 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| MSSAS | MS-medium met sacharose bij 30 g/L en acetosyringone (AS) bij 300 μM, pH 5,8 | ||
| MSSAA | MS-medium met sacharose bij 30 g/L, agarpoeder bij 7g/L en AS bij 100μM, pH 5.2 | ||
| MSSACK | MS-medium met sacharose bij 30 g/L, agarpoeder bij 7 g/L, cefotaxime bij 500 mg/L en kanamycine (kan) bij 50 mg/L, pH 5,8 | ||
| MSSK | MS-medium dat sacharose bevat bij 30 g/L en kan bij 50 mg/L, pH 5,8 | ||
Tabel 1: Media en hun ingrediënten.
| Primer | Reeks (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R Kan-R | TGAATCCAGAAAAGCCCCCA | |
Tabel 2: Primer sequentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tbc is gebruikt in verschillende studies in verband met secundaire metabolieten op genetische en metabolische niveaus1,2,5,27,28. Harige wortelcultuur, als een unieke bron voor metabolietproductie, speelt een centrale rol in de metabole techniek29 en kan worden gebruikt om metabole trajecten te veranderen door het invoegen van de verwante genen. Kim et al.2 introduceerde aanvankelijk de oprichting van tbc harige wortelculturen door A. rhizogenes-gemedieerde transformatie om de productie van fenolische verbindingen te bereiken. De inhoud van rutine dat ze verkregen in de TB harige wortels was meer dan 10 keer hoger dan die in de wild-type wortels. In deze studie leidde de introductie van FtMYB116 tot een hogere expressie van rutin-gerelateerde genen en steeg de productie van rutine in de tbc harige wortels. Deze techniek is bevestigd geschikt te zijn voor fenotypische karakterisering en expressie van fenylpropanoïde-gerelateerde genen zoals FtF3H en FtFLS in tb harige wortels5,30,31. Zhang et al.32 gebruikte tb harige wortels om de productie van rutine te onderzoeken door overexpressing een reeks van FtMYB transcriptie factoren. Zhou et al.33 constateerden een afname van het gehalte aan rutine als gevolg van de overexpressie van FtMYB11 bij tbc harige wortels. Deze resultaten samen met onze bevindingen wijzen op de haalbare effecten van harige worteltransformatie op de interactie tussen FtMYB transcriptiefactoren en rutine biosynthese-gerelateerde genen.
Hoewel er beperkte gegevens zijn met betrekking tot een stapsgewijs protocol voor de inductie van tbc harige wortels, beschrijven we hierin het stapsgewijze protocol voor het eerst om transgene TB harige wortels op een efficiënte en stabiele manier te verkrijgen met behulp van A. rhizogenes die een binaire vector dragen. Tijdens deze experimentele processen moeten tal van factoren zorgvuldig worden overwogen om de optimale geïnduceerde harige wortels te verkrijgen. Ten eerste is de selectie van explants een bepalende factor. TBC cultivars is bekend dat de morfologie van harige wortels en de productie van fenolische verbindingen beïnvloeden. Thwe et al.30 illustreerde die genexpressie in het fenylpropanoïde biosynthetische traject en de inhoud van fenolische verbindingen varieerde tussen tbc cultivars. Ze vonden ook harige wortels in een cultivar, die diep rood-paars vanwege de anthocyanine inhoud13. In onze studie, 2 net ontvouwde cotyledons en hypocotylen werden geselecteerd als de explants. Dit komt omdat jonge en tedere bladeren voorstander zijn van een hoge harige wortel inductie snelheid2,30, terwijl sterk gedifferentieerde en oude plantencellen een negatieve invloed hebben op de harige wortel inductie. Ten tweede heeft de stam van A. rhizogenes een aanzienlijke invloed op harige wortelinductie. Verschillende bacteriële stammen vertonen verschillende transformerende vermogens in termen van morfologieën en inductie-efficiëntie van harige wortels, die kunnen worden verlicht door de verschillende plasmiden gekoesterd door de stammen34. Aye et al.35 vergeleek de effecten van verschillende A. rhizogenes stammen (R1000, R1200, 15834, LBA9402, en A4) op TB harige wortel inductie en fenylpropanoïde biosynthese en vond dat de meest veelbelovende stam voor harige wortelproductie in TB was R1000. Deze bevinding werd ondersteund door Kim et al.2 Niettemin vertoonde de stam ACCC10060 die werd uitgesloten in de studie van Aye et al. maar die in onze studie werd gebruikt, een bevredigende infectieefficiëntie vertoonde. De pluizige witte verschijning van harige wortels verkregen met behulp van ons protocol is in overeenstemming met de harige wortels gegenereerd in Salvia miltiorrhiza36, waarin dezelfde stam ACCC10060 het dragen van de binaire vector pK7GWIWG2D (II) werd gebruikt om het doel gen zwijgen. Ten derde spelen ontkieming, inclusief voorbehandeling van materialen en een concentratie van cefotaxime in selectieve cultuur, ook een cruciale rol bij harige wortelinductie. Onvolledige desinfectie in elke stap kan leiden tot het falen van harige worteltransformatie. Bovendien heeft de bacteriële concentratie een aanzienlijke invloed op de productie van getransformeerde wortels. Hoge concentraties kunnen de plantencellen verminderen door concurrentieremming, terwijl lage concentraties een lage beschikbaarheid kunnen veroorzaken4.
Bovendien spelen kweekomstandigheden zoals het groeimedium, de juiste preculturing en coculturing tijd, en andere biotische of abiotische factoren een belangrijke rol in harige wortelinductie. Huang et al.37 aanbevolen 1/2 MS medium met sacharose bij een concentratie van 30 g/L voor coteelt om maximale tbc harige wortels te bereiken. Dit kan worden verklaard door het hoge zoutmedium dat geschikt is voor harige wortelvorming, terwijl een laag zoutmedium voorstander is van overmatige bacteriële vermenigvuldiging34. AS is een soort fenolische verbinding die a. rhizogenes-gemedieerdetransformatie in een aantal plantensoorten kan vergemakkelijken door de transcriptie van de vir regio van Agrobacterium34,38, en vir effectief kan worden geïnduceerd in een medium met een pH van < 5.739,40. Daarom raden we een cocultuurmedium aan met pH 5.2 aangevuld met 100 μM AS. Huang et al.37 gemeld dat tb harige wortels bleek bruin na dag 24 van wit en lichtgeel. Daarom subkweekten ze elke 24 dagen harige wortels; we raden echter aan om elke twee weken te onderkweken om bruining van harige wortels te voorkomen. Bovendien lijken omgevingscondities zoals licht, hormonen, temperatuur en UV-straling de expressie van flavonoïde biosynthesegerelateerde genen te beïnvloeden door het stimuleren of deprimeren van signaaltransductie41,42. De vorige studie heeft aangetoond dat het belang van ver-rood licht in het toezicht rutin-gerelateerde genexpressie in tbc harige wortels5.
De A. rhizogenes-gemedieerde transformatie heeft het voordeel dat elk exogene gen van belang dat in een binaire vector wordt ingebracht, kan worden overgebracht naar de getransformeerde harige wortelkloon34 om overexpressie, verlies van functie te bereiken via RNA-uitschakeling43, of ontdekking van nieuwe metabole genen door transcriptome analyses5. Harige wortels hebben een groot potentieel om secundaire metabolieten, recombinante eiwitten en evenantibodies te produceren44. Dit is voornamelijk te wijten aan hun gemakkelijke en snelle groei in hormoonvrij medium, minder duur, geen vereiste voor regeneratie in complete planten21, en de relatief hoge opbrengst van secundaire metabolieten in vergelijking met die van het uitgangsmateriaal31. Deze wortels kunnen ook worden gescheiden van de oorspronkelijke explant om op lange termijn, stabiel, en gekenmerkt wortel klonen behoud van hun biosynthetische capaciteit en fenotypes vast te stellen. Al met al, op basis van deze bevindingen, dit protocol biedt een snelle, duidelijke en efficiënte methode om getransformeerde harige wortels te produceren om de productie van secundaire metabolieten te onderzoeken en stelt een referentie voor harige wortel inductie in andere planten. Het potentieel om harige wortelculturen te onderzoeken om enorme opbrengsten van bioactieve verbindingen te genereren, hangt echter af van het juiste bioreactorsysteem waarbij bepaalde parameters, zoals de zuurstofvoorziening, betrokken moeten zijn4,8. Dit protocol is beperkt tot de productie van secundaire metabolieten afgeleid in harige wortels en om het gevisualiseerde fenotype van functionele genen zoals de variantie van kleur en de inhoud van secundaire metabolieten te onderzoeken; de fenotypische veranderingen in de gehele plant, ongeacht het verkrijgen van geregenereerde planten uit de harige wortels, konden in deze studie echter niet worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Fundamental Research Funds voor de Centrale Onderzoeksinstituten voor Welzijn ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L.
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al.
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
