Summary
Apresentamos um ensaio RT-LAMP para a detecção de TiLV em peixes de tilápia usando instrumentos simples durante um período relativamente curto de tempo em comparação com as técnicas convencionais de RT-PCR. Este protocolo pode ajudar a controlar a propagação epidêmica do TiLVD, especialmente nos países em desenvolvimento.
Abstract
A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD), uma doença viral emergente na tilápia causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), é um desafio persistente na indústria da aquicultura que resultou na morbidade e mortalidade em massa da tilápia em muitas partes do mundo. Um ensaio diagnóstico eficaz, rápido e preciso para a infecção por TiLV é, portanto, necessário para detectar a infecção inicial e prevenir a propagação da doença na aquicultura. Neste estudo, um método de amplificação isotérmica mediada em loop de transcrição reversa altamente sensível e prática (RT-LAMP) é apresentado para detectar o vírus do lago tilápia no tecido dos peixes. A comparação dos ensaios RT-qPCR e RT-LAMP das amostras infectadas revelou resultados positivos em 63 (100%) e 51 (80,95%) amostras, respectivamente. Além disso, uma análise das amostras não infectadas mostrou que todos os 63 tecidos não infectados apresentaram resultados negativos tanto para os ensaios RT-qPCR quanto RT-LAMP. A reatividade cruzada com cinco patógenos na tilápia foi avaliada por rt-lamp, e todos os testes mostraram resultados negativos. Tanto as amostras de fígado quanto de muco obtidas de peixes infectados apresentaram resultados comparáveis usando o método RT-LAMP, sugerindo que o muco pode ser usado em RT-LAMP como um ensaio não letal para evitar matar peixes. Em conclusão, os resultados demonstraram que o ensaio RT-LAMP apresentado fornece um método eficaz para detecção de TiLV em tecido de tilápia no prazo de 1h. Por conseguinte, o método é recomendado como ferramenta de triagem nas fazendas para o diagnóstico rápido do TILV.
Introduction
A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD) é uma doença viral na tilápia (Oreochromis spp.) que supostamente causa mortes por tilápia em muitas regiões do mundo, incluindo Ásia1,2, África e América. A doença foi reconhecida pela primeira vez durante a mortalidade em massa da tilápia em 2009 em Israel, onde o número de tilápiasilvestre no Lago Kinneret despencou drasticamente de 257 para 8 toneladas por ano2. A doença é causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), que foi atribuído à família Amnoonviridae como um novo gênero tilápide e uma nova espécie tilápide tilápide3. A caracterização genética do TiLV mostrou que o vírus é um novo vírus RNA de sentido negativo, de sentido único, que tem 10 segmentos codificando 10 proteínas1,2,4. Várias espécies de tilápia do gênero Sarotherodon, Oreochromis, tilapine e outros peixes de água quente (por exemplo, gourami gigante(Osphronemus goramy))mostraram-se suscetíveis ao TiLV2,5. Atualmente, esse vírus continua a se espalhar globalmente, possivelmente através do movimento de peixes vivos infectados6,7, enquanto o risco de transmissão viral através de tilápia congelada ou seu produto é limitado8. A mortalidade substancial por infecção por TiLV tem o potencial de ter um impacto econômico significativamente prejudicial na indústria da tilápia. Por exemplo, o impacto econômico da síndrome da mortalidade no verão no Egito associado à infecção por TiLV foi calculado em US$ 100 milhões9. Nesse meio tempo, é importante desenvolver um método de diagnóstico rápido e adequado para facilitar o controle dessa doença nas fazendas de peixes.
Até agora, o diagnóstico de TiLVD foi baseado em ensaios moleculares, isolamento viral e histopatologia. Diferentes protocolos de PCR e primers foram desenvolvidos para o diagnóstico tilv10,11. Por exemplo, um método de PCR quantitativo de transcrição reversa baseado em verde SYBR (RT-qPCR) com sensibilidade para detectar apenas duas cópias/μL do vírus foi desenvolvido e validado para detecção de TiLV10. Outros métodos de PCR para detecção de TiLV incluem o PCR quantitativo TaqMan11,RT-PCR2,o NS-PCR12aninhado e o RT-PCR13semi-aninhado . No entanto, esses métodos requerem equipamentos de laboratório sofisticados e períodos relativamente longos de tempo para produzir resultados devido à complexidade das reações, o que os torna inadequados para a aplicação em campo.
O ensaio de amplificação isotérmica (LAMP) mediado por loop é uma aplicação rápida, simples e prática para o campo14,15. A técnica emprega o princípio de uma reação de deslocamento de fios, enquanto a reação de amplificação corre sob condições isotérmicas sem um ciclo térmico sofisticado e caro14,15. Consequentemente, produtos LAMP amplificados ou produtos RT-LAMP são analisados em bandas semelhantes a escadas usando eletroforese de gel de agarose com uma mancha fluorescente para visualização segura de DNA ou RNA14 ou observação a olho nu para a presença de turbidez ou um precipitado branco16,17,18. Por essas razões, esta técnica tem sido utilizada para a detecção in loco de diferentes patógenos de peixes17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. O objetivo deste estudo foi estabelecer um ensaio RT-LAMP rápido, sensível e preciso para detecção de TiLV. O ensaio RT-LAMP oferece triagem para TiLV em amostras de peixes dentro de 30 min. A técnica pode ser aplicada para o diagnóstico e vigilância do TiLVD.
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Protocol
Este experimento, que envolveu o uso de tecido animal, foi aprovado pelo Comitê De Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia (número de protocolo ACKU61-VET-009).
1. Coleta de tecidos
- Eutanie peixes de tilápia usando uma overdose de óleo de cravo (ou seja, mais de 3 mL/L). Tricaine metanosulfonato pode ser usado como uma alternativa ao óleo de cravo.
- Use tesouras e fórceps de maionese estéreis para abrir o abdômen da tilápia pós-morte e extirpar aproximadamente 30-50 mg de tecido hepático, ou usando um vidro de cobertura de microscópio, coletar 100 μL de muco raspando a camada de pele do peixe longitudinalmente (de anterior a posterior) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Siga imediatamente para a etapa de extração de RNA ou mantenha a amostra coletada a −80 °C até o experimento. Como o RNA intacto é mais sensível que o DNA, use materiais e reagentes livres de RNase durante a extração de RNA.
2. Extração de RNA
- Para extrair o RNA do tecido hepático, adicione 30-50 mg do tecido da tilápia a um tubo de microcentrífuge de 1,5 mL contendo 600-1.000 μL de reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol(Tabela de Materiais),e pulverize a amostra até homogeneizar o tecidual manual. As amostras de tecido requerem aproximadamente 10% do reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol. Para as amostras de muco, utilize apenas 300 μL do reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol (3:1).
ATENÇÃO: O reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol é tóxico; portanto, o manuseio deve ser realizado com cuidado. Devem ser usados equipamentos de proteção, como óculos de segurança, vestido de laboratório e luvas de segurança. - Centrifugar a amostra homogeneizada a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
- Adicione um volume igual de 95% de etanol ao tubo e misture bem.
- Transfira a solução para uma coluna de giro (Tabela de Materiais) colocada em um tubo de coleta e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente. Descarte o fluxo e transfira a coluna de giro para um novo tubo de coleta.
- Adicione 400 μL de reagente pré-lavagem de RNA(Tabela de Materiais)à coluna e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente antes de descartar o fluxo. Repita este passo mais uma vez.
NOTA: Para preparar o RNA Pré-Lavagem, adicione 10 mL de 95% de etanol a 40 mL de concentrado pré-lavagem de RNA. - Adicione 700 μL de RNA Wash Buffer(Tabela de Materiais)à coluna e centrífuga a 10.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. Transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
NOTA: Para preparar o Tampão de Lavagem de RNA, adicione 52 mL de 95% de etanol a 12 mL de concentrado de tampão de lavagem de RNA. - Elute a amostra de RNA capturada na matriz da coluna de giro com 100 μL de água livre de nuclease e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente.
- Medir a concentração do RNA extraído usando um espectrofotômetro de microvolume e diluir o RNA a uma concentração desejada usando água livre de nuclease.
NOTA: O valor de absorvância qualificado de OD260/OD280 varia de 1,6 a 1,9, indicando a pureza de RNA aceitável para o ensaio RT-LAMP. - Siga para o próximo passo imediatamente ou mantenha a amostra a −80 °C até o uso.
3. Design de primer
- Use primer explorer versão 4 para projetar os primers específicos para o RT-LAMP. Acesse o site, https://primerexplorer.jp/e/ e clique no botão PrimerExplorer V4.
- Selecione o arquivo que contém as seqüências do segmento 3 do TiLV no formato FASTA e clique no botão Primer Design.
NOTA: Recupere as seqüências no formato FASTA a partir do número de adesão do GenBank KX631923, que representa o segmento TV1 do vírus do lago tilápia 31. - Para projetar os primers, insira os seguintes parâmetros básicos:
- Um conteúdo GC de 40%-60%
- Um amplicon de ≥280 pares base (bp)
- Temperatura de fusão similar (Tm) entre primers com uma diferença máxima de 5 °C
NOTA: Os primers não devem se complementar uns aos outros- Evite regiões de seqüência propensas a formar estruturas secundárias.
- Selecione a análise de primer dimer com um mínimo de −3.5 para um design ideal para o maior ΔG, e selecione as extremidades dos primers com um máximo de −4 para um design ideal para o ΔG menor.
- Clique no botão Gerar.
NOTA: Após o software terminar de processar os dados de entrada, os resultados da cartilha serão mostrados (Figura 1).
4. Ensaio RT-LAMP
- Prepare uma mistura mestre RT-LAMP contendo 2,5 μL de tampão de reação SD II de 1x, 3 μL de 6 mM MgSO4,1,4 μL de 1,4 mM dNTP, 4 μL de betaine de 0,8 M, 1,3 μL de mistura de calceína de 0,052 mM, 1 μL de 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL de 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL de 0,2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL de 0,2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL de 0,3 U U DNA polimerase, 1 μL de 0,1 U AMV transcriptase reversa e 3,8 μL de água livre de nuclease por reação.
NOTA: Prepare o excesso de mistura mestre que compreende pelo menos 10% do volume total de reação. - Dispense 22 μL da mistura mestre RT-LAMP em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5.
- Adicione 3 μL do RNA extraído ao tubo de reação e misture a amostra por vórtice. Para o controle negativo, use água destilada em vez de materiais de RNA.
- Incubar a reação a 65 °C por 60 min, seguido de 80 °C por 10 min para encerrar a reação.
- Após a incubação, observe visualmente as mudanças colorimétricas a olho nu. Um resultado positivo aparecerá como uma cor verde fluorescente.
5. Eletroforese de gel de agarose
- Prepare um gel de agarose de 1,5% c/v suspendendo 0,6 g de pó de agarose em 40 mL de tampão TAE de 1x. Derreta a mistura aquecendo-a em um microondas por 3-5 min até que a agarose esteja completamente dissolvida, e gire para misturar.
- Deixe a agarose esfriar até que a temperatura atinja 65 °C. Despeje 40 mL da solução de agarose em uma bandeja de gel e adicione um pente ao molde de gel.
- Deixe o gel de agarose definir em temperatura ambiente por 20-30 min até que tenha se solidificado completamente. Em seguida, remova o pente e coloque o gel no tanque de gel.
- Adicione um tampão de corrida para cobrir a superfície do gel no tanque de gel.
- Adicione 10 μL da amostra RT-LAMP e 2 μL de tampão de carga de gel de 6x para cada poço. Adicione 5 μL de uma escada de DNA de 1 kb à faixa de referência.
- Conecte a tampa presa ao cátodo e ao ânodo conectado a uma fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação, coloque-a em 100 V constantes e funcione por 40 min.
- Depois de completar a separação em gel, remova o gel da bandeja de gel. Em seguida, manche o gel drenado usando brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 10 mg/mL por 7 min e restiná-lo em água destilada por 5 min.
ATENÇÃO: O EtBr é tóxico e considerado cancerígeno; portanto, tenha cuidado ao usar este agente. - Exponha o gel à luz UV usando um sistema de documentação em gel onde as bandas aparecem e tire uma foto do gel.
6. Síntese de DNA complementar (cDNA)
- Prepare uma mistura mestre de síntese de cDNA contendo 2 μL de tampão RT de 5x, 0,5 μL de mistura de primer, 0,5 μL de enzima RT e 2 μL de água sem nuclease por reação.
NOTA: Prepare o excesso de mistura mestre compreendendo 1x a reação devido à perda potencial durante a pipetting. - Dispense 5 μL da mistura mestre em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
- Adicione 100 ng do RNA extraído diluído (obtido a partir do passo 2.8) ao tubo de reação, misture e gire para baixo para mover toda a mistura para o fundo do vaso.
- Incubar as reações a 42 °C por 60 min, seguido por 98 °C por 5 min em uma máquina PCR. Guarde o cDNA a −20 °C até o uso.
7. RT-qPCR
- Prepare uma mistura mestre TiLV qPCR contendo 0,3 μL de primer reverso de 10 μM, 0,3 μL de primer dianteiro de 10 μM, 5 μL de 2x de Polimerase de DNA verde SYBR e 0,4 μL de água sem nuclease por reação. Use os seguintes primers e controles:
Primer dianteiro (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAAAGaggCAATATGGATT-3'
Primer reverso (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - Dispense 6 μL da mistura mestre TiLV qPCR em cada poço da tira qPCR compatível com o ciclotérmico em tempo real utilizado.
- Adicione 4 μL do modelo de cDNA, controle negativo (água sem nuclease), controle positivo (10 pg/μL) e pTiLV (plasmídeo)10 ou plasmídeo TiLV diluído serialmente para o poço, e misture cada amostra por movimento. Conduza cada amostra em triplicado.
- Coloque as reações qPCR no ciclotérmico programado em tempo real. Defina o programa qPCR para realizar a incubação a 95 °C por 3 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 10 s e 60 °C para 30 s antes da etapa da curva de fusão em que a temperatura precisa aumentar de 65 °C para 95 °C a incrementos de 0,5 °C/5 s.
- Conduza a análise dos dados avaliando as curvas de amplificação e fusão e, em seguida, calcule o número de cópias do TiLV usando a curva padrão obtida a partir dos dados usando os plasmídeos diluídos em série.
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Representative Results
Neste estudo, foi desenvolvido um ensaio RT-LAMP para detectar a infecção por TiLV na tilápia. As amostras testadas foram coletadas em 14 fazendas localizadas em diferentes partes da Tailândia entre 2015 e 2016. Os peixes infectados e não infectados foram agrupados principalmente com base em diagnósticos físicos e aparências de TiLVD sintomático. Posteriormente, a infecção por TiLV foi confirmada por meio de RT-PCR após o processo de coleta. A eletroforese do gel de agarose e a detecção de uma cor verde luminescente foram selecionadas como métodos de avaliação dos amplicons LAMP(Figura 2). O fígado e o muco dos peixes infectados e não infectados da tilápia foram caracterizados pelo aparecimento clínico dos sintomas da doença de TiLV, incluindo erosão da pele, vermelhidão da pele, exoftalmos e inchaço abdominal. Relatórios anteriores demonstraram o uso de amostras hepáticas em ensaios diagnósticos moleculares para determinar a presença de TiLV35. Alternativamente, o muco pode ser benéfico no ensaio, pois pode ajudar a evitar matar os animais. Os resultados mostraram um padrão de banda de DNA semelhante à escada e uma cor verde fluorescente no fígado infectado e amostras de muco de peixes infectados(Figura 2),enquanto nenhuma banda de DNA e a cor amarela da calceina foram observadas nas misturas RT-LAMP em tecidos animais não infectados(Figura 2). Curiosamente, uma amostra de tilápia infectada pelo TiLV coletada em uma fazenda na Malásia também foi diagnosticada como positiva usando este ensaio RT-LAMP; no entanto, foram observadas variações no tamanho do produto PCR em relação às amostras coletadas em fazendas tailandesas locais (Figura 2).
Para verificar a sensibilidade e especificidade do ensaio RT-LAMP, foram analisados 63 tecidos infectados pelo TiLV e 63 tecidos não infectados por RT-LAMP e RT-qPCR(Tabela 1). A comparação dos ensaios RT-qPCR e RT-LAMP das amostras infectadas revelou resultado positivo em 63 (100%) e 51 (80,95%) das amostras, respectivamente. Além disso, uma análise das amostras não infectadas mostrou que todos os 63 tecidos não infectados apresentaram resultados negativos usando os ensaios RT-qPCR e RT-LAMP(Tabela 1). Esta análise demonstrou a confiabilidade do ensaio RT-LAMP para detecção primária do TiLV. Para testar a especificidade do ensaio RT-LAMP, foram utilizados tecidos de peixes infectados com outras bactérias e vírus patogênicos, incluindo Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilae Iridovirus foram utilizados como modelos para as análises RT-LAMP e RT-qPCR. Tanto os primers RT-LAMP quanto RT-qPCR apresentaram resultados negativos, sem alterações colorimétricas e sem sinais fluorescentes em nenhuma das amostras testadas(Tabela 2). Além disso, a sensibilidade do ensaio RT-LAMP foi avaliada utilizando-se uma diluição serial de 10 vezes dos modelos de RNA extraídos de peixes infectados pelo TiLV. Comparativamente, o ensaio RT-qPCR foi mais sensível do que o ensaio RT-LAMP, pois o ensaio RT-qPCR tinha um limite de detecção de10-8, enquanto o método RT-LAMP exigia uma diluição de 10-7 vezes para detectar o genoma TiLV-7(Tabela 2).
Figura 1. As seqüências de nucleotídeos dos seis primers RT-LAMP utilizados neste estudo foram específicas para a detecção de TiLV. A posição de cada primer foi alinhada no segmento 3 do genoma TiLV (número de adesão KX631923). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise dos amplicons RT-LAMP obtidos a partir das amostras infectadas pelo TiLV e não infectadas (A) em eletroforese de gel de agarose de 1,5% e (B) por visualização fluorescente. M = 1 kb escada de DNA, 1-2 = RNA dos fígados de peixes infectados pelo TiLV, 3-4 = o cDNA de peixeinfectado com TiLV, 5-6 = RNA do muco de peixe infectado pelo TiLV, 7-8 = linhas celulares de peixes infectados pelo TiLV, 9 = RNA dos fígados de peixes infectados pelo TiLV (Malásia), 10 = RNA dos fígados de peixes não infectados pelo TiLV, 11 = o cDNA de peixes não infectados pelo TiLV, 12 = RNA do muco de peixes não infectados pela TiLV, 13 = nenhum controle de modelo clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipos de amostras | Número de amostras | Validade da detecção (%) | |
| RT-qPCR | RT-LÂMPADA | ||
| Amostras infectadas | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Amostras não infectadas | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabela 1. Verificação de RT-LAMP para detecção de TiLV em amostras de peixes infectados e não infectados usando RT-qPCR e RT-LAMP
| Especificidade | S.a. | F.N. | Football club. | A.h. | I.v. | |||||
| qPCR | Lâmpada | qPCR | Lâmpada | qPCR | Lâmpada | qPCR | Lâmpada | qPCR | Lâmpada | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Sensibilidade | método/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Diluição | ||||||||||
| qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lâmpada | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabela 2. Especificidade e sensibilidade do ensaio RT-LAMP em comparação com RT-qPCR. Para a avaliação de especificidade, o RNA obtido a partir de tecido de peixe infectado com outras bactérias ou vírus, incluindo Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.) e Iridovirus (I.v.), foi usado como modelos para RT-qPCR e RT-LAMP. Para a avaliação da sensibilidade, o RNA obtido a partir de peixes infectados pelo TiLV foi diluído em série 10 vezes de 100 ng para 1 fg e usado como modelos para RT-qPCR e RT-LAMP. Os sinais + e – significam resultados positivos e negativos, respectivamente.
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Discussion
A indústria da aquicultura está continuamente ameaçada por infecções virais que causam perdas econômicas substanciais9,,23,28. Por exemplo, o TiLV emergente representa uma grande ameaça aos países produtores de tilápia em muitas partes do mundo1,6,9. Até agora, não há terapêuticaespecífica disponível para prevenir o TiLVD. Enquanto o desenvolvimento de uma vacina está em andamento, uma vacina eficiente exigirá um tempo substancial antes de ser disponível para fins comerciais. Diante dessas circunstâncias, medidas rigorosas de biossegurança, como a aplicação de desinfetantes, são necessárias em fazendas de peixes para evitar a propagação do TiLVD29,30. Atualmente, uma das medidas de controle mais eficientes para reduzir a transmissão do TiLV é a triagem de peixes juvenis e adultos para a presença ou ausência de TiLV31. Para fins de triagem, a ferramenta de diagnóstico precisa ser rápida, sensível e específica para que possa auxiliar na eliminação das populações infectadas e prevenir a propagação da doença. No entanto, os ensaios moleculares atuais para TiLV são difíceis de implementar no local. Em primeiro lugar, eles exigem pesquisadores habilidosos e equipamentos caros. Em segundo lugar, pode levar vários dias para obter os resultados laboratoriais, o que dificulta o controle e a prevenção da propagação da doença prontamente15,16.
Para superar esses problemas, Notomi et al.14 estabeleceram um novo ensaio de amplificação baseado em ácido nucleico chamado amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) em 2000. Desdeentão,a reação LAMP foi aplicada com sucesso para detectar vários vírus de peixes16,17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,32,,33,,34. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo RT-LAMP para detectar TiLV em amostras de peixes de tilápia. Embora a sensibilidade do método RT-LAMP seja 10 vezes menos eficiente que a do RT-qPCR, o ensaio RT-LAMP pode detectar a presença de um genoma De RNA TiLV tão baixo quanto 100 fg, o que é suficiente para a detecção de TiLV em peixes clinicamente doentes34. Notavelmente, o ensaio RT-LAMP produz um resultado dentro de 60 min e requer apenas um simples banho de água ou instrumentos de bloqueio de calor34, enquanto o ensaio RT-qPCR leva mais tempo e requer equipamentos PCR mais caros em tempo real para a análise15,34. Além disso, o produto final do RT-LAMP foi observado através de uma mudança de cor do corante fluorescente de amarelo claro para verde fluorescente, tornando-o visível a olho nu sem qualquer necessidade de equipamento sofisticado34. Essas vantagens tornam o RT-LAMP adequado para o diagnóstico de campo. Além disso, os achados do estudo sugeriram que tanto o fígado quanto o muco podem ser usados para detecção de TiLV usando RT-LAMP. Semelhante a estudos anteriores, uma amostra não letal usando muco permitiu o diagnóstico de TiLV sem matar peixes ou broodstock valioso35. Recentemente, um ensaio RT-LAMP foi desenvolvido para detectar isolados chineses e tailandeses de seqüências de nucleotídeos TiLV no segmento 1 (região S1) usando um conjunto de seis primers36. O presente estudo demonstrou que o ensaio RT-LAMP desenvolvido diagnosticou um sinal falso-negativo de infecção por TiLV em 27,78% em comparação com o RT-PCR ao utilizar o mesmo conjunto de primer. Em outra comparação, o resultado falso-negativo foi relativamente menor em 19,05% ao detectar o segmento 3 do TiLV em comparação com o RT-PCR. Ao comparar a eficiência do método de detecção viral com outros relatos, foi possível detectar a infecção pelo TiLV em 80,95%, enquanto outros trabalhos detectaram o vírus em 72,22%36 e 82,89%37. Ao todo, pode-se supor que os diferentes componentes do ensaio RT-LAMP, por exemplo, os diferentes conjuntos de primer e os diferentes segmentos direcionados do genoma TiLV são fatores importantes que influenciam a validade do ensaio.
Embora o ensaio RT-LAMP seja uma poderosa ferramenta para o rastreamento de doenças e tenha vários benefícios demonstrativos, este estudo não foi sem limitações. Um dos pontos críticos para o ensaio RT-LAMP foi o design de um conjunto de primer apropriado composto de quatro a seis primers. Para promover a formação das estruturas de laço-tronco dos produtos PCR, os comprimentos apropriados dos genes-alvo ou seqüências de nucleotídeos precisavam ser maiores do que cerca de 500 bp, enquanto os genes-alvo do ensaio RT-PCR tinham de ser relativamente curtos, na faixa de 50-150 bp14,38,39.
Em conclusão, o ensaio RT-LAMP desenvolvido é rápido, econômico, sensível e específico para detecção de TiLV. A análise pode ser concluída dentro de 1h em comparação com 4-5 h para o ensaio RT-qPCR. Notavelmente, o ensaio RT-LAMP é prático para condições de campo, pois resultados positivos podem ser observados a olho nu sem exigir o uso de equipamentos sofisticados.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
O projeto é financiado financeiramente pelo Fundo de Pesquisa da Tailândia (TRF) número de subvenção RDG6050078 e o Centro de Estudos Avançados para Agricultura e Alimentação, Instituto de Estudos Avançados, Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia sob o Projeto de Pesquisa de Pesquisa de Ensino Superior e Nacional da Universidade de Pesquisa da Tailândia, Escritório da Comissão de Educação Superior, Ministério da Educação, Tailândia. A pesquisa é apoiada em parte pela Bolsa de Pós-Graduação da Escola de Pós-Graduação da Universidade Kasetsart. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kwanrawee Sirikanchana pela narrativa falando do vídeo e Piyawatchara Sikarin pela edição do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
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