Summary
산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.
Abstract
산화철로 만든 마그네틱 나노입자는 세포에서 종종 내면화된 다음 그 안에 남겨지는 광범위한 생물 의학 응용 분야에 대한 특이한 관심을 제시합니다. 한 가지 과제는 안정적이고 정밀한 방법론으로 세포 내 환경에서 자신의 운명을 평가하는 것입니다. 본원에서, 우리는 자기 모멘티브를 측정하여 세포 내자기 나노 입자의 무결성을 정확하게 정량화하기 위해 진동 시료 자력계(VSM)의 사용을 소개합니다. 줄기 세포는 먼저 자기 나노 입자의 두 가지 유형으로 표시; 나노 입자는 빠르고 효율적인 마이크로파 기반의 비수성 솔 젤 합성을 통해 생성되는 동일한 코어를 가지며 코팅이 다릅니다: 일반적으로 사용되는 구연산 분자는 폴리아크릴산과 비교된다. 3D 세포-스페로이드의 형성은 원심분리를 통해 달성되고 이러한 스페로이드의 자기 모멘트는 VSM과 다른 시간에 측정된다. 얻어진 모멘트는 나노입자의 무결성의 직접적인 지문이며, 나노입자 분해를 나타내는 값이 감소합니다. 두 나노 입자의 경우 자기 모멘은 배양 시간이 지남에 따라 감소하여 생분해를 드러냅니다. 구연산과 비교했을 때 폴리아크릴산 코팅의 보호 효과도 나타난다.
Introduction
광범위한 생체 의학 응용 분야에 대한 산화철 나노 입자의 자기 기능에 대한 관심이 증가합니다. 자기 공명에 대한 그들의 반응은 자기 공명 화상 진찰을 위한 믿을 수 있는 조영제를 만듭니다 (MRI), 자기 나노 입자로 표지된 세포가 이식1다음생체내에서 추적될 수 있는 재생 의학에서 이점. 자기장을 사용하여, 세포는 또한 거리에서 유도 될 수있다; 이러한 방식으로, 셀룰러 스페로이드2,3,링4,또는 시트5는 자기적으로 설계될 수 있으며, 또한 원격으로자극6,비계없는 조직의 개발에 있는 자산이다. 이들 나노입자에 대한 가능성의 범위는 또한 약물 전달 시스템7,8 및 자기 및 광유도 열 처리를 포함하여 암세포를 죽이는9,10,11을포함한다. 이러한 모든 응용 분야에서, 나노 입자는 정맥 주사 또는 세포의 직접 내재화를 통해 생물학적 환경에 통합된 다음 내부에 남아 있으며, 이는 세포 내 운명에 의문을 제기합니다.
생체 내 분석에서 유기체에서 나노 입자의 운명에 대한 일반적인 이해를 전달 : 혈류에서 주입시, 그들은 먼저 간 (Kupffer 세포),비장과 골수의 대식세포에 의해 주로 캡처되고, 점진적으로 저하되고, 유기체의 철풀에 가입12,13,14,15,16,17, 18,18. 질적 관측은 유기체 전체에 걸쳐 나노 입자의 순환으로 인해 가능하다. 전형적으로, 전송 전자 현미경검사(TEM)는 나노입자를 직접 관찰하는 데 사용될 수 있으며 장기내철의 존재는 투여를 통해 결정될 수 있다. 최근에는 철분 탈출없이 가까운 회로에서 세포 수면에서 직접 평가되어 세포 수준20,21,22에서생체 변환을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 측정은 구조적 무결성에 단단히 연결된 나노 입자의 자기 특성 분석을 통해 가능합니다. 진동 시료 자기측정(VSM)은 시료가 주기적으로 진동하여 유도된 플럭스의 코일 측정이 적용된 자기장에서 시료의 자기 모멘트를 제공하는 기술이다. 이러한 동기 검출을 통해 많은 수의시료(20,21,22,23)의자기 순간을 결정하는 자산인 신속한 측정을 가능하게 한다. VSM에서 검색한 거시적 자기 서명은 나노입자의 크기와 구조와 직접 상관관계가 있는 전체 생물학적 시료에 대한 정량적 개요를 제공합니다. 특히, 시료의 포화(emu에서 발현)에서 자기 모멘트를 제공하며, 이는 샘플에 존재하는 자기 나노입자의 수를 각각 특정 자기 특성에 정량화한다.
자기 나노 입자의 세포 내 처리가 구조적특징(20)에단단히 연결되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 기능은 최적의 합성 프로토콜을 통해 제어할 수 있습니다. 각 프로토콜은 장점과 한계를 제시합니다. 철산화질소 나노입자는 일반적으로철이온(24)의회량화를 통해 수성 용액에서 합성된다. 나노입자 크기의 다각형의 한계를 극복하기 위해 폴리올 매개 솔겔 방법과 같은 다른 합성 방법이25개개발되었다. 열 분해에 의한 비수성 접근법은 매우 잘 보정된 산화질소나노입자(26)의생산으로 이어집니다. 그러나, 올리라민 또는 올레산 과 같은 계면 활성제의 엄청난 양의 사용은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 기능화 및 물 전송을 복잡하게. 이러한 이유로, 우리는 높은 결정성, 순도 및재현성(27)으로이어지는 비수성 솔 젤 경로를 통해 이러한 자기 나노입자를 합성한다. 이 프로토콜은 온도변화(28)를통해 조정할 수 있는 잘 제어된 크기의 나노입자를 생성한다. 그럼에도 불구하고, 전자레인지지원 비수성 솔젤 경로는 약 12nm의 얻어진 나노입자의 상한한계를 갖는다. 이 절차는 실온에서 강자성 입자를 사용하는 응용 분야에 적용되지 않습니다. 코어 합성 외에도 고려해야 할 또 다른 주요 특징은 코팅입니다. 나노 입자의 표면에 누워, 코팅은 나노 입자의 표적 내재화를 돕는 고정 분자 역할을, 또는 분해로부터 나노 입자를 보호 할 수 있습니다. 벤질 알코올은 산소 공급원과 리간드역할을 동시에 하기 때문에, 베어 나노입자는 추가계활성제 나 리간드없이 생산된다. 나노 입자는 계면 활성제 교환 과정없이 합성 후 쉽게 표면 기능화된다.
본명, 나노입자의 2가지 유형은 동일한 코어를 가지고 코팅이 다른 것으로 평가된다. 코어는 빠르고 매우 효율적인 전자 레인지 기반 기술을 사용하여 합성됩니다. 비교된 두 코팅은 구연산으로 구성되며, 생체 의학 응용 분야에서 코팅제로 가장 많이 사용되는 중하나인 29,30,및 폴리아크릴산(PAA), 다수질 기능의 수가 많은 폴리머 코팅. VSM 자기측정측정은 먼저 세포에 의한 나노입자 섭취를 정량화한 다음 줄기세포의 내재화 시 나노입자 구조적 무결성을 직접 평가하는 데 사용된다. 결과는 인큐베이션 농도가 나노입자 섭취에 영향을 미치고 코팅이 저하에 영향을 미치고 PAA의 많은 수의 앵커링 분자가 저하로부터 코어를 보호한다는 것을 보여줍니다.
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Protocol
1. 자기 나노 입자의 합성
- 코어 합성 – 전자레인지 지원
- 용해 400 철 (III) 아세틸 레이스토네이트의 mg (>99.9%) 10mL의 벤질 알코올(BA, 99.8%)에서 30mL 단파 유리 유리 바이알 내에서.
- 서스펜션의 온도를 20분(11.25°C/min의 속도로) 250°C로 높이고 전자레인지 반응기를 사용하여 30분 동안 250°C로 유지한다.
- 벤질 알코올에 매달린 결과 나노입자를 유리 유리병으로 옮기고 30분 동안 네오디뮴 자석을 사용하여 나노입자를 분리한다.
- 이전 100mL 유리 바이알에서 디클로로메탄 10mL, 수산화나트륨 1M, 에탄올, pH 7물(3회)으로 침전물을 세척하여 나노입자를 펠릿화하고 상퍼나탄을 제거한다.
- 1M 염산을 사용하여 물에서 나노 입자 현탁액을 pH 2로 조정한 다음 100 kDa 초원심 필터에서 100 kDa 초원심 필터에서 10 분 동안 2,200 x g로 원심분리기를 조정합니다.
- 여과를 제거하고,10-2M 염산의 12mL를 나노입자 용액에 넣고 원심분리기는 100kDa 초원심 필터에서 10분(3회)에 2,200xg로 첨가한다. 그런 다음 코팅 전에10-2M 염산의 10mL 이내에 나노 입자 용액을 희석시킵니다.
- 코팅
- 100mL 유리 바이알에서 pH 2에서 175 mg의 구연산과 폴리 아크릴산을 희석하고 1M 염산 용액으로 pH를 2로 조정하였다.
- 코팅 분자 용액에 10mL 나노입자수성 분산을 추가하여 코팅 분자와 나노입자 사이의 질량 비 5에 해당한다. 실온에서 자기 교반 하에서 2 시간 동안 동요하십시오.
- 반응 후, 1M 수산화 나트륨으로 pH를 7로 조정한다.
- 100kDa 초원심 필터에서 100kDa 초원심 필터에서 10분 동안 100kDa 초원심 필터로 나노입자 용액을 3회 원심분리합니다. 여과를 제거하고 12mL의 DI 수에서 나노입자 용액을 희석시킵니다.
2. 줄기 세포의 배양 및 자기 라벨
- 37°C 및 5% CO2에서완전한 중간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM)에서 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)를 배양한다. 세포가 90% 합류할 때, 150cm² 당 37°C에서 미리 데워진 트립신-EDTA 10mL을 추가하고 세포를 분리하기 위해 2-3분 동안 둡니다.
- 세포가 분리되는 시기를 알기 위해 밝은 필드 현미경으로 관찰하십시오. MSCGM에서 분리 된 세포를 다시 중단하고 4 개의 150cm² 플라스크로 나눕니다. 4~5번 통로까지 이 방법으로 세포를 증폭시다.
- 세포 라벨링용 자기 나노입자의 용액준비: 글루타민 없이 혈청 무료 로스웰 파크 기념 연구소 배지(RMPI-1640)에서 산화철 나노입자의 선택된 농도를 분산시킵니다. RPMI는 DMEM보다 이온 강도가 낮고 나노 입자 집계 이벤트를 보다 더 잘 예방하기 때문에 나노 입자 인큐베이션 (및 관련 헹구기 단계)에 사용됩니다.
- 세포가 4 또는 5 및 90% 컨할 수 있을 때, MSCGM 배지를 제거하고, 혈청 무료 RPMI(글루타민 없음)로 세포를 헹구고, 150cm2 배양 플라스크당 10mL의 철산화질소 나노입자 용액을 첨가하여 모든 세포를 커버하는 데 필요한 최소 부피이다.
- 37°C및 5%CO2에서 30분 동안 배양한 다음 나노입자 용액을 폐기합니다. 혈청 무료 RPMI-1640 (글루타민 없음)으로 한 번 세척하고 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 연쇄 상류균신 (150cm2 플라스크 당 25 mL)로 보충 된 덜벡코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)로 인큐베이션을 37 °C에서 5 % CO2로 씻어 나노 입자의 완전한 입자를 허용합니다.
3. 줄기 세포 스페로이드 의 형성
- L-글루타민을 함유한 DMEM 고혈당으로 구성된 세포-스페로이드 배양 배지는 50 μM L-아스코르브산 2-인산염, 0.1 μM 덱사메타손, 1mM 나트륨 피루바테, 0.35mM L-프롤린, 인슐린, 인간 전염을 함유한 1% 범용 배양 보충제(셀-프리믹스)로 보충한다.
- 150cm2 플라스크당 37°C에서 0.05%의 10mL를 추가하여 2-3분간 자석 MSC를 분리한다. 세포가 분리되면, 즉시 37 °C에서 미리 따뜻하게 10 % FBS와 1 % 페니실린 연쇄 절제술로 보충 DMEM의 부피의 1/3을 추가하여 트립신을 즉시 비활성화합니다.
- 원심분리기는 5분 동안 260 x g에서 해리된 세포를, 배지를 흡인하고 세포의 작은 부피(150cm² 플라스크당 1mL 미만)로 세포를 다시 일시 중단하여 약 50μL의 배지에서 200,000개의 세포를 갖는 것과 같은 세포-스퍼로이드 배양 배지를 갖는다. 혈전계를 사용하여 셀 번호를 계산하고 필요한 경우 볼륨을 조정합니다.
- 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 갓 준비된 세포-스페로이드 배양 배지 1mL를 추가하고 200,000세포에 해당하는 재일시 중단 된 용액의 부피를 추가합니다.
- 원심분리기는 180 x g에서 자기로 표지된 세포를 튜브 의 바닥에 세포 펠릿을 형성하는 것과 같은 3분 동안, 세포 배양 배지인 상퍼나탄을 유지한다.
- 튜브를 37°C에서 최대 21일 동안 5%CO2로 배양하고, 세포가 완전히 형성된 스페로이드를 초래하는 응집력 있는 3D 구조를 형성하는 배양 시간을 가한다. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
- 주어진 일에, 0.2 M 의 cacodylate로 만든 cacodylate 버퍼로 스페로이드를 두 번 세척하고 실온에서 30 분 동안 증류수로 희석 된 0.1 M 의 캐코딜레이트 버퍼에서 2 % 글루타랄데히드를 사용하여 고정하십시오. VSM 측정 또는 TEM 이미징에 사용될 때까지 고정 스페로이드를 PBS에 저장합니다. 이 고정 단계는 모든 생물학적 과정을 중지하고 장기 보존을 허용합니다.
4. 진동 시료 자력계(VSM)를 이용한 용액 및 셀룰로에서 자기 나노입자의 정량화
- 주어진 양의 자기 나노 입자 용액 (최대 10 μL) 또는 단일 세포 스페로이드를 VSM에 맞게 특별히 설계된 샘플 홀더에 놓습니다.
- 샘플을 VSM에 삽입하고 샘플 오프셋을 검사합니다. 자화 최대값에 해당하는 위치에 샘플을 배치합니다.
- 20 Oe/s 속도로 저자기장(-1500 Oe와 +1500 Oe 사이)에서 첫 번째 측정을 수행합니다.
- 200 Oe/s 속도로 높은 자기장(-30 000 Oe 와 +30 000 Oe 사이)에서 두 번째 측정을 수행합니다.
5. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 분석
- 나노입자 용액의 경우 수성 용액의 10μL을 탄소 코팅 된 구리 그리드에 기입하고 실온에서 건조시키십시오.
- 세포내산화된 나노입자의 경우, 고정된 세포-스페로이드를 오롱차 추출물(OTE)과 0.5%로 0.5% 희석하여 0.1M 카코딜레이트 버퍼로 대조하고, 1%의 오스뮴 테트산화물을 함유한 1%의 오스뮴 테트산화물으로 1.5% 칼륨 시안노퍼레이트를 함유한 후 에폰에 포함된 탈수하였다. 70 nm의 울트라 섹션을 슬라이스하고 쿠퍼 그리드에 보관하십시오.
- 내시경 구획의 관찰을 위해 전체 세포에서 40k로 관찰하기 위해 1k에서 배율로 80 kV에서 전자 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라.
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Representative Results
전자레인지 보조 합성을 사용하여, 단면 8.8 ± 2.5 nm 코어 크기를 가진 자기 나노 입자가 구연산 또는 PAA(도1A)로생성되고 코팅된다. 줄기세포는 30분 동안 주어진 농도로 배양 배지에 분산된 이러한 나노입자로 배양되어 세포 내분(도1B)내내내세포 및 감금을 초래한다. 자기 줄기 세포는 그 때 매체에서 중단되고, 원심분리되고, 형성된 세포 펠릿은 21일까지 배양된다(도1C). 얻어진 스페로이드는 생물학적 과정을 중지하는 것과 같이 고정되고 VSM을 통해 측정될 때까지 PBS에 보관됩니다.
첫째, 나노입자 용액의 자기 모멘트는 VSM을 사용하여 측정된다: 7 μg의 철을 함유하는 나노입자 수성 분산의 10 μL이 측정되고, 얻어진 곡선은 도 2A에표시된다. 이 용액에 물의 존재로 인해, 시료 홀더에, 나노 입자의 초파자기 신호 이외에 다이자기 신호가 캡처됩니다. 도 2A에도시된 바와 같이, 곡선의 제2부 의 경사에 대응하는횡자기상수(M dia)를 측정할 수 있으며, 이러한 상수는 나노입자의 자기 모멘트만을 얻는 것과 같은 뺄 수 있다(M샘플 = M-M디아). 나노입자(Ms)의포화자화는 추출될 수 있다. 수성 분산에 대해 518 μemu에 대응하며, 이는 용액이 나노입자의 52에뮤/g(Fe3O4)에해당하는 74에 에뮤/g의 철(Fe)에 있다는 것을 의미합니다.
세포 스페로이드의 자기 순간도 유사하게 얻을 수 있습니다. 이 경우, 세포-스페로이드(200,000개의 세포로 제작)는 샘플 홀더에 삽입되어 VSM에 배치되고측정(도 2B)이다. 얻어진 자기 모멘트 값은 초기 나노입자 용액의 자수 모멘트보다 훨씬 낮습니다. 그러나 검색 범위 내에 남아 있습니다. 이 특정 샘플의 포화 자화는 69 μemu입니다. 게다가, 이 스페로이드는 52 에뮤/gFe3O4에서포화 값과 일치하는 나노 입자의 1.3 μg (세포 당 나노 입자의 6.7 pg)를 포함합니다. 따라서 이 값은 세포 샘플에서 나노 입자의 양을 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 도 2C에서,구연산 코팅 나노입자의 3농도로 표기된 세포에 대응하는 스페로이드는 라벨링 후 하루 후에 측정된다. 결과는 나노 입자의 섭취가 각각 세포당 철의 1.3, 3, 3 및 6.7 pg를 의미하는 0.3, 0.7 및 1.3 μg의 섭취로 이어지는 0.125, 0.25 및 0.5 mM의 농도와 함께 잠복 농도에 달려 있음을 명확하게 보여줍니다.
생물학적환경(20)과직접 상호 작용하는 표면 코팅의 중요성에 주의가 제기되고 있다. 두 개의 코팅이 여기에 생산되었습니다 : 일반적으로 생체 의학 응용 프로그램에 사용되는 구연산 코팅, 및 PAA 코팅, 킬라팅 기능의 높은 수와. 줄기 세포는 이러한 두 가지 유형의 나노입자로 표지되고 세포 펠릿을 형성하는 것과 같은 원심분리제가 응집력 있는 세포-스페로이드(도3A)가된다. 이들 세포-스페로이드의 자성은 1일과 21일(그림3B 및 도 3C)에VSM을 통해 측정된다. 결과는 나노 입자의 생분해를 나타내는 배양 21일에 대한 자성의 감소를 보여 주며, 이러한 분해는 PAA 코팅 된 나노 입자(도 3B)에더 중요하다(도3C). TEM 이미지는 나노 입자의 분해를 확인하고 더 작은 (6 nm 크기) 밝은 회색 점의 모양을 보여줍니다, 철로드 페리틴의 전형적인. 일부 나노 입자는 특히 PAA 코팅으로 관찰 될 수있다.
도 1: 마이크로웨이브 보조 산화철(Fe3O4)나노입자, 줄기 세포의 내재화 및 세포의 후속 배양을 스페로이드로 합성한다. (A)나노입자 합성의 다양한 단계의 회로도. 첫째, 코어는 비수성 솔 젤 프로시저를 통해 합성된다. 코팅 분자, 구연산 (Cit) 또는 폴리 아크릴산 (PAA), 다음 철 산화물 코어의 표면에 이식. 대표적인 TEM 이미지는 구연산 코팅을 가진 합성된 나노입자를 나타낸다. (B)줄기세포 내의 나노입자 내산화의 회로도, 내산화 시 내성내에 국한된 나노입자를 나타낸 다. 대표적인 TEM 이미지는 또한 내분비에 국한된 세포 내부의 구연산및 PAA 코팅 나노 입자를 보여줍니다. (C)줄기 세포-스페로이드 형성의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: VSM을 통한 시료 자기 모멘트 측정. (A)수성 용액에 분산된 나노입자의 10μL은 VSM을 통해 측정된다. 얻어진 신호는 자기장(B)의 기능에서 이 나노입자 용액의 자기 모멘트를 나타낸다. 물과 샘플 홀더의 존재로부터 오는 횡질은 곡선의 제2 부분의 경사에 해당하고 나노 입자의 자기 모멘트만 얻는 것과 같은 빼기 때문에 측정될 수 있다. 그런 다음 채도(Ms)에서의 자성 모멘트를 결정할 수 있습니다. (B)세포 스페로이드의 자기 순간도 유사하게 얻을 수 있다; 이 경우 단일 세포-스페로이드는 주어진 기간에 측정된다. (C)구연산 코팅 나노입자로 표지된 세포에 대응하는 스페로이드 의 곡선은 0.125mMMM(오렌지), 0.25mMMM(그레이) 및 0.5mM(파란색)의 3개의 독립적인 농도에서 이다산염 코팅 나노입자로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: VSM을 통해 셀룰로에서 자기 나노 입자 분해의 정량화. (A)자기 나노입자로 세포 라벨링시, 세포 펠릿은 원심분리(일0)에 의해 형성된다. 세포는 그 때 연장된 기간 (달) 동안 세포 손실 없이 배양에서 보관될 수 있는 세포-스페로이드를 취급하기 쉬운 결과로 응집력 구조를 형성합니다. (B, C) 본명,구연산(B)또는 PAA(C)로 코팅된2가지 유형의 자기 나노입자는 줄기세포에서 내면화되고 세포는 최대 21일 동안 스페로이드로 배양된다. 1일(주황색 곡선) 및 21일(회색 곡선)을 배양한 스페로이드의 자성은 VSM으로 측정되며, 나노입자의 분해를 나타내는 자성의 감소와 함께 측정된다. 21일째에 찍은 대표적인 TEM 이미지는 약 6nm의 밝은 회색 점이 세포의 내시경 및 세포질 내크기, 페리틴의 전형적인 크기 및 모양, 철 저장 단백질(검은 화살)을 보여준다. 일부 온전한 나노 입자는 주로 PAA 코팅 나노 입자 (갈색 화살표)를 관찰 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
빠르고 효율적인 마이크로파 기반 합성을 사용하여 자기 나노 입자는 제어 된 크기로 쉽게 합성 할 수 있으며 주어진 분자로 더 코팅 할 수 있습니다. 중요한 단계는 작은 분산을 유지하기 위해 진공 상태에서 철소금과 벤질 알코올을 비축하는 것입니다. 벤질 알코올은 용매와 리간드로 동시에 작용하여 추가 리간드 없이 는 교정된 베어 리산화물을 직접 얻을 수 있습니다. 나노 입자가 물에 전달 된 후 벌거 벗은 자기 나노 입자는 쉽게 리간드의 큰 다양한 코팅 될 수있다. 이러한 코팅은 세포 내재화에 영향을 미칠 수 있는 나노입자 및 나노입자 세포 상호작용 특성을 부여하며, 생체 의학 응용에 최소한의 내재화로 엄격하게 제어되어야 하는 파라미터는 세포에 손상을 줄 수 있고 잠재적으로 세포독성발생(31)을발생시킬 수 있다. 자기 측정은 셀룰로에서 자기 나노 입자의 운명뿐만 아니라이 내산화를 평가하는 강력한 도구입니다. 자기 나노 입자를 줄기 세포로 통합하면, 스페로이드는 간단한 원심분리를 통해 형성될 수 있으며, 세포의 증식을 멈추고 세포외 매트릭스 생산을 유도하는 매체에서 배양에 선행될 수 있다. 세포는 높게 응집력이 되고 조직을 만들기 시작합니다. 스페로이드는 취급이 매우 쉽고 생물학적 환경에서 자기 나노 입자의 운명을 장기간 추적 할 수있는 장시간 (개월) 동안 배양 될 수 있습니다. 세포 분열을 중지함으로써, 어머니에서 딸 세포로 나노 입자의 희석이 없다; 더욱이, 이 세포-스페로이드 모델로, 문화21,22,23의달에 걸쳐 철 탈출이 없다는 것을 확인되었습니다. 결과적으로, 자기 값의 감소는 나노 입자의 저하에 만 대응할 수 있으며 세포 밖으로 내보내지는 철이 아닙니다.
세포 스페로이드의 자성은 빠르고 정확한 정량화를 제공하는 VSM을 통해 측정된다. 다른 방법은 VSM에 대한10-6 에뮤에 비해10-7 에뮤 주위에 감도가 있는 VSM보다 일반적으로 더 정확한 초전도 인터페이스 장치(SQUID)를 사용하는 것과 같은 셀룰러 자성을 측정하기 위해 탐구되었지만 운영 비용은32더높습니다. 실험 용 설정에서 2 pg/세포에 열등한 자기 철 용량의 측정을 허용하는 VSM의 감도는 본명에서 철투여량이 2 pg/세포보다 열등하기 때문에 충분히 정밀하여 세포 안내 및 조직 공학 목적을 위해 자기를 향한 세포 어트랙션과 같은 조준 된 용도에 비해 너무 낮을 것이다. VSM과 SQUID 자기측정술은 세포 자성의 정량화를 허용하는 것 외에도 나노입자의 특징에 대한 추가 세부 정보를 제공할 수 있습니다. 얻어진 신호의 분석에 의해, 나노입자의 크기는22,23을 공제할 수 있으며 또한 그들의 자기 특징의 일반적인 개념을 얻을 수 있고, 히스테리시스 및 나노 물질의 강압성은 예를 들어 드러나야 한다. 자석을 향해 끌릴 때 개별 세포의 속도를 측정하는 것으로 구성된 자기혐오 접근법과 같은 대체 자기측정 접근법도 존재하며, 단일 세포의 자성은33,34로추정된다. 단 세포 수준에서 자성은 이런 식으로 얻을 수 있다; 그러나 추가 나노입자 특징을 결정할 수는 없습니다. 또한, 시료 자성에 비례하는 신호를 제공하는 작은 자기 센서는 최근에 유사한 세포 스페로이드 모델과 함께 사용되고 있다. 이 자기 센서는 7일35일동안 자기 나노입자의 생분해를 실시간으로 지속적으로 추적할 수 있게 하였다. 그러나, 이 자기 센서의 신호는 나노 입자의 크기에 따라 달라 지므로 자기 순간으로 직접 변환될 수 없습니다. 이러한 이유로 VSM을 사용하여 실현할 수 있는 각 나노입자 설계, 곡선에 대해 교정 곡선을 수행해야 합니다.
본 원에서 수행된 측정은 세포 환경에서 자기 나노입자의 점진적 분해를 나타내며, 자성의 감소에 의해 표시된다. 그(것)들은 또한 다른 분자로 코팅된 동일 코어가 코팅에 따라 변화하는 비율로 저하된다는 것을 증명합니다. PAA와 구연산 코팅을 비교할 때 PAA는 마그네틱 코어20에강한 고정으로 인해 더 높은 코어 보호기능을 저하시로 이끈다. 세포 내 환경에서 자기 나노 입자의 운명은 세포 스페로이드에 평가됩니다. 그러나 이 방법은 이에 국한되지 않습니다. 실제로, 이미나노입자(22)의운명에 대한 줄기세포 분화의 효과를 평가하기 위해 사용된 세포 현탁액으로 추정될 수 있다. 그것은 밝혀, 분화 경로에 따라, 자기 나노 입자는 세포에 의해 다르게 처리된다, 어떤 경우에는, 그것의 용해시 철의 신 결정화. 따라서 VSM 자기측정은 산화철 나노 물체의 세포 내 처리에 나노입자와 세포 피처의 영향을 더욱 탐구하는 유용한 도구이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 연합 (ERC-2014-CoG 프로젝트 MaTissE #648779)에 의해 지원되었다. 저자는 대학 파리의 CNanoMat physico 화학 특성화 플랫폼을 인정하고 싶습니다 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
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