Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

Abstract

קיפול והרכבה נכונים של חלבונים ומתחמי חלבון חיוניים לתפקוד התא. תאים משתמשים במסלולי בקרת איכות המתקנים, מבודדים או מבטלים חלבונים פגומים כדי לשמור על פרוטאום בריא, ובכך מבטיחים פרוטאוסטזיס תאי ומונעים נזק נוסף לחלבון. בגלל פונקציות יתירות בתוך רשת proteostasis, הקרנה עבור פנוטיפים לגילוי באמצעות נוקאאוט או מוטציות בגנים קידוד מלווה באורגניזם הרב תאי Caenorhabditis elegans תוצאות גילוי של פנוטיפים קלים או ללא ברוב המקרים. פיתחנו אסטרטגיית סינון ממוקדת לזיהוי מלווים הנדרשים לפונקציה מסוימת ובכך לגשר על הפער בין פנוטיפ לתפקוד. באופן ספציפי, אנו עוקבים אחר אינטראקציות מלווה חדשניות באמצעות מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi, הבעת ביטוי מלווה, מלווה אחד בכל פעם, בבעלי חיים הנושאים מוטציה בגן קידוד מלווה או הבעת יתר של מלווה של עניין. על ידי שיבוש שני מלווים כי בנפרד להציג פנוטיפ ברוטו, אנו יכולים לזהות מלווים להחמיר או לחשוף פנוטיפ מסוים כאשר שניהם מוטרדים. אנו מדגימים כי גישה זו יכולה לזהות קבוצות ספציפיות של מלווים הפועלים יחד כדי לווסת את הקיפול של קומפלקס חלבון או חלבון הקשורים פנוטיפ נתון.

Introduction

תאים להתמודד עם נזק חלבון על ידי שימוש במכונות בקרת איכות לתקן, לבודד או להסיר חלבונים פגומים1,2. קיפול והרכבה של מתחמי חלבון נתמכים על ידי מלווים מולקולריים, קבוצה מגוונת של חלבונים שמורים מאוד שיכולים לתקן או לבודד חלבונים פגומים3,4,5,6,7. הסרת חלבונים פגומים בתיווך מערכת ubiquitin-proteasome (UPS)8 או על ידי מכונות autophagy9 בשיתוף עםמלווים 10,11,12. הומיוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) הוא, אם כן, מתוחזק על ידי רשתות בקרת איכות המורכבות ממכונות קיפול והשפלה3,13. עם זאת, הבנת האינטראקציות בין המרכיבים השונים של רשת הפרוטאוסטזיס ב- vivo היא אתגר גדול. בעוד שמסכי אינטראקציה בין חלבון חלבון תורמים מידע חשוב על אינטראקציות פיזיות ומתחמי ליווי14,15, הבנת הארגון ומנגנוני פיצוי בתוך רשתות ליווי ספציפיות לרקמות ב- vivo חסרה.

אינטראקציות גנטיות משמשות לעתים קרובות ככלי רב עוצמה לבחינת קשר בין זוגות גנים המעורבים במסלולים ביולוגיים נפוצים או מפצים16,17,18. יחסים כאלה יכולים להימדד על ידי שילוב זוגות של מוטציות וכימות ההשפעה של מוטציה בגן אחד על החומרה הפנוטיפית הנגרמת על ידי מוטציה בגן השני16. בעוד שרוב השילובים כאלה אינם מראים כל השפעה במונחים של פנוטיפ, כמה אינטראקציות גנטיות יכול גם להחמיר או להקל על חומרת הפנוטיפ הנמדד. מוטציות מחמירות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה חמור יותר מהפנוטיפ הצפוי שנראה בשילוב מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים מתפקדים במסלולים מקבילים, יחד המשפיעים על תפקוד נתון. לעומת זאת, מוטציות מקלות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה הוא פחות חמור מהפנוטיפ שנראה עם מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים פועלים יחד כמורכב או משתתפים באותו מסלול16,18. בהתאם לכך, פנוטיפים מגוונים שניתן לכמת, כולל פנוטיפים רחבים, כגון קטלניות, שיעורי צמיחה וגודל הגוזל, כמו גם פנוטיפים ספציפיים, כגון כתבים תמלול, שימשו לזיהוי אינטראקציות גנטיות. לדוגמה, Jonikas ואח ' הסתמכו על כתב מתח ER לבחון אינטראקציות של Saccharomyces cerevisiae ER פתחה רשת פרוטאוסטזיס תגובת חלבון באמצעות ניתוחי מחיקת גנים זוגגנים 19.

מסכי אינטראקציה גנטית כרוכים בחצייה שיטתית של מוטציות מחיקה זוגיות כדי ליצור קבוצה מקיפה של מוטציות כפולות20. עם זאת, במודלים של בעלי חיים, ובמיוחד ב- C. elegans, גישה רחבת היקף זו אינה ריאלית. במקום זאת, זנים מוטנטיים יכולים להיבדק לדפוסי האינטראקציה הגנטית שלהם על ידי זיהוי גנים מווסת באמצעות הפרעות RNA (RNAi)21. ג. אלגנס היא מערכת רבת עוצמה למסכים המבוססת על RNAi22,23. ב C. elegans, משלוח RNA כפול גדילים (dsRNA) מושגת על ידי האכלה חיידקית, מה שמוביל להתפשטות של מולקולות dsRNA לרקמות רבות. באופן זה, מולקולות dsRNA הציג להשפיע על החיה באמצעות הליך מהיר ופשוט21. מסך אינטראקציה גנטית באמצעות RNAi יכול, אם כן, לחשוף את ההשפעה של ויסות מטה קבוצה של גנים או רוב C. elegans קידוד גנים באמצעות ספריות RNAi24. במסך כזה, להיטים המשפיעים על ההתנהגות של מוטציה של עניין אבל לא זן סוג פראי הם מכפילים פוטנציאליים של פנוטיפ להיות במעקב25. כאן, אנו מיישמים שילוב של מוטציות והקרנת RNAi כדי למפות באופן שיטתי אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות ב- C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת לוחות מדיה צמיחה נמטודה עבור RNAi

  1. לבקבוק 1 L, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של Bacto-Peptone, 17 גרם אגר ומים מזוקקים עד 1 L ו autoclave.
  2. בקבוק מגניב ל 55 °C (55 °F).
  3. הוסף 25 מ"ל של 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, ו 1 מ"ל של פתרוןכולסטרול (טבלה 1) כדי להפוך את מדיה צמיחה נמטודה (NGM).
  4. הוסף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 0.5 מ"ל של 1 M IPTG(טבלה 1) כדי להפוך פתרון NGM-RNAi.
    הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli הנפוצים מכילים פולימראז DNA T7 שאינו ניתן לתמיכת IPTG המשמש להבעת פלסמידים קידוד dsRNA. פלסמידים אלה מקודדים גם עמידות באמפיצ'ילין.
  5. מערבבים את התמיסה החמה על ידי מערבולת הבקבוק.
  6. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, יוצקים את תמיסת ה- NGM לצלחות או באמצעות משאבה פריסלטית, מחלקים את הפתרון לצלחות. השתמש 6-טוב, 12-טוב, 40 מ"מ או 60 מ"מ לוחות עבור מסך זה. אגר צריך למלא בערך 2/3 מעומק הצלחת.
  7. תן את הצלחות להתייבש לילה על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. לוחות NGM עבור RNAi ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.

2. גידול חיידקי RNAi וזריעת הצלחות

  1. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 2.5 מ"ל של טטרציקלין (5 מ"ג / מ"ל) (טבלה 1) לפתרון 1 ליטר אוטומטי מראש של פתרון LB ומערבב.
    הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli נפוצים עמידים לטטרציקלין.
  2. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 600 μL של פתרון LB לכל באר 2 מ"ל עמוק 96-צלחות סטריליות. עדיף להשתמש בצנרת רב ערוצית לחלוקת המדיה.
  3. באמצעות הליכים סטריליים, לחסן בארות עם חיידקי HT115(DE3) E. coli השתנה עם פלסמיד קידוד dsRNA מיקוד גן של עניין או plasmid ריק, כמו שליטה. מכסים את הצלחות ודגר ב 37 °C (50 °F) לילה. ספריות המורכבות משיבוטים חיידקיים המבטאים dsRNA, המקביל לכ -94% מהגנים החזויים C. elegans נבנו בעבר22,23 והם זמינים מסחרית. ספריית המלווה ששימשה כאן נבנתה על ידי מעבדת ד"ר ריצ'רד מורימוטו26.
  4. באמצעות הליכים סטריליים, זרע 75, 150 או 250 μL של חיידקים על 12-well, 40 מ"מ ו 6-טוב או 60 מ"מ NGM RNAi לוחות, בהתאמה. סמן בבירור את שם גן המטרה על הלוח. חיידקים צריכים לכסות 30-50% משטח אגר ולא צריך לגעת בשולי הצלחת.
  5. אפשר צלחות להתייבש לפחות 2 ימים על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות.
    הערה: ניתן לדגור צלחות ב 37 °C (50 °F) לילה. ודאו שהבארות הפנימיות יבשות לפני השימוש או אחסון הצלחות. לכל המטרות לטווח ארוך (כלומר, ייבוש או אחסון) שמור את הצלחות בחושך. צלחות מיובשות, זרעים ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.

3. סנכרון לא מלחיץ של עוברים

  1. השתמש בבחירת תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת ללוח גז טבעי נוזלי שזה עתה נזרע.
  2. לטפח בעלי חיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בעלי חיים צריכים להגיע ליום הראשון של הטלת ביצים.
    הערה: תולעים מעובדות בדרך כלל ב 20 °C (50 °F). עם זאת, זנים מוטנטיים מלווים שונים עשויים לדרוש טמפרטורות טיפוח ספציפיות. לדוגמה, זנים רגישים לטמפרטורה רבים מעובדים ב 15 °C (5 °F) אבל עבר 25 °C (5 °F) כדי לחשוף פנוטיפ שלהם.
  3. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9(טבלה 1)לאט והרחק מהמדשאה החיידקית. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.
    הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.
  4. חזור על שלב 3.3 שלוש פעמים או עד שכל החיות נשטפות מהצלחת.
  5. בעזרת קצה פלסטיק סטנדרטי, חותכים ריבוע אגר מהצלחת השטופה שבה מרוכזות הביצים ומניחים את חתיכת אגר על צלחת NGM חדשה.
    הערה: ~ 200 ביצים נדרשים לייצר מספיק בעלי חיים מטילי ביצים; יותר מדי בעלי חיים צורכים את החיידקים מהר מדי. רמות מזון נמוכות יכולות להשפיע על פרוטאוסטזיס27.
  6. לטפח את בעלי החיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בשלב זה, הצלחות צריכות להיות מכוסות בביצים מסונכרנות.
    הערה: ניתן להעביר בעלי חיים לצלחת חדשה למשך זמן קצר לסנכרון מחמיר יותר. עם זאת, חשוב להשתמש רק במבוגרים בשלבים המוקדמים של הטלת ביצים כמו בעלי חיים יכולים לשמור ביצים ברחם שלהם המשפיעים על סנכרון.
  7. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 לאט הרחק הדשא החיידקי.
  8. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.
  9. חזור על שלב 3.7 שלוש פעמים או עד שכל בעלי החיים נשטפים מהצלחת.
  10. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 והשתמש מגרד תא כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.
  11. לאסוף את מאגר M9 המכיל את הביצים מהצלחות.
  12. צנטריפוגה חוצץ M9 המכיל את הביצים ב 3,000 x גרם במשך 2 דקות.
  13. הסר את supernatant ולהוסיף מאגר M9 כדי להגיע לאמצעי אחסון של 1 מ"ל.
  14. resuspend הביצים כדי לשבש כל גושים של ביצים וחיידקים.
  15. חזור על הליך הכביסה המתואר בשלבים 3.11-3.13 חמש פעמים. גלולה ביצה צריך להיראות לבן. אם הוא עדיין צהוב/חום, חזור על הכביסה עד להשגת גלולה לבנה.
    הערה: חיידקים שנותרו על הביצים יכולים לזהם את החיידקים המביעים dsRNA.
  16. הסר את רוב supernatant, משאיר על 200 μL. ביצים מסונכרנות ניתן להשתמש עבור מסכי RNAi.

4. מבדים פנוטיפיים נפוצים

  1. טיפוח בעלי חיים במהלך ניסויים
    1. מניחים טיפה של ~ 30 ביצים קרוב למדשאה החיידקית בכל צלחת זרעים RNAi. לעיון, יש גם להניח ~30 ביצים על צלחות זרעים עם חיידקים ריקים המכילים וקטור (L4440).
    2. לטפח בעלי חיים מסונכרנים לגיל על לוחות זרעי RNAi NGM. משך הניסוי יהיה תלוי בשלב שבו יש לעקוב אחר בעלי החיים וטמפרטורת הטיפוח. התאם את טמפרטורת הטיפוח בעת שימוש בחיות מוטנטיות רגישות לטמפרטורה. התאם את משך הטיפוח בעת שימוש בבעלי חיים מוטנטיים המתעכבים התפתחותית.
      הערה: בעוד התזמון יכול להשתנות, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, הטלת ביצים (וצריכת המזון המהירה הנובעת מכך), כמו גם קריסת פרוטאוסטזיס תלוית גיל28, עלולה להשפיע על התוצאות. לכן מומלץ להבקיע בעלי חיים לפני תחילת הטלת הביצים (יום 1 לבגרות). חיות מסוג בר להגיע לשלב זה לאחר 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).
    3. מספר החזרות בהן נעשה שימוש יהיה תלוי בגודל ערכת הגנים שנבדקה. בספריית המלווה (97 גנים), ניסויים חוזרים לפחות ארבע פעמים. גודל האוכלוסייה תלוי באיזו נעשה שימוש. בהתקפות ההתנהגותיות שנדונו כאן, ציון >15 בעלי חיים לכל מצב ניסיוני בכל חזרה. נתונים ניתוחים סטטיסטיים גם תלויים מאוד בסוג של מבדק בשימוש. נתונים בבדקים שנדונו כאן יכולים להיות מוצגים כאמצעי ± SEM.
    4. השווה את בעלי החיים RNAi- וריק בקרה וקטורית התייחסו לאוכלוסיות עצמאיות. ניתן לחשב ערכי P באמצעות ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני, בהתאם לשינויים שנבדקו, כלומר מחמירים או מקלים לבד או שניהם. בעת בחינת טיפול RNAi יחיד לעומת בקרה, ערכי P ניתן לחשב באמצעות חד כיווני או דו כיווני מאן-ויטני דירוג סכום הבדיקה. מלבד מובהקות סטטיסטית, שקול סף להיטים בהתבסס על מידת ההשפעה על הפנוטיפ.
  2. מעצר/עיכוב התפתחותי
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי חיים גדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטור להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. נטר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקרוסקופ וספור את מספר הזחלים והמבוגרים כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים בהתפתחות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטורים. hsp-1 או hsp-90 RNAi טיפול תוצאות מעצר התפתחותי של חיות סוג בר והוא יכול לשמש שליטה חיובית.
    3. כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לאורך זמן, חזור על שלב 4.2.2.
      הערה: אם יש מבוגרים מטילי ביצים על הצלחת, להעביר את בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לצלחת חדשה NGM-RNAi שכותרתו לאותו גן יעד כדי למנוע בלבול עם צאצאים.
  3. סטריליות או הטלת ביצים פגמים
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להתחיל להטיל ביצים.
    2. לעקוב אחר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקוסקופ ולהשיג את אחוז בעלי החיים ללא ביצים גלויות ברחם שלהם. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
    3. לחלופין, לפקח על בעלי חיים באמצעות סטריאוטיקרוסקופ ולהבקיע את אחוז בעלי החיים עם רחם מלא ביצים, המוגדר EGg מטיל פגום (Egl-d) פנוטיפ29.
  4. קטלניות עוברית
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי החיים מתחילים להטיל ביצים.
    2. מעבירים ~ 100 ביצים לצלחת ריקה. מורחים את הביצים בשורות כדי לפשט את הספירה.
    3. ציון האחוז של ביצים unhatched על הצלחת לאחר 24-48 שעות. לעיון, השווה לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
  5. שיתוק אסאי
    1. עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים שליטה וקטורית להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. צייר קו על הגב של צלחת אגר NGM רגילה באמצעות סמן דק.
    3. מניחים 5-10 בעלי חיים על הקו המסומן.
    4. הגדר שעון זמן והמתן 10 דקות.
    5. ציון אחוז החיות שנותרו על הקו כמו תולעים משותקות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. חיות מסוג בר שטופלו עם unc-45 RNAi להראות פנוטיפ שיתוק חמור והוא יכול לשמש שליטה חיובית.
      הערה: מעש זה מדגיש בעלי חיים המציגים שיתוק בינוני עד חמור. בעלי חיים כאלה בדרך כלל שוכבים ישר על הצלחת, במקום להציג את הצורה המעוקלת הנפוצה. יתר על כן, תיקון נקי מחיידקים נראה סביב ראשיהם של תולעים משותקות.
  6. חבטות אסאי
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. צינור 100 μL של חוצץ M9 בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים לתוך צלחת 96 באר.
    3. מניחים ~ 15 תולעים, אחת לבאר, לתוך בארות המכילות מאגר M9.
    4. תן לבעלי החיים להסתגל במשך 5 דקות.
    5. בדקו כל חיה מתחת לסטריאוטיקרוסקופ, התחל שעון זמן בספירה לאחור של 15 s וספור את מספר כיפופי הגוף שכל חיה מבצעת באותה תוחלת זמן. ניתן לנרמל את הערכים שנספרו לכיפופי גוף לדקה. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
      הערה: זה תנועתיות assay הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות הבדלים קלים מאוד בין טיפולים. עם זאת, תנועתיות בנוזל ותנועתיות על אגר יכול להיות שונה.

5. אימות של נוקאאוט חלבון

  1. הניחו 250-300 ביצים מסונכרנות על צלחת NGM-RNAi 60 מ"מ עם החיידקים הרלוונטיים המביעים dsRNA או ריקים המכילים וקטור (L4440).
    הערה: RNAi נוקאאוט עלול לגרום הצטברות חריגה של עוברים, בהיעדר עוברים או במעצר התפתחותי שעלול להשפיע על ביטוי הגנים. יש לקחת זאת בחשבון בעת קביעת גיל בעלי החיים שיש לבחון.
  2. עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים במשך 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (55 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).
  3. בחר והעבר בסך הכל 200 בעלי חיים צעירים למבוגרים לתוך מכסה של צינור 1.5 מ"ל מלא עם 200 μL של PBS-T.
    הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.
  4. סגרו את המכסה בזהירות וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.
  5. הוסף 800 μL של PBS-T(טבלה 1)וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.
  6. הסר בזהירות את 900 μL העליון.
  7. חזור על שלבים 5.4-5.6 שלוש פעמים.
  8. הסר 900 μL, משאיר 100 μL של פתרון המכיל את 200 תולעים.
  9. הוסף 25 μL של 5x מאגר מדגם(טבלה 1).
  10. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 92°C תוך רועד ב 1000 סל"ד. לאחר מכן ניתן להקפיא את הדגימות ושמר על -20 מעלות צלזיוס.
  11. טען 20 μL של כל דגימה ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE.
  12. בצע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.
  13. קבע את עוצמת הרצועות באמצעות תוכנה צפיפות, כגון מודול ג'ל ImageJ זמין באופן חופשי. נרמל את כל הערכים לאלה שנמדדו בדגימות הבקרה.
    הערה: המטרה של RNAi נוקאאוט במסכים שלנו היא להוריד את רמות החלבון של מלווה מסוים / מלווה שותף. לכן, הדרך הטובה ביותר להעריך את היעילות של RNAi נוקאאוט היא על ידי ניתוח כתם מערבי. זה דורש נוגדנים ספציפיים. לחלופין, ניתן להשתמש ב- qPCR כדי לכמת את רמות ה- mRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה ב-UNC-45 כדי לסנן להחמיר או להקל על אינטראקציות בתנאים מתירניים או מגבילים, בהתאמה
הרכבה ותחזוקת שרירים מציעים מערכת יעילה לחקר אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. היחידה התפקודית של שרירים מתכווצים, הסרקומר, מציגה סידור דמוי גבישי של חלבונים מבניים ורגולטוריים. היציבות של מיוסין חלבון מוטורי ושילובו לתוך חוטים עבים של sarcomeres שרירים מתכווצים תלוי בשיתוף פעולה של מלווים ורכיבי UPS30. דוגמה של מלווה אחד כזה הוא מלווה מיוסין שמור ומיוחד UNC-45 המתבטא בעיקר שריר דופן הגוף31,32,33,34,35. מוטציות ב UNC-45 הוכחו לגרום אי ארגון מיוסין ופגמים תנועתיות חמורים ב C. אלגנס31,36. מודולי טנדם UNC-45 מתאספים לתוך פלטפורמת עגינה מרובת אתרים37 האוכפת שיתוף פעולה בין UNC-45, HSP-90 ו- HSP-1 וסביר להניח מלווים אחרים ומלווים שותפים בהרכבה חוט מיוסין25,36,37,38. כדי לאשר אינטראקציות UNC-45 ידועות ולזהות אינטראקציות גנטיות חדשניות בפרוטוסטזיס שרירים, הקמנו אסטרטגיה באמצעות מוטציות טמפרטורה C. elegans רגישות ללא 45 כרקע גנטי רגיש עבור אינטראקציה מלווה ספציפי לרקמות הקרנה19,25.

תחליפי חומצות אמינו יחיד C. elegans UNC-45 (L822F ו- E781K, המקבילים לאללים e286 ו- m94, בהתאמה; UNC-45(ts)) אחראים פגמים תנועתיות תלויי טמפרטורה ופנוטיפים אי-ארגון מיוסין כאשר בעלי חיים מושפעים גדלים בתנאים מגבילים (>22 °C (22 °F). לעומת זאת, מוטציות אלה ללא 45 (ts) אינן מראות פגמים בתנועה או בארגון המיוסין בטמפרטורה המתירנית (15 °F)31. בגישה המוצעת, בעלי חיים שאינם מסונכרנים לגיל 45(e286) בשלב הזחל הראשון (L1) התרוקנו ממלווים מולקולריים שונים על ידי RNAi (97 גנים) ולאחר מכן נטרו פגמים תנועתיות בתנאים מתירניים (15 °C)(איור 1). אישרנו את האינטראקציה הידועה של חלבוני UNC-45 ו- HSP-90 במסך האינטראקציות הגנטיות שלנו וזיהינו שלושה מלווים שותפים hsp-90, sti-1 , ahsa-1, ו- daf-41, כגורם ספציפי לפגם בתנועה סינתטית בבעלי חיים מוטנטיים מסוג UNC-45(ts) אך לא בחיות מסוג בר25. המשכנו לבחון אם sti-1-, ahsa-1- או daf-41 -פנוטיפים סינתטיים הקשורים נגרמו על ידי אי ארגון מיוסין על ידי ניטור הסידור התת-תאי של שרשרת כבדה myosin A (MYO-3), באמצעות טכניקות immuno מוכתם הוקמה39. בעוד טיפול בבעלי חיים מסוג בר עם sti-1, ahsa-1 או daf-41 RNAi לא השפיע על ארגון myofilament, דלדול של גנים אלה בבעלי חיים מוטנטיים unc-45(e286) הביא להפרעה מוחלטת של מבנים סרקומריים ו MYO-3 הקצאה שגויה, אפילו בתנאים מתירניים (15 °C). אפקט זה היה דומה למה שנראה עם מוטציות בודדות un-45(e286) שגדלו בטמפרטורה המגבילה (25 °F)25°F). תוצאות אלה אושרו באמצעות עוד unc-45(ts)-allele, כלומר un-45(m94) בעלי חיים מוטנטיים25.

כדי לזהות מלווים המערערים את UNC-45, הקרננו לאחר מכן עבור מלווים ששיפרו את תנועתיותם של בעלי חיים ללא 45 (286) ב 25 °C (70 °F), תוך הסתמכות על נוקאאוט גנטי על ידי RNAi. בעוד חיות מוטנטיות ללא 45 (e286) הראו פגמים חמורים בתנועה ב 25 °C (70 °F), תנועתיות של בעלי חיים שטופלו עם RNAi נגד גנים קידוד ארבעה מתוך 97 המלווים שנבדקו השתפר באופן משמעותי. גם כאן, התוצאות אושרו באמצעות חיות מוטנטיות ללא 45(m94). לכן, השימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה מאפשר לקבוע מסכים מחמירים ומקלים, בהתאם לטמפרטורה שבה מתבצע המסך.

שימוש בביטוי יתר ספציפי לרקמות של מלווה כדי לסנן לאינטראקציות מחמירות
לאחר מכן השתמשנו בביטוי יתר ספציפי לרקמות של מלווה יחיד כהתמהמה קלה של רשת המלווה השרירים למטרות סינון. באופן ספציפי, השתמשנו בבעלי חיים מבטאים יתר על המידה סוג בר dnj-24, קידוד ההומולוג C. elegans של חלבון Hsp40 DNAJB6 בשריר דופן הגוף C. elegans (DNJ-24M). כאמור, בעלי חיים L1 DNJ-24M טופלו עם RNAi עבור מלווים שונים ומנוטרים עבור פגמים תנועתיות (20 °C(איור 1). בעוד בעלי חיים DNJ-24M לא הראו פגמים תנועתיים בולטים, שלושה גנים (מתוך 48 גנים קידוד מלווה נבדקו; 6%), כלומר hsp-1, rme-8, ו dnj-8, השפיעו במיוחד על תנועתיות של בעלי חיים DNJ-24M מבטאים אבל לא חיות סוג בר. ראוי לציין כי בדיקת הספציפיות של הלהיטים באמצעות בעלי חיים המביעים יתר על המידה מלווה אחר, כלומר HSP-90, בשרירים (HSP90M), לא הראתה שום השפעה על תנועתיות HSP90M על hsp-1, rme-8, או dnj-8 טיפול RNAi40. יחד, פלטפורמת ההקרנה, תוך שימוש בהתעסקות קלה ברשת המלווה, כגון ביטוי של חלבונים מוטנטיים מט-נתונים או ביטוי יתר ספציפי לרקמות, הביאה לשיעור פגיעה ספציפי ביותר (בדרך כלל ~ 5%).

שימוש ב- RNAi ספציפי לרקמות כדי לסנן אינטראקציות גנטיות ספציפיות לרקמות
זנים רגישים לרקמות RNAi מאפשרים פירוק ספציפי לרקמות של גנים תוך שימוש בהאכלה חיידקית לאספקת dsRNA. זנים אלה הם מוטציה עבור חלבון RDE-1 argonaute, מרכיב מרכזי במסלול RNAi הנדרש להשתקתגנים יעילה 21. עם זאת, הבעת סוג בר RDE-1 תחת שליטתו של מקדם ספציפי לרקמות הובילה נוק-אאוט יעיל של גנים ספציפיים לרקמות41,42. כלי זה מאפשר אפוא מסכי אינטראקציה גנטית ללא שימוש במלווים ספציפיים לרקמות, כגון UNC-45 או DNAJ-24M. לדוגמה, נוק-אאוט hsp-6 (תמותה) בבעלי חיים מסוג בר במהלך ההתפתחות הביא למעצר התפתחותי חזק (96±1% מבעלי החיים שטופלו ב- RNAi). יחד עם זאת, hsp-6 נוקאאוט בזן המבטא סוג בר RDE-1 בשריר לא גרם למעצר התפתחותי, בעוד הבעת סוג בר RDE-1 בתאי מעיים הביאה פנוטיפ מעצר התפתחותי חזק (90±3%; איור 2). לכן, הפונקציה HSP-6 בתאי מעיים נדרשת להתפתחות נורמלית. מוטציה ב- hsp-6(mg585) הגורמת לעיכוב גדילה מתון יכולה, אם כן, לשמש לסינון להחמרה או להקלה על אינטראקציות המלווה על ידי חציית הגן שעבר מוטציה לזן RNAi ספציפי למעיים והקרנה של ספריית המלווה RNAi.

ניטור שינויים תלויי גיל בסביבה המתקפלת באמצעות אינטראקציות גנטיות
בעלי חיים מראים ירידה תלוית גיל תנועתיות הקשורה לאי סדר סרקומרי43,44,45. שינויים ביכולת קיפול החלבון חופפים לוויסות והרכב משתנים של מכונות הפרוטאוסטזיס התאיות28, כולל רמות משתנות של UNC-45, CHN-1 ו- UFD-2, חלבונים של מכונות בקרת איכות השריר46. בהסכם, קיפול מיוסין והשפלה מושפעים משינויים ביכולת הפרוטאוסטטיקה במעבר לבגרות47. לכן, שאלנו אם שינויים כאלה יכולים להשפיע על אינטראקציות המלווה. לדוגמה, עקבנו אחר ההשפעה של sti-1, ahsa-1 ו- daf-41 נוקאאוט על תנועתיות לאורך זמן. מצאנו כי למרות sti-1-, ahsa-1- ו- daf-41-RNAi טיפל בבעלי חיים הראו תנועתיות מופחתת במהלך התפתחות הזחל, תנועתיות ירדה מאוד בתולעים בוגרים unc-45(ts). יתר על כן, ארגון MYO-3 בבעלי חיים מוטנטיים מסוג UNC-45 (ts) שטופלו ב- sti-1, ahsa-1 או daf-41 RNAi היה דומה לזה של תולעי בר בשלב הזחל הרביעי (L4), אם כי המוטנטים הציגו סרקומרים משובשים לאחר שבעלי החיים הגיעו לבגרות(איור 3). לעומת זאת, שני בעלי החיים המוטנטיים שטופלו בבקרה וקטורית ריקה ובעלי חיים מסוג בר נותרו ללא השפעה(איור 3). לכן, דינמיקה פרוטאוסטזיס כפונקציה של גיל או תנאים סביבתיים27,45,46,48,49 יכול להשפיע באופן קריטי על אינטראקציות המלווה.

Figure 1
איור 1: התקנה של מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi באמצעות C. elegans הנושאים מוטציה בגן המקודד מלווה של עניין. (A)ייצוג סכמטי של ההגדרה הבסיסית של מסכי אינטראקציה מלווים ממוקדים. (B)אימות חבטה דורש אישור של האינטראקציה הגנטית באמצעות מוטציה מלווה אחרת, כמו גם אימות ציון של RNAi נוקאאוט. (C-D) קריאות פשוטות, כגון פגמים תנועתיות, ניתן לכמת כדי לקבוע אינטראקציות מחמירות או להקלה, באמצעות שיתוק או חבטות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתן להשתמש ב- RNAi ספציפי לרקמות של המלווה המיטוכונדריאלי hsp-6 כדי לבחון אינטראקציות גנטיות ברקמה אחת. זני RNAi ספציפיים למעי ולשרירים מסוג בר טופלו ב- hsp-6 RNAi ו- (A)עיכוב התפתחותי הבקיע או (B)תמונות צולמו ביום הראשון לבגרות. הנתונים הם ממוצעים ± SEM, N =6. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השפעות תלויות גיל של RNAi. (א)תנועתיות עם הגיל. סוג פראי או un-45(e286) עוברים הונחו על sti-1, ahsa-1 או daf-41 RNAi זרעים צלחות ב 15 °C (70 °F) וציון עבור תנועתיות באמצעות מטען חבטות בכל שלב התפתחותי, L1-L4, צעיר ויום 1 של בגרות. הנתונים הם ממוצעים ± SEM, N = 15. (B)תמונות קונפוקליות של שריר דופן הגוף. בעלי חיים טופלו כמו ב- A וקידונו ב- L4, צעירים ויום 1 של שלבי הבגרות ומוכתמים בנגוגדנים נגד MYO-3. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה הוראות הכנה אחסון
1 מ' קcl2 (1 ליטר) הוסף 147.01 גרם CaCl2·2H2O חנות ב- RT
הוספת dH2O ל- 1 ליטר
אותק אוטומטי או מסנן (0.22 מיקרומטר)
1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 ליטר) הוסף 136.09 גרם KH2PO4 חנות ב- RT
הוסף 800 מ"ל dH2O
מערבבים בעזרת מערבב מגנטי עד להמסה
Titrate pH באמצעות KOH
הוספת dH2O ל- 1 ליטר
אותק אוטומטי או מסנן (0.22 מיקרומטר)
1 מ"ג4 (1 ליטר) הוסף 248.58 גרם MgSO4·7H2O חנות ב- RT
הוספת dH2O ל- 1 ליטר
אותק אוטומטי או מסנן (0.22 מיקרומטר)
פתרון כולסטרול (50 מ"ל) הוסף 250 מ"ג כולסטרול לצינור פלקון 50 מ"ל חנות ב--20 °C (70 °F)
להתמוסס לחלוטין ב 40 מ"ל אתנול
הוסף אתנול ל 50 מ"ל
1 מ' IPTG (50 מ"ל) הוסף 11.9 גרם IPTG (איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside) לצינור פלקון 50 מ"ל יש לאחסן בחושך ב-20 °C (70 °F)
מתמוסס לחלוטין ב 40 מ"ל dH2O
הוסף dH2O עד 50 מ"ל
מסנן (0.22 מיקרומטר), צינורות aliquot 1mL
מלאי אמפיצלין (50 מ"ל) הוסף 5 גר' אמפצילין לצינור פלקון 50 מ"ל חנות ב--20 °C (70 °F)
מתמוסס לחלוטין ב 40 מ"ל dH2O
הוסף dH2O עד 50 מ"ל
מסנן (0.22 מיקרומטר), להפיץ 1 mL aliquot לתוך צינורות אפנדורף
מניית טטרציקלין (50 מ"ל) הוסף 250 מ"ג טטרציקלין לצינור פלקון 50 מ"ל חנות ב--20 °C (70 °F)
להתמוסס לחלוטין ב 40 מ"ל אתנול
הוסף אתנול ל 50 מ"ל
עליקוט 1 mL צינורות
חוצץ M9 (1 ליטר) הוסף 5.8 גרם Na2HPO4·7H2O חנות ב- RT
הוסף 3 גר' KH2PO4
הוסף 5 גר' NaCl
הוסף 0.25 גרם MgSO4·7H2O
הוספת dH2O ל- 1 ליטר
מסנן (0.22 מיקרומטר)
1X PBS-T (pH 7.4) (1 ליטר) הוסף 8 גרם של NaCl חנות ב- RT
הוסיפו 200 מ"ג KCl
הוסף 1.44 גרם Na2HPO4·7H2o
יש להוסיף 240 מ"ג KH2PO4
להתמוסס לחלוטין ב 800 מ"ל dH2O
Titrate pH באמצעות KOH tp pH 7.4
הוסף 500 μL טווין-20
הוספת dH2O ל- 1 ליטר
מאגר דוגמה 5x הוסף 6.8 מ"ל dH2O חנות ב--20 °C (70 °F)
הוסף 2 מ"ל 0.5M טריס pH 6.8
הוסף גליצריל 3.2 מ"ל
הוסף 1.6 מ"ל 20% SDS
הוסף 0.8 מ"ל ß-mercaptoethanol
1% ברומופנול כחול

טבלה 1: מתכוני פתרון

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תמונה משולבת של רשת הפרוטאוסטזיס המשקפת כיצד היא מאורגנת ומתפקדת בתאים ורקמות מטזואניים שונים נותרה חסרה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, נדרש מידע ספציפי על האינטראקציות של רכיבים שונים של רשת זו, כגון מלווים מולקולריים, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כאן, הראינו כיצד השימוש בהתעלות ספציפית לרקמות אפשר לנו לבחון את רשת המלווה ברקמה נתונה. כדי לחקור אינטראקציות גנטיות ספציפיות לרקמות המלווה, שלוש גישות שונות נחשבו. בגישה הראשונה, UNC-45, מלווה המתבטא מאוד בתאי שריר, שימש לסנן עבור אינטראקציות מלווה באמצעות האכלה-RNAi25. בעוד שהשימוש במלווה מיוחד מאפשר הבחנה בפרטים, הוא יכול לדווח רק על אותה רשת משנה ממוקדת מאוד שאליה היא תורמת. שים לב כי רוב נוירוני C. elegans עמידים בפני האכלה מבוסס RNAi משלוח50 ולכן באמצעות גישה זו כדי לזהות אינטראקציות גנטיות בתאים עצביים דורש חציית המלווה המוטנטי נבדק עם זן משופר RNAi51. בגישה שנייה, מקדם ספציפי לרקמות שימש כדי לנהוג ביטוי יתר של מלווה בשריר ובכך משפיע באופן ספציפי על הסביבה מתקפלת שריר40. עם זאת, הבעת יתר של מלווה אחד יכולה להיות מועילה בדרך כלל לסביבה המתקפלת ובכך להסוות הפרעה הנגרמת על ידי שני המלווים יחד. הגישה השלישית הסתמכה על נוקאאוט ספציפי לרקמות RNAi כדי לבחון אינטראקציות מלווה ברקמה נתונה41. יתרון אחד של גישה זו הוא שהיא מאפשרת מיקוד תאים עצביים עמידים למשלוח RNAi באמצעות האכלה42. ובכל זאת, גישה זו דורשת שימוש במוטנט מתון (אם כי לא מיוחד), כמו גם כי מוטציה זו להיות חצה לתוך מוטציה null rde-1 נושא גן הצלה rde-1 ספציפי לרקמות. חשוב לציין, גישות אלה ניתן לשלב כדי לווסת את תפקוד המלווה ברקמה אחת או אפילו תא אחד.

מכונות בקרת האיכות יכולות להשפיע על התפקוד של מוצרי גנים רבים על ידי פרטוטוסטזיס. זהו אתגר גדול בעת שימוש באינטראקציות גנטיות כדי לחקור את רשת בקרת האיכות18. לדוגמה, ביטוי כרוני של חלבונים מועדים לצבירה או התמוטטות פרוטאוסטזיס בהזדקנות הביא להחמרה פנוטיפית של חלבונים גרורתיים רבים שאינם קשורים ב- C. elegans ושמרים45,52,53. יתר על כן, אנדוציטוזיס בתיווך קלאתרין בתאי יונקים התעכב על הפרדה תפקודית של Hsc70 אגרגטים חלבון. עם זאת, הוכח כי אנדוציטוזיס ניתן להציל על ידי ביטוי יתר Hsc70, בעוד צבירה לא יכול54,55. כמו כן, מסך גנטי בדרוסופילים שנועד לחשוף את הרגולטורים של תגובת הלם החום זיהה מוטציה שגויה באקטין שריר הטיסה שהפעילה באופן מרכיב את תגובת הלם החום56. יחד, perturbation של רשת proteostasis יכול לחשוף חלבונים metastable או לגרום ללחץ שיכול להשפיע על הספציפיות של התוצאה. עם זאת, ניתוח אינטראקציות גנטיות יכול להניב תובנה ספציפית ופונקציונלית מאוד. לדוגמה, ניתוחים אפסטטיים של גנים שמרים הנדרשים לקיפול ברטיקולום אנדופלסמי זיהו אינטראקציות גנטיות ספציפיות בין מלווים מולקולריים שאומתו לאחר מכן19. כמו כן, מסך מחמיר למלווים המשפרים את הרעילות של שני מודלים מועדים לצבירה (כפי שנמדד על ידי תנועתיות) זיהה תת קבוצה ספציפית של 18 מלווים, אורתולוגיות אשר השפיעו על צבירת הנטינגטון בתאים אנושיים26. כאן הראינו כי חששות שונים של רשת הפרוטאוסטזיס יכולים לחשוף אינטראקציות ספציפיות ופונקציונליות של מלווה.

היתרון העיקרי של שימוש במסכי אינטראקציה גנטית מבוססי האכלה RNAi הוא הפשטות היחסית של השיטה. אפילו שימוש בתפוקה התנהגותית כללית, כגון תנועתיות, יכול לחשוף אינטראקציות גנטיות חדשניות(איור 3). עם זאת, שונות והשפעות חלקיות של נוקאאוט ביטוי יכול להגביל את החוסן ואת הספציפיות של התוצאות57. יתר על כן, אינטראקציות גנטיות אינן מעידות על אינטראקציות פיזיות והקשר בין שני גנים יכול להיות עקיף. לחקור את אופי האינטראקציות ולהשליך אינטראקציות לא ספציפיות יכול להיות זמן רב57,58,59. זוהי דאגה שיש לטפל בה בהגדרת המסך ובאימות. לדוגמה, שימוש באללים ריקים בהקרנה גנטית מאפשר לקבוע אם גנים אלה פועלים באותו מסלול או מסלולים נפרדים בתהליך ביולוגי נתון. עם זאת, באמצעות אובדן חלקי של תפקוד הגנים, אללים היפומורפיים, כגון אללים רגישים לטמפרטורה, או רגולציה מטה תלויה RNAi של ביטוי, תוצאות פעילויות שיורית שיכולות להניב פנוטיפים מחמירים או מקלים, ללא קשר אם הגנים פועלים באותו מסלולים או במסלולים מקבילים59. לכן, אופיה של כל אינטראקציה דורש ניתוח נוסף. עם זאת, באמצעות אלרים היפומורפיים ו RNAi יכול לזהות מגוון רחב של אינטראקציה, כולל גנים באותו קומפלקס חלבון או מסלול או במסלוליתיר 59. בעוד היקף גדול יותר זה של אינטראקציות אפשריות יכול להניב יותר להיטים במסך גנטי, זה יכול גם להוביל אינטראקציות לא ספציפיות, כגון, למשל, חשיפה לא ספציפית של אללים רגישים לטמפרטורה בקריסת פרוטאוסטזיס45,53.

ניתן לבחון אימות כניסות ואינטראקציות לא ספציפיות במספר דרכים. מספר הלהיטים צריך להיות נמוך. לדוגמה, רגולציה מטה של ביטוי מלווה ברקע מוטנטי un-45 הביא אחוז קטן של להיטים (4%), עם רוב גנים המלווים למטה רגולציה לא מראה שום השפעה על תנועתיות. שיעור דומה נצפה כאשר DNJ-24M התבטא יתר על המידה (6%). כפי שצוין לעיל, מסך לאינטראקציות מלווה עם חלבונים מועדים לצבירה זיהה 18 מלווים מתוך 219 מוקרן (8%).

יש להשתמש בכמה אללים מוטנטיים, קווי הבעת יתר או מודלים למחלות. השימוש באללים מוטנטיים שונים בעלי השפעות שונות על תפקוד המלווה, כמו גם זנים שונים עם רקע גנטי שונה, יכול לתמוך הספציפיות של כל להיטי מסך. לחלופין, שימוש במוטציה או בביטוי יתר של מלווה אחר שאינו מוביל לתקלה דומה יכול לשמש כשליטה שלילית. לדוגמה, הן unc-45(e286) והן unc-45(m94) הראו התנהגות מחמירה כאשר sti-1, ahsa-1 או daf-41 היו מוסדר למטה. יתר על כן, אינטראקציה דומה נצפתה כאשר בעלי חיים הנושאים את מוטציית המחיקה ahsa-1 (ok3501) טופלו עם hsp-90 RNAi25.

יש לבחון את זהותם של להיטי המלווה ואת האינטראקציות הידועות שלהם. לדוגמה, מלווים שזוהו במסך מחמיר ללא 45 הם קבוצה ספציפית ביותר של מלווים הנדרשים למחזור ATPase HSP-90, כולל אלה המקדודים מגייס לקוח (STI-1), מלווה שותף לשפץ (AHSA-1) ומלווה משותף להבשלת לקוח (DAF-41). למעשה, קבוצה זו של מלווים משותפים יוצרת מחזור קיפול HSP-90 מלא60. כמו כן, מסך DNJ-24M זיהה HSP-1, השותף המלווה הראשי של Hsp40s40.

יש לבחון גם שינויים באינטראקציות על תוחלת החיים של החיה. לדוגמה, מלווים שזוהו במסך מחמיר unc-45 השפיעו מאוד על תנועתיות וארגון מיוסין בבגרותם, אך הייתה להם השפעה מתונה יותר במהלך הפיתוח. זה יכול להיות בגלל שינויים ברשת proteostasis בבגרות28 או שינויים בדרישות קיפול מיוסין בין קיפול סיבי מיו ותחזוקה.

השתמש בגישות ביוכימיות משלימות כדי לבחון ישירות אינטראקציות בין החלבונים, כמו גם את לוקליזציה שלהם בתא. לדוגמה, HSP-90 מלווים משותפים, STI-1, AHSA-1 ו- DAF-41, הם מקומיים לסרקום שבו הם מתקשרים עם מיוסין25.

C. elegans הוא מודל metazoan מבוסס היטב לניטור בקרת איכות. הוא משמש לעתים קרובות לניטור פרוטאוסטזיס תאי ואורגניזמי באמצעות ערכת כלים משתנה של ביולוגיה של התא, גישות ביוכימיות וגנטיות. כאן, השתמשנו בגישות סינון גנטיות ובכלים זמינים57,58,59, כגון בנק מוטציות, ספריות RNAi זמינות22,23 וזני RNAi ספציפיים לרקמות41,42, כדי לפקח על אינטראקציות מלווה בחיה חיה במהלך ההתפתחות וההזדקנות. השימוש בבדיקות התנהגותיות פשוטות, כגון תנועתיות, מפשט את המסך של זוגות גנים אפשריים רבים כדי לחקור אינטראקציות גנטיות חדשניות. לאחר מכן זה יכול לשמש פלטפורמה לחקור עוד יותר לוקליזציה מלווה ואינטראקציות פיזיות באמצעות כלים ביוכימיים כדי לחקור mechanistically האינטראקציות הפוטנציאליות שלהם ב vivo ו במבחנה. הפרוטוקול המתואר כאן שימש בהצלחה כדי לזהות אינטראקציות מלווה רומן שריר דופן הגוף C. elegans 25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, במימון המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR), על חלק מזני הנמטודה. נוגדנים חד שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה- NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת איווה. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הישראלית למדע (מענק מס' 278/18) ובמענק ממשרד המדע והטכנולוגיה ומשרד החוץ ושיתוף הפעולה הבינלאומי, המנהל הכללי לקידום המדינה, הרפובליקה האיטלקית (מענק מס' 14337). אנו מודים לחברי מעבדת בן צבי על העזרה בהכנת כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

ביולוגיה גיליון 160 אלגנים של Caenorhabditis מלווה אינטראקציות גנטיות פרוטאוסטזיס RNAi מסך רגיש לטמפרטורה
שימוש <em>באלגנים של Caenorhabditis</em> למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter