Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61347
Automatic Translation
1,2, *1,3, *1,3
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science, University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents, University Hospitals of Geneva
* These authors contributed equally

Summary

الجلوتاثيون S-transferases (GSTs) هي إزالة السموم الانزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للعديد من الأدوية العلاجية. يرتبط فرط التعبير عن GSTs مع مقاومة العلاج الكيميائي للسرطان. طريقة واحدة لمواجهة هذا النمط الظاهري هو استخدام مثبطات. يصف هذا البروتوكول طريقة باستخدام مُسايسة قياس الطيفي لفحص مثبطات GST المحتملة.

Abstract

الجلوتاثيون S-transferases (GSTs) هي الإنزيمات الأيضية المسؤولة عن القضاء على المركبات الكهربائية الداخلية أو الخارجية عن طريق اقتران الجلوتاثيون (GSH). بالإضافة إلى ذلك ، GSTs هي المنظمين من kinases البروتين المنشط الميتوجين (MAPKs) المشاركة في مسارات موتوتوفية. ويرتبط فرط التعبير عن GSTs مع انخفاض الفعالية العلاجية بين المرضى الذين يخضعون للعلاج الكيميائي مع وكلاء الألكيليات الكهربائية. قد يكون استخدام مثبطات GST حلاً محتملاً لعكس هذا الاتجاه وزيادة فاعلية العلاج. تحقيق هذا الهدف يتطلب اكتشاف هذه المركبات، مع دقيقة، سريعة، وسهلة تحليل الانزيم. بروتوكول طيفي باستخدام 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) كما الركيزة هو الأسلوب الأكثر استخدام في الأدب. ومع ذلك، فإن التجارب المضادة للانزيم GST التي سبق وصفها لا توفر بروتوكولاً يفصل كل مرحلة من اختبار تثبيط الأمثل، مثل قياس ثابت Michaelis-Menten (Km)لـ CDNB أو الإشارة إلى تركيز الإنزيم المستخدم، المعلمات الحاسمة لتقييم قوة تثبيط مركب تم اختباره. وبالتالي ، مع هذا البروتوكول ، ونحن وصف كل خطوة من المقايسة الأمثل من التحليل الطيفي GST انزيم ، لفحص المكتبات من مثبطات محتملة. نحن نشرح حساب كل من تركيز مثبط نصف قصوى (IC50) وثابت تثبيط (Kط)-اثنين من الخصائص المستخدمة لقياس قوة مثبط انزيم. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة باستخدام مجموعة من GSTs المستخرجة من الخلايا أو GSTs البشرية النقية المؤتلفة ، وهي GST ألفا 1 (GSTA1) ، GST mu 1 (GSTM1) أو GST pi 1 (GSTP1). ومع ذلك، لا يمكن تطبيق هذا البروتوكول على 1 thta GST (GSTT1) ، كما هو غير ركيزة لهذا isoform. وقد استخدمت هذه الطريقة لاختبار قوة تثبيط الكركمين باستخدام GSTs من الكبد الخيول. الكركمين هو جزيء يعرض خصائص مضادة للسرطان وأظهر تقارب نحو isoforms GST بعد في توقعات الالتحام السيليكو. لقد أثبتنا أن الكركمين هو مثبط GST تنافسي قوي ، مع IC50 من 31.6 ± 3.6 μM و Ki من 23.2 ± 3.2 μM. الكركمين لديه القدرة على الجمع بينه وبين أدوية العلاج الكيميائي الكهروضي لتحسين فعاليتها.

Introduction

Cytosolic الجلوتاثيون S-transferase الإنزيمات (GSTs، EC 2.5.1.18) تحفيز اقتران الجلوتاثيون (GSH) في مختلف المركبات الكهربائية، مثل وكلاء العلاج الكيميائي، لإزالة السموم والقضاء عليها بسهولة من الجسم1. تم تحديد سبعة أشكال من cytosolic GST كما ألفا، مو، بي، سيغما، أوميغا، ثيتا، وزيتا. يتم التعبير عن GSTs بشكل رئيسي في الكبد والخصيات والرئتين والجهاز الهضمي2. وGST ألفا 1 (GSTA1) هو التعبير عن isoform للغاية في خلايا الكبد. الجسم غير متجانسة يعبر عن الأنواع الفرعية الأخرى، بما في ذلك GST pi 1 (GSTP1) في الغالب في الدماغ والقلب والرئتين، وGST مو 1 (GSTM1) في الكبد والخصيات3. على الرغم من وجود homology تسلسل عالية بين isoforms GST, كل المعارض خصوصيات الركيزة وتورط في استقلاب المخدرات والسرطان بطرق مختلفة, وفقا للتعبير التفاضلي4,5.

المركبات الكهربائية إما دخول الجسم خارجيا أو تنتج بشكل داخلي. المبيدات الحشرية والبروستاجلاندين والمواد المسرطنة والأدوية العلاجية الكيميائية هي بعض من الركائز المحتملة لردود فعل اقتران الجلوتاثيون6. على سبيل المثال، من المرجح أن يصبح أي مركب تفاعلي ناقص الإلكترونات يتشكل داخل الخلية الركيزة الكهربائية الزهرية. يتم التخلص من العوامل الألكيليات مثل الكلورامبوسيل أو الميلفالان كمقارنات من GSH حفزت من قبل GSTs، وقد تم ربط مستويات متزايدة من هذه الإنزيمات مع مقاومة لهذه المركبات6،7.

دور آخر مهم للGSTs السيتوسولي هو تنظيم نشاط kinases البروتين المنشط ميتوجين (MAPK) مثل MAPK8 (المعروف أيضا باسم c-Jun N-terminal kinase، أو JNK1) و MAP3K5 (المعروف أيضا باسم الكناسة المبرمج تنظيما للإشارة كيناز 1، أو ASK1)8. بعض isoforms في التشكل أحادية اللون الخاصة بهم ربط هذه البروتينات وبالتالي منع تتالي الفوسفور. في ظل الظروف العادية، فإن isoform GSTP1 عزل MAPK8 (المنشط للبروتين ج يونيو). الجمع بين ج يونيو مع بروتين C-Fos يشكل عامل النسخ البروتين المنشط 1 (AP-1)، وهو المسؤول عن تدوين الجينات الموالية لبروتينات. في الخلايا المجهدة ، والمجمع الذي شكلته GSTP1 و MAPK8 يتفكك ، يتم تنشيط ج يونيو ، والجينات المؤدية إلى المبرمج تبدأ في التعبير عن9. التعبير الأكبر عن هذا isoform GST قد يمنع المسار، مما يؤدي إلى زيادة جدوى الخلية، والمزيد من الانتشار الخلوي، وانخفاض حساسية الخلوية للعلاج الكيميائي. قد تحدث سيناريوهات مشابهة مع paralogs من GSTP1، على سبيل المثال، GSTM1، الذي يتفاعل مع MAP3K510.

الأدوار التي تقوم بها GSTs في استقلاب المخدرات وفي عزل MAPKs أدت إلى فرضية أن التعبير عن أكبر من GSTs قد يكون علامة على آلية مقاومة الورم للعلاج الكيميائي6,11. على سبيل المثال، GSTP1 هو overexed في العديد من أنواع السرطان وكان لها علاقة وجود مع سوء التكهن وزيادة حدوث الانتكاس8. وقد أظهرت تعدد الأشكال في هذه الجينات أيضا تفاضلية في معدلات التعرض للأدوية والبقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يقدمون أمراضا مختلفة، مما يعزز فكرة أن هذه الإنزيمات حاسمة بالنسبة لآليات مقاومة الأدوية. على سبيل المثال، يرتبط الأفراد مع النمط الجيني GSTM1 خالية مع انخفاض إزالة المخدرات والبقاء على قيد الحياة أفضل12،13. هناك عدة وسائل محتملة لمواجهة هذا التعبير المفرط ، مثل استخدام نظائر GSH ، وprodrugs التي يتم تنشيطها عن طريق اقتران مع GSTs ، أو مثبطات GST المباشرة14،15.

كل هذه الأساليب هي حاليا قيد التحقيق، وبدأت بعض المركبات التجارب السريرية لاستخدامها المحتملة بين المرضى. ومع ذلك، على حد علمنا، لا توجد مركبات في استخدام مثبطات GST في إعدادات سريرية15. في الواقع ، فإن عدم وجود خصوصية لبعض isoforms أو استنفاد GSH في الخلايا العادية ، والتي قد تؤدي إلى سميات ناجمة عن تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في أنظمة الأعضاء ، ليست سوى بعض العيوب التي تقلل من إمكانات مثبطات GST14،15. خطر أن هذه المركبات قد تمارس تأثيرات أخرى الدوائية على الجسم هي أيضا الحد من استخدامها. حمض الإثاماريك، على سبيل المثال، هو مثبط GST الأكثر دراسة على نطاق واسع في البيئات المختبرية، ولكن لأنه يستخدم في المقام الأول كمدر للبول قوي، هذه الخاصية يحد من استخدامه في تركيبة مع أدوية أخرى في البيئات السريرية. الكركمين هو مركب طبيعي آخر تم فحصه بنجاح كمثبط GST. هذا الجزيء هو اثير البوليفينول المستخرج من أنواع Curcuma longa من الكركم. وقد أظهرت نتائج واعدة كخيار العلاج ممكن ضد السرطان عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج من نوع مختلف من خطوط الخلاياالسرطانية 16,17. يمكن للمجمع تنظيم مسارات خلوية متنوعة، مثل التيروزين كيناز18 أو مسار GST. وقد أظهرت الدراسات مع البروتينات النقية قوتها تثبيط على GSTA1، GSTM1 و GSTP119،20. ومع ذلك ، لوحظت نتائج متضاربة في الخلايا السرطانية ، حيث تم قياس نشاط GST أكبر داخل الخلايا عندما تم علاج الخلايا بالكرمين21. وهكذا، من المهم التحقيق في تركيز مثبط نصف أقصى (IC50) وثابت تثبيط (Ki)من أي مثبطات GST المفترضة باستخدام بروتوكول وصفها بوضوح مع الضوابط المناسبة قبل التخطيط لأي تجارب الخلوية أخرى.

ولذلك فإن فحص واختبار مثبطات ضريبة السلع والخدمات الجديدة المحتملة ذات أهمية سريرية كبيرة، ويجب أن يكون أي مركب جديد موجود آمنًا وفعالًا للاستخدام بالاقتران مع الأدوية الكهروفيلية. قد يؤدي تركيز الأبحاث على مثبطات isoform الخاصة إلى تمكين تثبيط GST في أنسجة الورم التي تعرض أنماطًا محددة من تعبير GST ، مما يسمح بتطوير علاج توليف فعال. وقد يكون العثور على مثبطات ذات أنماط تفاضلية من التثبيط موضع اهتمام أيضا. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي المانع التنافسي الذي يستخدم GSH كركيزة إلى استنفاده. وقد تبين هذا الانخفاض من تركيز GSH في الخلايا للحث على الإجهاد التأ المؤسد في الخلايا العصبية, مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. ولا يمكن عكس طريقة أخرى شائعة من الكبح - تثبيط غير تنافسي - حتى لو كانت الركيزة موجودة بتركيزات عالية.

ويمثل معدل النشاط الأنزيمي من قبل ثابت مايكليس مينتين (Kم)والسرعة القصوى (Vماكس),والتي يمكن تحديدها عن طريق رسم رسم بياني ميخائيليس-مينتين, مع تركيز الركيزة ضد سرعة رد الفعل23. Km هو تركيز الركيزة المطلوبة لاحتلال نصف المواقع النشطة الأنزيمية، وهذا يعني أن Km عالية تمثل أقل تقارب. Vالحد الأقصى يمثل السرعة القصوى للتفاعل، التي تم التوصل إليها عندما تكون جميع المواقع النشطة مشغولة من قبل الركيزة. Km يساوي نصف Vكحد أقصى. 10- وهناك ثلاثة أساليب أكثر شيوعاً للكبح: التنافسية، وغير التنافسية، وغير التنافسية. في حالة تثبيط تنافسية، يرتبط المانع بالموقع النشط للأنزيم وينافس الركيزة. وبالتالي، لا يتغيرV max بعد إضافة المثبط، ولكن يزيد Km، حيث أن هناك حاجة إلى المزيد من الركيزة لمواجهة تثبيط. لا يحدث تثبيط غير تنافسي إلا عندما تشكل الركيزة مركبًا مع الإنزيم. في هذه الحالة، كما أن مستوى تثبيط يعتمد على الركيزة والانزيم التركيز، Vماكس وKم انخفاض عندما يضاف المانع إلى التفاعل. إن الطريقة الأخيرة من تثبيط غير تنافسية وهي مزيج من نمطين آخرين من التثبيط. يمكن أن يرتبط المانع بالموقع النشط للانزيم سواء كان الإنزيم مرتبطًا بركيزته أم لا. هنا Vالحد الأقصى النقصان بعد إضافة من المانع، ولكن Kم لا يغير24.

تم تطوير تحليل الطيفي الذي يقيس نشاط GST لأول مرة بواسطة Habig et al. في عام 1974 باستخدام 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) كركيزة لرد فعل22. الاقتران بين GSH و CDNB تشكل GS-DNB، الذي يعرض امتصاص الضوء الأقصى في الطول الموجي من 340 نانومتر، قابلة للتسجيل مع مقياس الطيف. معظم التقنية الموضحة أدناه مشتقة من Habig et al.، بما في ذلك معلومات عن أفضل الإعدادات ونقاط التحسين الهامة لمقايسة مثبطة. ويمكن تطبيق هذه التقنية على فحص مثبطات GST المحتملة ، سواء تم اختيارها من خلال اختيار الأدوية العقلانية باستخدام التنبؤات الحسابية أو عن طريق مراجعة الأدب. كما تناقش كيفية تكييف البروتوكول مع البروتينات GST توليفها حديثا أو isoforms محددة. على سبيل المثال، اختبار القوة المثبطة من isoforms GST التي تظهر متعددة الأشكال ذات الصلة سريريا أو من تعدد الأشكال أحادية النيوكليوتيدات (SNPs) يمكن أن تكون الاستخدامات المحتملة لهذا البروتوكول، واستهداف GSTs خاصة بالمريض.

يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة ومجدية وفعالة لفحص مثبطات GST المحتملة في المختبر قبل أي دراسات وظيفية أخرى. يتم وصف الخطوات اللازمة لتقييم الخصائص الأكثر قياساً للمثبط الأنزيمي: التركيز المثبط 50 (IC50) الذي هو تركيز المانع المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) الذي يتطلب تقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي بمقدار النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) الذي يتطلب تقليل النشاط الأنزيمي بمقدار النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC5 وثابت تثبيط (كط) الذي يمثل ثابت التوازن من تفكك بين المانع والانزيم، سمة من سمات تقارب بين هذين الجزيئين. يتم قياس هاتين القيمتين بالتراجع غير الخطي وباستخدام معادلات محددة لكل طريقة من أشكال التثبيط، على التوالي. كما نبرهن على تقييم هذا النمط من تثبيط، وذلك باستخدام المؤامرات Michaelis-Menten لتحديد تغييرالخامس ماكس وKم بعد إضافة المانع23،25،26.

Protocol

1. إعداد محلول انزيم GST

ملاحظة: يعتمد الإجراء الخاص بإعداد محلول الإنزيم على ما إذا كانت وحدات النشاط الأنزيمي معروفة قبل الفحص أم لا. وحدة انزيمية واحدة هي كمية الإنزيم اللازمة لتجميع 1 ميكرومول من المنتج في الدقيقة الواحدة. يتم تمثيل النشاط الأنزيمي في وحدة / مل أو μmol / دقيقة / مل ويعتمد على تخفيف الحل الأنزيمي. يتم تمثيل نشاط انزيمي معين في وحدة / ملغ أو μmol / min / ملغ ويعتمد فقط على نقاء المحلول. يتم تحديد كل من هذه الخصائص أدناه. إذا كانت الوحدة الأنزيمية من isoform GST معزولة غير معروف، يجب أن يقدر لضبط تركيزات انزيمية لكل رد فعل وتقديم نتائج قابلة للتكرار.

  1. إذا كانت وحدة الأنزيمية من GST المستخدمة في المُعرَض هو معروف:
    1. إعداد حل الأسهم الطازجة من انزيم GST في 0.1 U/mL في الماء ومن ثم المضي قدما مع الخطوة 2.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية في aliquots لعدة أشهر أو في -80 درجة مئوية لفترات أطول، ولكن يجب تجنب دورة التجميد/ ذوبان الجليد.
  2. إذا كانت وحدة الأنزيمية من GST المستخدمة في المقايسة غير معروف:
    1. كمي تركيز البروتين حل الانزيم باستخدام حمض ثنائي شونينيك (BCA) مقايسة البروتين، أو أي مجموعة أخرى.
    2. تخفيف محلول البروتين لتركيز البروتين النهائي من 0.02 ملغ / مل.
    3. أضف 20 ميكرولتر من محلول الإنزيم، و20 ميكرولتر من GSH 25 mM (الوزن الجزيئي: 307.32 غ/مول)، و150 ميكرولتر من محلول دولبيككو المحلى العازل للفوسفات (DPBS) إلى لوحة 96 بئرًا. للفراغ، إضافة 20 ميكرولتر من الماء بدلا من محلول انزيم.
    4. إضافة 10 ميكرولتر من CDNB 50 مللي أم (الوزن الجزيئي: 202.55 غرام / مول) الركيزة لكل بئر.
    5. على قارئ المصغّر الطيفي، قم بتعيين بارامترات قراءة الآبار عند 340 نانومتر. فمن المستحسن لقياس امتصاص كل دقيقة لمدة 10 دقيقة.
    6. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة المصغرة، وابدأ القراءة وفقًا لإعدادات الخطوة 1.2.5.
    7. حساب التغيير في امتصاص في الدقيقة الواحدة للعينات الأنزيمية والفارغة.
      ملاحظة: تحقق من أن رد الفعل خطي بواسطة رسم امتصاص على المحور ص والدقائق على المحور س. إذا كان رد الفعل ليس خطيا ويصل إلى هضبة ، فهذا يعني أن يتم استخدام جميع الركيزة ورد الفعل سريع جدا. وبالتالي، تقليل كمية الإنزيم المضافة إلى البئر عن طريق تخفيف محلول الأسهم بنسبة اثنين.
    8. تصحيح فارغ قراءات امتصاص عينات الاختبار.
    9. مع المعادلة 1، التي تمثل قانون بير لامبرت، حساب تركيز GS-DNB شكلت (في μM) من قبل رد فعل كل دقيقة.
      المعادلة 1:
      Equation 1
      حيث C هو تركيز الركيزة في μM،A 340/min هو التغير في الامتصاص في الدقيقة الواحدة، كما هو مقيس في الخطوة 1.2.7، ε هو معامل الانقراض الضروس للمكون CDNB عند 340 نانومتر (0.0096 μM-1*cm-1)،وl هو طول مسار الضوء في البئر (في الطول). لطبقة 96-well مليئة 200 ميكرولتر من محلول انزيمي، طول المسار حوالي 0.55 سم. يمكن أن تختلف هذه القيمة وفقا لنموذج لوحة ويجب التحقق من الشركة المصنعة.
    10. لتحديد كمية المنتج الموجود في بئر واحد في ميكرومول / دقيقة، مضاعفة النتائج التي تم العثور عليها باستخدام المعادلة 1 من حجم المحلول، 2 × 10-4 L.
    11. تطبيع النشاط لكل كمية من البروتين المستخدمة عن طريق تقسيم نتائج الخطوة 1.2.9 على 4 × 10-4 ملغ. والنتيجة هي النشاط الأنزيمي المحدد في وحدة / ملغ أو μmol / min / ملغ.
      ملاحظة: إذا تم تغيير التخفيف في الخطوة 1.2.6، بسبب رد فعل غير خطي، ضبط كمية البروتين وفقاً لذلك.
    12. للعثور على النشاط الأنزيمي، ضبط النتائج إلى تركيز البروتين في ملغ/مل بضرب النشاط الأنزيمي المحدد الموجود في الخطوة 1.2.10 في 0.002 ملغ/مل. وهذا سيعطي النشاط الأنزيمي في وحدة / مل أو μmol / min / مل.
      ملاحظة: على النقيض من النشاط الأنزيمي، وهذا التدبير لن يتغير اعتمادا على تخفيف محلول البروتين. نفس المذكرة كخطوة 1.2.10 ولكن لتركيز البروتين.
    13. إعداد محلول الأسهم من إنزيم GST في 0.1 وحدة / مل في الماء ومن ثم المضي قدما مع الخطوة 2.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية في aliquots لعدة أشهر أو في -80 درجة مئوية لفترات أطول، ولكن يجب تجنب دورة التجميد/ ذوبان الجليد. ويوصى بالسيطرة على النشاط الأنزيمي إذا أجريت التجارب خلال فترة طويلة من الزمن حيث قد يحدث تدهور محلول البروتين.

2. قياس من ثابت مايكليس مينتن من isoform GST لDNB

ملاحظة: يتم شرح الإجراء لركيزة CDNB ولكن يمكن تطبيقها على أي ركيزة أخرى، مثل GSH. كل تركيز من CDNB يحتاج فراغه الخاص، حيث أن امتصاص في 340 نانومتر سيزداد وفقا لتركيز CDNB.

  1. إعداد ستة تركيزات مختلفة من CDNB، تتراوح بين 10 mM إلى 100 mM، في الإيثانول 95٪ (v/v).
  2. إعداد محلول الفحص، مع 10 ميكرولتر من CDNB، 20 ميكرولتر من إنزيم GST، 20 ميكرولتر من GSH 25 mM، و 150 ميكرولتر DPBS. للفراغ، بدلا من الحل CDNB، إضافة فقط 10 ميكرولتر من الإيثانول 95٪.
  3. إعداد فارغة لكل تركيز CDNB، مع 10 ميكرولتر من CDNB، 20 ميكرولتر من الماء، 20 ميكرولتر من GSH 25 مل، و 150 ميكرولتر DPBS.
  4. تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق مع قارئ microplate.
  5. تصحيح فارغة امتصاص عن طريق طرح النتائج من فارغة من ذلك من آبار الاختبار الأخرى الصحيحة. وفقا للقيم المقاسة، حساب سرعة التفاعل باستخدام المعادلة 2.
    المعادلة 2:
    Equation 2
    حيث A340/min هو التغيير المحدد تجريبيا في امتصاص في الدقيقة الواحدة،V مجموع (الحجم الكلي) يساوي 0.2 مل،إنزيم V (حجم الانزيم) هو 0.02 مل، εGS-DNB هو معامل الانقراض الضروس من GS-DNB في 340 نانومتر (9.6 mm-1سم*-1). في بئر 200 ميكرولتر من لوحة 96-جيدا، طول المسار هو 0.55 سم (اعتمادا على نوع لوحة) ومعامل الانقراض يساوي 5.3 mM-1. ويمكن تمثيل السرعة إما بميكمول/مل/دقيقة أو mM/min.
  6. رسم الرسم البياني ميخائيليس مينتن مع السرعة (على المحور ص) ضد التركيز الركيزة (على المحور س).
  7. تحديد السرعة القصوى (Vالحد الأقصى)من رد فعل وثابت مايكليس مينتين (Kم)(أي، تركيز الركيزة في نصفالحد الأقصىالخامس ).
    ملاحظة: باستخدام برامج مثل GraphPad Prism، يمكن تركيب منحنى حركية الإنزيم باستخدام الانحدار غير الخطي لحساب معلمات حركية إنزيم مايكليس مينتن، مثل Vmax و Km.
  8. إعداد حل الأسهم CDNB في 20 مرة Kم المحسوبة في الإيثانول 95٪ (v / v).

3. امتصاص المانع GST المحتملة

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة للتحقيق فيما إذا كان مثبط GST المحتمل المستخدم في التفاعل ينتج عن مستقلب يزيد من الامتصاص في الطول الموجي الذي يتم قياسه. إذا كان ذلك، فإن كمية المانع المستخدمة سيكون لها تأثير على النتائج وينبغي إعداد فارغة محددة لكل تركيز.

  1. تخفيف المانع إلى التركيزات المطلوبة.
    ملاحظة: إعداد ثلاثة تخفيفات مختلفة، ويفضل أن تكون أقل، متوسطة، وأعلى تركيزات اختبار أثناء اختبار تثبيط. وينبغي أن يكون الحد الأقصى لتركيز نظام إدارة الانبعاثات في البئر مساوياً أو أقل من 1 في المائة (v/v). اختبرنا تأثير تركيز DMSO على الفحص في مختبرنا ، و 1٪ لم يغير نشاط GST بشكل كبير.
  2. في لوحة 96-جيدا، إضافة 2 ميكرولتر من المانع GST المحتملة، 20 ميكرولتر من GSH 25 mM، و 168 ميكرولتر من DPBS. استخدام السيطرة المناسبة، مع عدم وجود مانع، عن طريق إضافة كميات متساوية من المذيبات المستخدمة لعينات المانع.
  3. احتضان رد الفعل لمدة 10 دقائق ، لبدء رد فعل انزيمي.
    ملاحظة: يمكن تحسين هذه الخطوة، من خلال اختبار أوقات الحضانة المختلفة، مع التوأم أهداف بداية رد الفعل مع تجنب استنفاد الكلية للركيزة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من CDNB إلى كل بئر لتحقيق التركيز النهائي في Km الموجودة في الخطوة 2.
  5. هز اللوحة لبضع ثوان.
  6. تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق مع قارئ microplate.
  7. حساب التغير في امتصاص في الدقيقة الواحدة.
  8. تحقق من التغير في الامتصاص مقارنة بكل من رد الفعل الفارغ ورد فعل التحكم السلبي بدون مانع.
    1. إذا كان هناك تغيير كبير، استخدم فراغ لكل تركيز مثبط من أجل ضبط النتائج.
      ملاحظة: تشير هذه النتيجة إلى أن مكونات التفاعل، مع عدم وجود إنزيم GST، تتفاعل بشكل عفوي وتنتج المستقلب الذي يزيد من الامتصاص عند 340 نانومتر. لتصحيح هذا الامتصاص الإضافي، يجب قياس فراغ محدد لكل تركيز.
    2. إذا لم يكن هناك تغيير كبير في الامتصاص، استخدم فراغاً عاماً، يحتوي فقط على المذيب المستخدم لتخفيف مثبطات GST، لجميع التركيزات.

4. تثبيط تقييم GST و IC50

  1. إعداد تسعة تركيزات من مثبطات GST المحتملة.
    ملاحظة: يمكن تكييف التركيزات وفقا للنتائج. والهدف من ذلك هو تحديد الهضاب السفلية والعُلى من منحنى الانحدار غير الخطي. راجع قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذه الخطوة.
  2. إعداد محلول الفحص عن طريق تخفيف 20 ميكرولتر من محلول GSH في 25 mM مع 148 ميكرولتر من DPBS. تطويع حجم التداول وفقا لعدد الآبار المستخدمة في الفحص.
  3. في لوحة واضحة 96-جيدا، وإعداد رد فعل انزيمي في حجم النهائي من 190 ميكرولتر. من المستحسن استخدام ماصة متعددة القنوات لهذه الخطوات.
    1. بالنسبة لآبار الاختبار، أضف 20 ميكرولتر من محلول الإنزيم، و2 ميكرولتر من محلول مثبطات GST المحتملة و168 ميكرولتر من محلول الفحص.
    2. للتحكم، إضافة 20 ميكرولتر من محلول انزيم، 2 ميكرولتر من المزيل المستخدمة لمثبطات GST و 168 ميكرولتر من محلول الفحص.
    3. بالنسبة للآبار الفارغة، أضف 20 ميكرولتر من الماء، و2 ميكرولتر من مثبطات GST المحتملة و168 ميكرولتر من محلول الفحص.
      ملاحظة: إذا كان مثبط GST يمتص الطول الموجي 340 نانومتر، ثم يجب إعداد فارغة محددة لكل تركيز اختبارها.
  4. أضف 10 ميكرولتر من حل CDNB عند 20x Km لكل بئر ، بما في ذلك الفراغ. من المستحسن استخدام ماصة متعددة القنوات لهذه الخطوة.
  5. هز اللوحة لبضع ثوان.
  6. قياس امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام قارئ microplate.
  7. تصحيح فارغة امتصاص عن طريق طرح النتائج من الفراغات اختبار جيدا.
  8. تطبيع النتائج عن طريق تقسيم القيم التي تم الحصول عليها باستخدام محلول مثبط GST بواسطة امتصاص عنصر التحكم في الدقيقة مع عدم وجود مانع.
  9. رسم الرسوم البيانية الانحدار غير الخطية من تركيز اللوغاريتمي (المحور س) من المانع ضد نشاط GST (المحور ص)، وبالتالي تحديد IC50.
    ملاحظة: GraphPad Prism بحساب IC50 من مخططات الانحدار غير الخطية عن طريق التنبؤ بالتركيز الذي سيظهر 50% من النشاط الأنزيمي في عنصر التحكم. ويستند التنبؤ على الهضاب السفلية والعلوية، فضلا عن منحنى المنحدر الذي يتكون من الرسم البياني السيني.

5. تقييم Kطونوع تثبيط

  1. إعداد أربعة تركيزات CDNB مختلفة: ثلاثة أعلى وواحد يساوي Km وجدت سابقا.
  2. إعداد ثلاثة تركيزات مختلفة مثبطات GST, يساوي أو أقل من IC50 وجدت سابقا.
  3. إجراء فحص تثبيط كما هو موضح في الخطوات 4.2 إلى 4.7.
  4. حساب سرعة التفاعلات باستخدام المعادلة 2.
  5. رسم الرسومات البيانية مايكليس مينتن لكل تركيز المانع وحسابالخامس ماكس وKم من كل رد فعل.
  6. وفقا للتغيرات فيV ماكس وKم عند استخدام تركيزات مختلفة، وتقييم وضع مثبطات GST من تثبيط.
    ملاحظة: يتم شرح هذه الخطوة بمزيد من التفصيل في المقاطع النتائج والمناقشة.
  7. استنادا إلى طريقة تثبيط، وحسابك ط.
    ملاحظة: في GraphPad Prism، سيتم استخدام معادلات مختلفة لحسابK ط وفقا لطبيعة تثبيط. وتستند المعادلات المستخدمة علىالحد الأقصى Km و V الملاحظة بعد إضافة المانع ومقارنة بـ Km و Vmaxمن عنصر التحكم.

Representative Results

Michaelis-Menten ثابت (Kم)من CDNB مع GST من الكبد الخيول
الكركمين هو مركب طبيعي آمن حتى بعد الابتلاع بجرعات أعلى27 التي أظهرت خصائص مكافحة اجرام16. وقد أظهرت قوة المثبطة لهذا الجزيء على الإنسان المؤتلف GSTs19,20. باستخدام البروتوكول الموصوف، قمنا بتقييم تأثير الكركمين على نشاط GST باستخدام مجموعة من الأشكال متساوي الشكل GST من كبد الخيول. وفقا للمورد، والنشاط المحدد لهذا المزيج من البروتينات هو 25 U/ ملغ. تم إعداد محلول مخزون من 0.1 U/mL عن طريق حل مسحوق التحلل في الكمية المناسبة من الماء. تم استخدام حمض الإثاكرينك بالتوازي كتحكم إيجابي لأن هذا المركب هو المانع GST الأكثر استخدامًا في الدراسات. وترد الخطوات في إعداد اختبار نشاط ضريبة السلع والخدمات واختبار مثبطات في الشكل 1.

وKm يجب أن تكون محددة لكل انزيم رد فعل الركيزة لأن استخدام تركيز الركيزة يعادل Km من شأنه أن يضمن أي تحيز بشأن تحديد طريقة تثبيط28. تم اختبار ستة تركيزات مختلفة من CDNB، تتراوح بين 0.5 mM إلى 5 mM، لقياس هذه المعلمة، وذلك باستخدام تركيز ثابت قدره 2.5 mM GSH.

وكان حجم رد الفعل النهائي 200 ميكرولتر، في لوحة 96 جيدا. وقد استخدمت فراغات محددة لكل تجربة، باستخدام نفس تركيز CDNB كما الاختبار جيدا لأن اقتران التلقائي من CDNB و GSH يمكن أن يحدث وقد يزيد من امتصاص. تم استخدام تركيز انزيم نهائي من 0.01 وحدة / مل لجميع ردود الفعل، عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول الأسهم إلى مزيج المقايسة. تم تسجيل امتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق. تم حساب السرعة (في mM/min) من رد الفعل باستخدام المعادلة 2. رسم رسم بياني من مايكليس مينتن من تركيز الركيزة (mM) ضد السرعة (μM/min)(الشكل 2)،وتم حساب Km من التفاعل. وتكررت التجربة إلى أن أظهرت ثلاث مجموعات على الأقل من البيانات نتائج مماثلة. تم قياس Km من CDNB مع GST من كبد الخيول كـ 0.26 ± 0.08 mM. تم استخدام تركيز 0.2 mM من CDNB لكل مقايسة مثبطة باستخدام هذه الدفعة من GSTs.

لم يتم قياس أي تشكيل عفوي من المستقلب الذي يمتص في 340 نانومتر خلال التجارب باستخدام الكركمين المحتضنة وحدها مع GSH و CDNB. تم استخدام نفس الفراغ لكل تركيز مثبط في كل تجربة.

قوة الكركمين المثبطة على GSTs
تم التنبؤ بفاعلية الكركمين المثبطة باستخدام محاكاة إرساء السيلكو مع البرامج (على سبيل المثال ، AutoDock Vina الإصدار 1.1.2). 29 تم توقع الطاقة الحرة الملزمة بين مختلف isoforms GST (وهي GSTA1، GSTM1 و GSTP1) والتكريك (لم تظهر البيانات). ثم، ثابت تثبيط Kتم حسابها باستخدام المعادلة 3.

المعادلة 3:
Equation 3
حيث ∆G هو الطاقة الحرة ملزمة وجدت باستخدام في تحليل السيليكو، R هو ثابت الغاز من 1.987 كال * K-1* مول-1، و T هو درجة الحرارة أثناء التجربة، في هذه الحالة في كلفن (298 K).

استناداً إلى نتائج الطاقة المجانية الملزمة التي عادها AutoDock Vina، الكركمين هو مثبط GST قوي من GSTA1 الإنسان، GSTM1 و GSTP1، مع قيم Ki من 78.1 ميكرومتر، 78.1 ميكرومتر و 27.4 ميكرومتر على التوالي. أجريت أول مقايسات مثبطة باستخدام هذه التقديرات الحسابية Kط، وتم تعديل التركيزات وفقا للنتائج، إذا لزم الأمر.

أولاً، تم تقدير IC50. هذه الخاصية هي تركيز المثبطات التي تقلل من معدل تفاعل الإنزيم بنسبة 50٪. ولذلك فهي تعتمد على تركيز الإنزيم30. وقد تم إعداد تسعة تركيزات نهائية من المثبط، تتراوح بين 0.39 ميكرومتر و100 ميكرومتر مع كل تركيز مضاعف للتركيز السابق. وكان حل فحص يتكون من 20 ميكرولتر من GSH 2.5 mM، 20 ميكرولتر من GST من الكبد quine في 0.01 U/mL النهائي، 2 μL من محلول الكركمين، و 148 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كان يتألف عنصر التحكم من نفس الحل مع الملوين المستخدم في الكركمين. تم احتضان هذا الخليط لمدة 15 دقيقة لبدء فحص الإنزيم وتجنب تدهور الكركمين في محلول الفحص ، حيث أن هذا المركب غير مستقر في حلول العازل31. بعد ذلك، تمت إضافة 10 ميكرولتر من محلول CDNB في 4 mM إلى كل بئر، لتركيز نهائي من 0.2 mM CDNB. تم تسجيل الامتصاص في 340 نانومتر كل دقيقة لمدة 10 دقائق، لحساب التغيرات في امتصاص في الدقيقة الواحدة. لحساب IC50، تم تطبيع كل عينة محتضنة مع الكركمين إلى عنصر التحكم، لإعطاء النسبة المئوية للنشاط. تم تحليل هذه النتائج باستخدام برنامج التخطيط عن طريق حساب الانحدار غير الخطي للتركيز اللوغاريتمي للمثبط مقابل المثبط. وكان IC50 وجدت لتكريم الكركمين على GST من الكبد الخيول 31.6 ± 3.6 μM(الشكل 3A).

وقد أجريت نفس التجربة بالتوازي باستخدام حمض الإثاماريكك كتحكم إيجابي، بتركيزات تتراوح بين 0.39 إلى 100 ميكرومتر، كما هو الحال مع الكركمين. تم العثور على IC50 لتكون 6.6 ± 1.1 μM (الشكل 3B).

وكانت الخطوة التالية هي تقييم طريقة الكركمين في تثبيط هذه التحويلات. تم اختبار أربعة تركيزات مختلفة من الكركمين: 0 و 7.5 و 15 و 30 ميكرومتر، بالإضافة إلى أربعة تركيزات مختلفة من CDNB: 0.2، 0.4، 1، 1.5 mM. كان البروتوكول هو نفسه كما هو الحال بالنسبة للتجربة السابقة. تم حساب سرعة كل شرط باستخدام المعادلة 2. تم رسم منحنى لكل تركيز المانع، مع السرعة (في μM/min) ضد تركيز الركيزة (mM)(الشكل 3C). تم تحديدV ماكس وKم على أساس كل مؤامرة مع GraphPad بريزم. تم تقييم وضع المثبط المحتمل من تثبيط وفقا للتغيرات في هذين المعلمتين والحالة المختلفة للمقيّمات. 24 كما لمV ماكس تغيير كبير بين الظروف ولكن Km زيادة مع تركيزات مثبطات مختلفة, الكركمين تثبيط GSTs تنافسية. يحدث هذا النمط من تثبيط عندما يتنافس المانع مع الركيزة للموقع النشط للأنزيم. لقياس Kط من المانع تنافسية، يستخدم GraphPad المعادلة 4 والمعادلة 5 كما وصفها كوبلاند وآخرون32.
المعادلة 4:
Equation 4
المعادلة 5:
Equation 5
حيث Km obs هو ثابت ميخائيليس مينتن الملاحظة، Km هو ثابت Michaelis-Menten من عنصر التحكم،[I]هو تركيز المثبطات، Ki هو ثابت تثبيط، Y هو السرعة، و X هو التركيز تحتية.

وتستند الحسابات إلى نفس التجارب التي أجريت على تقييم طريقة التثبيط. وKأنا المقدرة لتثبيط الكركمين من GST من الكبد الخيول كان 23.2 ± 3.2 μM.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي يصف خطوات مقايسات GSS الأنزيمية والتثبيط. يتم عرض تفاصيل حول الإجراء في قسم البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المؤامرة Michaelis-Menten من نشاط انزيم GST. وقد استُخدم تركيز متزايد للركيزة CDNB بتركيز ثابت من GSH (2.5 م م) لتحديد نشاط GST من مجموعة من GST من كبد الخيول. تم تحديد قيمة Km لـ CDNB كـ 0.26 ± 0.08 mM وفقًا لمنحنى الرسم البياني. كل نقطة بيانات عن المؤامرة يمثل متوسط أربعة أشواط تجريبية مختلفة مع SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير الكركمين وحمض الإثاماريك على نشاط انزيم GST. (أ - ب) إضافة تركيزات متزايدة من الكركمين(A)أو حمض الإيثاكريك التحكم الإيجابي(B)، مع الحفاظ على نفس GST (0.01 U/mL) ، GSH (2.5 mM) وCDNB (0.2 mM) واستخدمت التركيزات النهائية لحساب IC50 من كل من المركبات لGST من الكبد الاكوين مع تراجع غير خطي. تم تحديد IC50 على النحو 31.6 ± 3.6 μM للتكريم و 6.6 ± 1.1 μM لحمض الإثاكريك. (C) Michaelis-Menten مؤامرة من تركيزات مختلفة من الكركمين, اختبارها ضد تركيزات متفاوتة من الركيزة CDNB مما يدل على وضع تنافسي من تثبيط. ومع عدم وجود مانع، تم قياسV max و Km على النحو 132.7 ± 4.6 ميكرومتر و0.5 ± 0.08 ميكرومتر على التوالي. مع 30 ميكرومتر من الكركمين، Vماكس وKم كانت 130.4 ± 13.1 μM و 1.08 ± 0.39 μM. نقاط البيانات في جميع الرسوم البيانية(A-C)تمثل وسيلة من ثلاثة أشواط تجريبية مختلفة مع SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نحن نقدم بروتوكول يصف كل خطوة من قياس قياس الطيفي GST انزيم المقايسة، لشاشة مثبطات مُحتَل(الشكل 1، الجدول 1)وتحديد فعاليتها المثبطة. وأكدنا أيضا على المعايير الأكثر أهمية للنظر في أنزيم دقيقة المقايسة توفير نتائج قابلة للتكرار. المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف على الطرق الأخرى لقياس الألوان أو قياس الطيف الكتلي هي أن هذا البروتوكول سريع وسهل الأداء ويوفر قياسات كمية لنشاط GST بالإضافة إلى قوة تثبيط الجزيئات التي تم فحصها.

نقدم طريقة حساب اثنين من أهم معلمات Michaelis -Menten من مثبطات انزيم: IC50 وKi. وسوف مثبط قوي بذل أدنى ممكن KI وIC50, مشيرا إلى أن تقارب بين المانع والانزيم هو ارتفاع30. كما IC50 يعتمد على تركيز الانزيم وشروط الفحص33، قد يكون من الصعب استخدام هذه القيمة لمقارنة مثبطات من تجارب مختلفة أو الحصول عليها باستخدام شروط أخرى فحص34. استخدام ثابت من تثبيط Kأنا هو مؤشر أفضل من قوة المثبطة من المركبات المحتملة. Kط يمكن استخدامها لمقارنة اثنين من مثبطات مع وسائط مختلفة من تثبيط، كما أنه يعتمد فقط على تقارب بين المانع والانزيم. ومع ذلك، أن يكون فكرة واضحة عن طبيعة تثبيط واحد يجب تحديد كل من المعلمات المانع30. قمنا بقياس IC50 وK ك 31.6 ± 3.6 ميكرومتر و 23.2 ± 3.2 ميكرومتر على التوالي ، مما يشير إلى أن هذا المركب هو مثبط GST قوي.i وأكدت هذه النتائج في توقعات silico، التي تقدر قيم KI بين 27.4 إلى 78.1 μM لمختلف isoforms GST الإنسان والتكريم.

نشاط انزيمي أو معدل رد الفعل وكمية الإنزيم
كما ذكر أعلاه، يعتمد IC50 على تركيز الإنزيم، وإجراء تجربة مع مستوى غير معروف من النشاط الأنزيمي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئة33. للسيطرة على عوامل أخرى، والتي قد تقلل من النشاط المثبط، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار ويقيس النشاط الأنزيمي لكل دفعة جديدة من GSTs. على سبيل المثال، قد يؤدي تدهور دفعة انزيمية، الناجمة عن دورات تجميد/ذوبان كثيرة جدا، إلى تقليل النشاط وبالتالي إلى انخفاض IC50 حتى لو كانت التجربة قد أجريت في ظل نفس الظروف. وبعبارة أخرى، فإن استخدام 0.01 وحدات من انزيم لا تعطي نفس النتائج باستخدام 1 وحدة. استخدام الإنزيمات كثيرة جدا قد يؤدي إلى استنفاد سريع للركيزة ورد الفعل لن يكون لها شكل خطي. وبالتالي يمكن أن يؤدي هذا المعلم إلى نتيجة غير دقيقة، حيث لن ينظر إلى أي تغيير في الامتصاص بعد فترة حضانة طويلة.

Kم القيمة
لضمان أفضل الظروف لتقييم نوع تثبيط التي تظهر من قبل المانع، يجب أن يكون تركيز الركيزة مساوية أو أقل من ثابت مايكليس مينتين (Kم). يتم تمثيل Km من قبل تركيز الركيزة المطلوبة لاحتلال نصف المواقع النشطة على انزيم28. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يؤدي ارتفاع تركيز الركيزة إلى مواجهة المانع التنافسي، وسيكون من الصعب تقييم هذا النوع من التثبيط في مثل هذه الظروف. وهكذا، فإن إحدى الخطوات الحاسمة في هذه المنهجية هي تحديد الـ Km للانزيم للركيزة المختارة (هنا CDNB). في بعض الدراسات، لم يتم تحديد هذه القيمة وهذا يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة حول نمط تثبيط الناجمة عن المانع، وإذا كان وضع تثبيط غير صحيح، وسوف يتم حسابK ط بشكل غير صحيح كما تعتمد المعادلة على نمط تثبيط26،28. إذا تم اختبار isoform GST مختلفة، تقييم جديد لقيمةم ك إلزامي، لأن هذه القيمة هي فريدة من نوعها لزوج من الانزيم ويغاند. كما استخدمنا تركيز CDNB أقل قليلا من Kم (0.2 mM), التي حددناها بأنها 0.26 ± 0.08 mM, تم تحديد الوضع التنافسي المتوقع من تثبيط الكركمين على GST بدقة.

IC50
الحصول على منحنى السيني جيدة التي لتقدير IC50 يتطلب العثور على كل من الهضاب السفلية والعلوية. الهضبة السفلية تمثل تركيزات المانع التي توفر أقصى قدر من النشاط المثبط. في بعض الحالات، قد لا يمنع مركب الإنزيم بشكل كامل، حتى في تركيزات عالية، بسبب مشاكل تقنية مثل القابلية للذوبان. ومع ذلك ، يمكن أن تتناسب أدوات مثل GraphPad Prism مع الهضبة السفلية بدقة تامة. تتكون الهضبة العليا من تركيزات المثبطات ، والتي لا تكفي لمنع الإنزيم ، وبالتالي فإن النشاط أقصى. كل من هذه الهضاب حاسمة لتحديد IC50 وكذلك التركيزات بينهما، من أجل العثور على منحدر المنحنى - ثم يمكن أن تستمد IC50 من شكل منحنى السيني35. الكركمين هو غير قابل للذوبان في الماء، وبالتالي الحد الأقصى للتركيز المستخدمة في هذا الفحص محدودة، لتجنب هطول الأمطار في محلول المقايسة. وهكذا، استخدمت حلول أقل تركيزاً، لا تمنع تماماً نشاط ضريبة السلع والخدمات. وأثار ذلك مسائل لتحديد الهضبة السفلية. لمواجهة هذه المشكلة، توقعنا القيم السفلية استناداً إلى الرسم البياني الانحدار غير الخطي، الذي قدم IC50 من 31.6 ± 3.6 μM الكركمين (الشكل 3A). بالنسبة لحمض الإثاكريك، لم تكن هناك حاجة للتنبؤ بالقيم للهضبة السفلية لأن هذا المركب قابل للذوبان في محلول المقايسة وتم قياس IC50 عند 6.6 ± 1.1 ميكرومتر.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة على isoforms GST الأكثر تعبيراً في الإنسان، وهي GSTA1، GSTM1 أو GSTP1. غير أن هذا البروتوكول غير مناسب لتحديد نشاط الشكل الأيزوي GSTT1، لأن المجلس ليس ركيزة لهذا النوع الفرعي. 36، 37 وفي الوقت نفسه، يمكن تعديل البروتوكول قليلاً لمواجهة هذه المشكلة. على سبيل المثال ، باستخدام 1،2-الايبوكسي-3-(4'-نيتروبينوكسي)(ENPP) كركيزة لGSTT1 وقياس كمية من الاقتران في 360nm بدلا من 340nm. 37

يمكن أن تكون خطوات البروتوكول تكييفها وتطبيقها لاختبار نشاط GST واختبار المانع في تجارب ثقافة الخلايا. قياس نشاط GST على الخلايا المعالجة مع وبدون مثبط GST سوف تشير إلى ما إذا كان يمكن استخدام هذا المركب في مثل هذه الإعداد التجريبية. ومن المثير للاهتمام خاصة عندما يكون مثبطات ليبوفيلي. على سبيل المثال، عرضنا أن الكركمين هو مثبط GST قوي باستخدام هذا البروتوكول. ومع ذلك، قد يكون تطبيقه على الدراسات الخلوية محدودا، لأن الجزيء غير قابل للذوبان في الماء بشكل ضعيف ويتحلل بسرعة في الوسط. (31) من الممكن تحسين هذا البروتوكول من خلال تحديد غير الشكل غير الركيزة CDNB. استخدام هذا البروتوكول في دراسات الخلية سوف تعطي فقط معلومات حول نشاط GST الشاملة، ولكن ليس على نشاط النوع الفرعي GST دقيقة. إضافة الركيزة isoform محددة و / أو باستخدام ISOFORM GST المؤتلف محددة تسمح لاختبار isoform مثبطات GST محددة.

في الختام، نحن وصف إجراء كامل لاختبار مثبطات GST التي يمكن استخدامها في تركيبة مع العلاج الكيميائي الكهربائي. وأكدنا على الخطوات الحاسمة من إنزيم GST واختبار تثبيط، لاختبار جزيء مثيرة للاهتمام المحتملة وتحديد كفاءتها كما المانع مع القيم الكمية، IC50 وKi. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مركب مُفتَقَد، كما يمكن تنفيذها على الأشكال الأيزوفورمات GST البشرية الأكثر تعبيراً (GSTA1، GSTM1 و GSTP1)، أو تكييفها قليلاً لأداء دراسات ثقافة الخلية مع مثبطات GST أو قياس نشاط أيزوفورم GST آخر مثير للاهتمام من الاختيار.

الكواشف اسم التركيز في محلول المقايسة الاخري
الركيزه CDNB قياس Km (mM) مخففة في 95٪ الإيثانول. يجب أن يكون تركيز الإيثانول النهائي ≤ 5٪ (v/v)
الركيزة المترافقة GSH 2.5 مليون متر مخففة في الماء.
يجب أن تشبع تركيز الحل.
المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني - pH = 7.1
انزيم تجمع من isoforms GST أو isoform نقية 0.01 وحدة/مل، تحدد تجريبيا. مخففة في الماء.
مثبط GST مركب محتمل من الاختيار IC50: 3 تركيزات تمنع الحد الأقصى، 3 التي تمنع الحد الأدنى، و 3 في ما بين. مخففة في DMSO ثم في الماء، أن يكون التركيز النهائي من DMSO ≤ 1٪ (v/v)
كط: 3 تركيزات حول IC50.
معلمات
درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية)
pH = 7.1
≤ 1 في المائة (v/v)
الإيثانول ≤ 5% (v/v)

الجدول 1: ملخص الكواشف والمعلمات التي يجب مراعاتها أثناء إجراء فحص لتثبيط ضريبة السلع والخدمات.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعمت مؤسسة كانسيرس هذا العمل البحثي. ويود المؤلفان أن يعترفا بالسيدة لورانس ليس والسيد يوان سارمينتو للمساعدة التقنية، ولا سيما في إجراء تجارب التكرار مع توحيد الأقوال التي بها مثبطات. والمناقشات المثمرة والمدخلات التي أجراها السيد دينيس مارينو، والدكتورة سيمونا ملاكار، والدكتور فيد ملاكار، هي مناقشات ومداخلات، وهي مناقشات ومداخلات ونُقِر بها. نشكر الدكتورة باتريشيا هويزو دياز كورتيس على مساعدتها في سرد الفيديو. نشكر الدكتور Muthukumar على مدخلاته في توقعات silico. كما نشكر السيد دارين هارت على مساعدته في قراءة هذه المخطوطة باللغة الإنجليزية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
  2. Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
  3. Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
  4. Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
  5. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
  6. Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
  7. Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
  8. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
  9. Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
  10. Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
  11. Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
  12. Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
  13. Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
  14. Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
  15. Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
  16. Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
  17. Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
  18. Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
  19. Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
  20. Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
  21. Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
  22. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  23. Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
  24. Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).
  25. Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
  26. Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
  27. Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
  28. Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
  29. Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
  30. Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
  31. Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
  32. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
  33. Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  34. Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
  35. Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
  36. Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
  37. Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 164، الجلوتاثيون S-transferases، مثبطات GST، مقايسة انزيم، مقايس تثبيط، IC50، Kط
فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robin, S. K. D., Ansari, M.,… More

Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter