Summary
Glutation S-överföraser (GSTs) är avgiftning enzymer som deltar i metabolismen av ett flertal kemoterapeutiska läkemedel. Överuttryck av GSTs är korrelerade med cancer kemoterapi motstånd. Ett sätt att motverka denna fenotyp är att använda inhibitorer. Detta protokoll beskriver en metod med hjälp av en spektrofotometrisk analys för att skärmen för potentiella GST-hämmare.
Abstract
Glutation S-överföraser (GSTs) är metabola enzymer som ansvarar för eliminering av endogena eller exogena elektrofila föreningar genom glutation (GSH) konjugering. Dessutom är GSTs regulatorer av mitogen-aktiverade proteinkinaser (MAPKs) som är involverade i apoptotiska vägar. Överuttryck av GSTs är korrelerad med minskad terapeutisk effekt bland patienter som genomgår kemoterapi med elektrofila alkylerande medel. Använda GST-hämmare kan vara en potentiell lösning för att vända denna tendens och öka behandlingen potens. Att uppnå detta mål kräver upptäckten av sådana föreningar, med en exakt, snabb, och lätt enzym assay. Ett spektrofotometriskt protokoll med hjälp av 1-kloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) som substrat är den mest använda metoden i litteraturen. Redan beskrivna GST-hämningsexperiment ger dock inte ett protokoll som beskriver varje steg av en optimal hämningsanalys, såsom mätning av Michaelis-Menten-konstanten (Km) för CDNB eller indikation på den anställda enzymkoncentrationen, avgörande parametrar för att bedöma hämningspotensen hos en testad förening. Därför, med detta protokoll, beskriver vi varje steg i en optimerad spektrofotometrisk GST enzym assay, att skärmen bibliotek av potentiella hämmare. Vi förklarar beräkningen av både halv-maximal hämmande koncentration (IC50) och konstanten av hämning (Ki)—två egenskaper som används för att mäta styrkan hos en enzymhämmare. Den metod som beskrivs kan implementeras med hjälp av en pool av GSTs extraheras från celler eller ren rekombinant mänskliga GSTs, nämligen GST alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) eller GST pi 1 (GSTP1). Detta protokoll kan dock inte tillämpas på GST theta 1 (GSTT1), eftersom CDNB inte är ett substrat för denna isoform. Denna metod användes för att testa inhibition potensen av curcumin med hjälp av GSTs från equine lever. Curcumin är en molekyl uppvisar anti-cancer egenskaper och visade affinitet mot GST isoforms efter i silico dockning förutsägelser. Vi visade att curcumin är en potent konkurrenskraftig GST-hämmare, med en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM och en Ki av 23,2 ± 3,2 μM. Curcumin har potential att kombineras med elektrofil kemoterapi medicinering för att förbättra dess effekt.
Introduction
Cytosolic glutation S-transferas enzymer (GSTs, EC 2.5.1.18) katalyserar konjugering av glutation (GSH) i olika elektrofila föreningar, såsom kemoterapeutiska medel, att avgifta och eliminera dem lätt från kroppen1. Sju isoformer av cytosolic GST har identifierats som alfa, mu, pi, sigma, omega, theta, och zeta. GSTs uttrycks främst i levern, testi, lungor, och mag-tarmkanalen2. GST alfa 1 (GSTA1) isoform uttrycks högt i hepatocyter. Kroppen uttrycker heterogent andra subtyper, inklusive GST pi 1 (GSTP1) främst i hjärnan, hjärtat och lungorna, och GST mu 1 (GSTM1) i levern och testiklar3. Även om det finns hög sekvenshomologi mellan GST isoforms, varje uppvisar substrat specificitet och är inblandad i läkemedelsmetabolism och cancer på olika sätt, enligt dess differentiella uttryck4,5.
Elektrofila föreningar antingen in i kroppen exogent eller produceras endogent. Bekämpningsmedel, prostaglandiner, cancerframkallande ämnen, och kemoterapeutiska läkemedel är några av de potentiella substrat för glutation konjugation reaktioner6. Till exempel, någon elektron-bristfällig reaktiv förening bildas inom en cell kommer sannolikt att bli en elektrofil substrat. Alkylerande medel såsom klorambucil eller melfalan elimineras som konjugat av GSH katalyseras av GSTs, och ökade nivåer av dessa enzymer har korrelerats med resistens mot dessaföreningar 6,7.
En annan viktig roll för cytosoliska GSTs är att reglera aktiviteten hos mitogen-aktiverade proteinkinaser (MAPK) som MAPK8 (även känd som c-Jun N-terminal kinase, eller JNK1) och MAP3K5 (även känd som apoptos signal-reglerande kinas 1, eller ASK1)8. Vissa isoformer i sin monomeriska konformation kommer att binda till dessa proteiner och därmed blockera fosforyleringskaskad. Under normala förhållanden kommer GSTP1 isoform sequester MAPK8 (aktivator av c-Jun protein). Att kombinera c-jun med c-Fos proteinet bildar transkriptionsfaktorn activatorprotein 1 (AP-1), som ansvarar för att transkribera pro-apoptotiska gener. I stressade celler, komplexet som bildas av GSTP1 och MAPK8 dissociates, c-Jun aktiveras, och de gener som leder till apoptos börjar uttryckas9. Större uttryck för denna GST isoform kan därför blockera vägen, vilket leder till ökad cell livskraft, mer cellulär spridning, och lägre cellulär känslighet för kemoterapi. Liknande scenarier kan uppstå med paraloger av GSTP1, till exempel GSTM1, som interagerar med MAP3K510.
De roller som spelas av GSTs i läkemedelsmetabolism och i kvarstad av MAPKs ledde till hypotesen att ett större uttryck för GSTs kan vara ett tecken på en tumoral resistensmekanism för kemoterapeutisk behandling6,11. Till exempel är GSTP1 overexpressed i många cancerformer och dess närvaro har korrelerats med en dålig prognos och en ökad förekomst av återfall8. Polymorfism i dessa gener har också visat differentiell läkemedelsexponering och överlevnad för patienter som presenterar olika sjukdomar, vilket förstärker tanken att dessa enzymer är avgörande för mekanismer för läkemedelsresistens. Till exempel, individer med GSTM1 null genotyp är associerade med lägre drog clearance och bättre överlevnad12,13. Det finns flera potentiella medel för att motverka detta överuttryck, såsom användning av GSH-analoger, prodrugs som aktiveras genom konjugering med GSTs, eller direkta GST-hämmare14,15.
Alla dessa metoder är för närvarande under utredning, och några föreningar har börjat kliniska prövningar för deras potentiella användning bland patienter. Men så långt vi vet finns det inga föreningar som används som GST-hämmare i kliniska inställningar15. En brist på specificitet för vissa isoformer eller utarmningen av GSH i normala celler, vilket kan leda till toxiciteter som orsakas av ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) i organsystem, är faktiskt bara några av de nackdelar som minskar potentialen hos GST-hämmare14,15. Risken att dessa föreningar kan utöva andra farmakodynamiska effekter på kroppen begränsar också deras användning. Ethacrynic syra, till exempel, är den mest studerade GST-hämmare i laboratoriemiljöer, men eftersom det främst används som en stark diuretikum, begränsar denna egenskap dess användning i kombination med andra läkemedel i kliniska miljöer. Curcumin är en annan naturlig förening framgångsrikt screenas som en GST-hämmare. Denna molekyl är en polyfenoleter som utvinns ur Curcuma longa-arten av gurkmeja. Det har visat lovande resultat som ett möjligt behandlingsalternativ mot cancer genom att inducera apoptos av olika slag av tumör cellinjer16,17. Föreningen kan reglera olika cellulära vägar, såsom tyrosin kinas18 eller GST väg. Studier med rena proteiner har visat dess hämningskontensitet på GSTA1, GSTM1 och GSTP119,20. Motstridiga resultat observerades dock i cancerceller, där större intracellulär GST-aktivitet mättes när celler behandlades med curcumin21. Således är det viktigt att undersöka halv-maximal hämmande koncentration (IC50) och konstanten av hämning (Ki) av någon förmodade GST-hämmare med hjälp av ett tydligt beskrivet protokoll med ordentliga kontroller innan du planerar några ytterligare cellulära experiment.
Screening och testning av potentiella nya GST-hämmare är därför av betydande kliniskt intresse, och alla nya föreningar som hittas måste vara säkra och effektiva för användning i kombination med elektrofila läkemedel. Att fokusera forskning på isoform-specifika hämmare kan möjliggöra GST-hämning i tumörvävnader som uppvisar specifika mönster av GST-uttryck, vilket möjliggör utveckling av en effektiv kombinationsbehandling. Att hitta hämmare med differentiella hämningssätt kan också vara av intresse. Till exempel, en konkurrenskraftig hämmare som använder GSH som ett substrat kan framkalla dess utarmning. Denna minskning av GSH-koncentrationen i celler visades inducera oxidativ stress i nervceller, vilket leder till apoptos. Ett annat vanligt läge för hämning—icke konkurrenskraftig hämning—kan inte reverseras även om substratet finns i höga koncentrationer.
Graden av enzymatisk aktivitet representeras av Michaelis-Menten-konstanten (Km) och den maximala hastigheten (Vmax), som kan bestämmas genom att rita en Michaelis-Menten-graf, med substratkoncentrationen mot hastigheten på reaktionen23. Km är koncentrationen av substrat som krävs för att uppta hälften av de enzymatiska aktiva platserna, vilket innebär att en hög Km representerar mindre affinitet. Vmax representerar reaktionens maximala hastighet, som nås när alla de aktiva platserna upptas av substratet. Km är lika med halv Vmax. Det finns tre vanligaste lägen av hämning: konkurrenskraftiga, konkurrenskraftiga, och icke-konkurrenskraftiga. Vid konkurrensinhibering binder hämmaren till enzymets aktiva plats och konkurrerar med substratet. Därav, Vmax ändras inte efter tillsats av hämmaren, men Km ökar, eftersom mer substrat behövs för att motverka hämningen. Icke konkurrenskraftig hämning sker endast när substratet bildar ett komplex med enzymet. I detta fall, eftersom nivån av hämning beror på substratet och enzymkoncentrationen, minskar Vmax och Km när inhibitorn tillsätts till reaktionen. Det sista läget av hämning är icke-konkurrenskraftiga och är en blandning av de två andra hämning mönster. Hämmaren kan binda till den aktiva platsen för enzymet om enzymet är bundet till sitt substrat eller inte. Här Vmax minskar efter tillsats av hämmaren, men Km inte ändrar24.
En spektrofotometrisk analys som mätte GST-aktiviteten utvecklades först av Habig et al. 1974 med hjälp av 1-kloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) som substrat för reaktionen22. Konjugering mellan GSH och CDNB bildar GS-DNB, som uppvisar en maximal ljusabsorbans vid våglängden på 340 nm, skivbar med en spektrofotometer. De flesta av tekniken förklaras nedan härleds från Habig et al., inklusive information om de bästa inställningarna och viktiga optimeringspunkter för en hämmande analys. Tekniken kan tillämpas på screening potentiella GST-hämmare, oavsett om de väljs av rationella läkemedelsval med hjälp av beräkningsprognoser eller genom litteraturöversikt. Hur man anpassar protokollet till nyligen syntetiserade GST proteiner eller specifika isoformer diskuteras också. Till exempel, testa hämmande potens av GST isoforms uppvisar en kliniskt relevant polymorfism eller av enda nukleotid polymorfiser (SNPs) kan vara potentiella användningsområden för detta protokoll, inriktning patient-specifika GSTs.
Detta protokoll ger en snabb, genomförbar och effektiv metod för screening av potentiella GST-hämmare in vitro innan några andra funktionella studier. De steg som behövs för att utvärdera de mest vanligen uppmätta egenskaperna hos en enzymatisk hämmare beskrivs: den hämmande koncentration 50 (IC50) som är koncentration av inhibitor som krävs för att minska den enzymatiska aktiviteten med hälften; och hämningens konstant (Ki) som representerar jämviktskonstanten av dissociationen mellan inhibitorn och enzymet, kännetecknande för samhörigheten mellan dessa två molekyler. Dessa två värden mäts genom icke-linjär regression och med hjälp av ekvationer specifika för varje läge av hämning, respektive. Vi visar också bedömningen av detta mönster av hämning, med hjälp av Michaelis-Menten tomter för att bestämma förändringen av Vmax och Km efter tillsats av hämmaren23,25,26.
Protocol
1. Beredning av GST-enzymlösningen
OBS: Förfarandet för att förbereda enzymlösningen beror på om enheterna för enzymatisk aktivitet är kända före analysen eller inte. En enzymatisk enhet är den mängd enzym som behövs för att syntetisera 1 μmol produkt per minut. Enzymatisk aktivitet representeras i enhet/mL eller μmol/min/mL och beror på utspädningen av den enzymatiska lösningen. Specifik enzymatisk aktivitet representeras i enhet/mg eller μmol/min/mg och beror enbart på lösningens renhet. Båda dessa egenskaper bestäms nedan. Om den enzymatiska enheten för en isolerad GST-isoform är okänd måste man uppskatta att justera de enzymatiska koncentrationerna för varje reaktion och ge reproducerbara resultat.
- Om den enzymatiska enheten för gst som används i analysen är känd:
- Bered en ny stamlösning av GST-enzymet vid 0,1 U/mL i vatten och fortsätt sedan med steg 2.
OBS: Denna lösning kan förvaras vid -20 °C i alikvoter i flera månader eller vid -80 °C under längre perioder, men frys-/töcykeln måste undvikas.
- Bered en ny stamlösning av GST-enzymet vid 0,1 U/mL i vatten och fortsätt sedan med steg 2.
- Om den enzymatiska enheten för den GST som används i analysen är okänd:
- Kvantifiera enzymlösningens proteinkoncentration med hjälp av en proteinanalys av bicinchoninin (BCA), eller något annat kit.
- Späd proteinlösningen till en slutlig proteinkoncentration på 0,02 mg/mL.
- Tillsätt 20 μL av enzymlösningen, 20 μL av GSH 25 mM (molekylvikt: 307,32 g/mol), och 150 μL av Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till en 96-brunnsplatta. För blindprovet, tillsätt 20 μL vatten istället för enzymlösningen.
- Tillsätt 10 μL cdnb 50 mM (molekylvikt: 202,55 g/mol) substrat till varje brunn.
- På en spektrofotometrisk mikroplattläsare ställer du in parametrarna för att läsa brunnarna vid 340 nm. Det rekommenderas att mäta absorbansen varje minut i 10 minuter.
- Sätt in plattan i mikroplattläsaren, och starta avläsningen enligt inställningarna i steg 1.2.5.
- Beräkna förändringen av absorbans per minut för de enzymatiska proverna och blindproven.
OBS: Kontrollera att reaktionen är linjär genom att rita in absorbans på y-axel och minuter på x-axeln. Om reaktionen inte är linjär och når en platå, betyder det att allt underlaget används och reaktionen är för snabb. Minska således mängden enzym som tillsätts i brunnen genom att späda stamlösningen med två. - Blank-korrigera testprovens absorbansavläsningar.
- Med ekvation 1, som representerar Beer–Lambert-lagen, beräknar man koncentrationen av GS-DNB som bildas (i μM) genom reaktionen varje minut.
Ekvation 1:
där C är underlagets koncentration i μM, A340/min är förändringen i absorbans per minut, mätt i steg 1.2.7, ε är den molariska utdöendet koefficienten för CDNB konjugat vid 340 nm (0,0096 μM-1*cm-1), och l är längden på ljusbanan i brunnen (i cm). För en 96-brunnsplatta fylld med 200 μL enzymatisk lösning är banlängden runt 0,55 cm. Detta värde kan variera beroende på plattan modell och bör verifieras med tillverkaren. - För att bestämma mängden produkt som finns i en brunn i μmol/min multiplicerar du de resultat som hittades med hjälp av ekvation 1 med volymen av lösningen, 2 x 10-4 L.
- Normalisera aktiviteten per mängd protein som används genom att dela resultaten av steg 1.2.9 med 4 x 10-4 mg. Resultatet är den specifika enzymatiska aktiviteten i enhet/mg eller μmol/min/mg.
OBS: Om utspädningen ändrats i steg 1.2.6, på grund av en icke-linjär reaktion, justera proteinmängden därefter. - För att hitta den enzymatiska aktiviteten, justera resultaten till proteinkoncentrationen i mg/mL genom att multiplicera den specifika enzymatiska aktivitet som finns i steg 1.2.10 med 0,002 mg/mL. Detta kommer att ge den enzymatiska aktiviteten i enhet/mL eller μmol/min/mL.
OBS: I motsats till den enzymatiska aktiviteten kommer denna åtgärd inte att ändras beroende på proteinlösningens utspädning. Samma anmärkning som steg 1.2.10 men för proteinkoncentrationen. - Bered en stamlösning av GST-enzymet vid 0,1 enhet/mL i vatten och fortsätt sedan med steg 2.
OBS: Denna lösning kan förvaras vid -20 °C i alikvoter i flera månader eller vid -80 °C under längre perioder, men frys-/töcykeln måste undvikas. Kontroll av den enzymatiska aktiviteten rekommenderas om experimenten utförs under en längre tid eftersom nedbrytning av proteinlösningen kan uppstå.
2. Mätning av Michaelis–Menten-konstanten av GST-isoformen för CDNB
OBS: Förfarandet förklaras för ett CDNB substrat men kan appliceras på något annat substrat, såsom GSH. Varje koncentration av CDNB behöver sitt eget blankt, eftersom absorbansen vid 340 nm kommer att öka enligt CDNB-koncentrationen.
- Förbered sex olika koncentrationer av CDNB, från 10 mM till 100 mM, i etanol 95% (v/v).
- Bered analyslösningen, med 10 μL CDNB, 20 μL GST-enzym, 20 μL av GSH 25 mM och 150 μL DPBS. För blindprovet, i stället för CDNB-lösningen, tillsätts endast 10 μL etanol 95%.
- Bered ett blankt för varje CDNB-koncentration, med 10 μL CDNB, 20 μL vatten, 20 μL av GSH 25 mM och 150 μL DPBS.
- Spela in absorbansen vid 340 nm varje minut i 10 minuter med en mikroplattläsare.
- Blank-korrigera absorbansen genom att subtrahera resultaten från blindprovet från det för de korrekta andra testväldarna. Beräkna hastigheten på reaktionen enligt de uppmätta värdena med hjälp av ekvation 2.
Ekvation 2:
där A340/min är den experimentellt bestämda förändringen av absorbans per minut, Vtotalt (total volym) är lika med 0,2 mL,V-enzym (enzymvolym) är 0,02 mL, och εGS-DNB är GS-DNB-konjugatens molar-konjugat vid 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). I en 200 μL brunn av en 96-brunnsplatta är banlängden 0,55 cm (beroende på plåttyp) och extinktionskoefficienten motsvarar 5,3 mM-1. Hastigheten kan representeras antingen av μmol/mL/min eller mM/min. - Rita in Michaelis–Menten-grafen med hastigheten (på y-axeln) mot substratkoncentrationen (på x-axeln).
- Definiera maximal hastighet (Vmax) för reaktionen och Michaelis–Menten-konstanten (Km) (dvs. substratkoncentrationen vid hälften av Vmax).
OBS: Med hjälp av programvara som GraphPad Prism kan enzymkinetikkurvan monteras med hjälp av en icke-linjär regression för beräkning av parametrarna Michaelis–Menten enzymet kinetik, såsom Vmax och Km. - Bered en CDNB-stamlösning vid 20 gånger den beräknadeK-m i etanol 95% (v/v).
3. Absorbans av den potentiella GST-hämmaren
OBS: Detta steg utförs för att undersöka om den potentiella GST-hämmaren som används i reaktionen ger en metabolit som ökar absorbansen vid den våglängd som mäts. Om den gör det kommer den använda inhibitorn att ha en inverkan på resultaten och ett specifikt blankprov bör förberedas för varje koncentration.
- Späd hämmaren till de koncentrationer som krävs.
OBS: Förbered tre olika utspädningar, helst de lägsta, mellersta, och högsta koncentrationerna som testades under hämningsanalysen. Den maximala DMSO-koncentrationen i brunnen bör vara lika med eller mindre än 1 % (v/v). Vi testade DMSO-koncentrationens effekt på analysen i vårt laboratorium, och 1% ändrade inte gst-aktiviteten i någon större grad. - I en 96-brunnsplatta, tillsätt 2 μL av den potentiella GST-hämmaren, 20 μL av GSH 25 mM och 168 μL DPBS. Använd en lämplig kontroll, utan hämmare, genom att lägga till lika stora volymer av det lösningsmedel som används för inhibitorproverna.
- Inkubera reaktionen i 10 minuter, för att påbörja den enzymatiska reaktionen.
OBS: Detta steg kan optimeras, genom att testa olika inkubationstider, med de dubbla syftena att påbörja reaktionen samtidigt som man undviker total utarmning av substratet. - Tillsätt 10 μL CDNB till varje brunn för att uppnå en slutlig koncentration vid Km som finns i steg 2.
- Skaka plattan i några sekunder.
- Spela in absorbansen vid 340 nm varje minut i 10 minuter med en mikroplattläsare.
- Beräkna förändringen av absorbans per minut.
- Verifiera förändringen av absorbans jämfört med både den tomma reaktionen och den negativa kontrollreaktionen utan inhibitor.
- Om det finns en betydande förändring, använd blank för varje hämmare koncentration för att justera resultaten.
OBS: Detta resultat indikerar att reaktionens beståndsdelar, utan GST-enzym, reagerar spontant och producerar en metabolit som ökar absorbansen vid 340 nm. För att korrigera för denna extra absorbans bör ett specifikt blankt mätas för varje koncentration. - Om det inte sker någon signifikant förändring av absorbansen, använd ett allmänt blankt, som endast innehåller det lösningsmedel som används för GST-hämmarens utspädning, för alla koncentrationerna.
- Om det finns en betydande förändring, använd blank för varje hämmare koncentration för att justera resultaten.
4. Hämningsanalys av GST och IC50 bedömning
- Förbered nio koncentrationer av den potentiella GST-hämmaren.
OBS: Halterna kan anpassas efter resultaten. Syftet är att definiera botten- och toppplatåerna i den icke-linjära regressionskurvan. Se diskussionsavsnittet för mer detaljer om det här steget. - Bered analyslösningen genom att späda 20 μL av GSH-lösningen vid 25 mM med 148 μL DPBS. Anpassa volymen efter antalet brunnar som används i analysen.
- I en klar 96-brunnsplatta, förbered den enzymatiska reaktionen i en slutvolym på 190 μL. Det rekommenderas att använda en flerkanalig pipett för dessa steg.
- För test brunnarna, tillsätt 20 μL av enzymlösningen, 2 μL av den potentiella GST-hämmarlösningen och 168 μL av analyslösningen.
- För kontrollen, tillsätt 20 μL av enzymlösningen, 2 μL av spädningsvätskan som används för GST-hämmaren och 168 μL av analyslösningen.
- För blankprovsuttäserna tillsätts 20 μL vatten, 2 μL av den potentiella GST-hämmaren och 168 μL av analyslösningen.
OBS: Om GST-hämmaren absorberar 340 nm våglängd, sedan ett specifikt blankprov bör förberedas för varje koncentration testas.
- Tillsätt 10 μL av CDNB-lösningen vid 20x Km till varje brunn, inklusive blindprovet. Det rekommenderas att använda en flerkanalig pipett för detta steg.
- Skaka plattan i några sekunder.
- Mät absorbansen vid 340 nm varje minut i 10 minuter med hjälp av en mikroplattläsare.
- Blank-korrigera absorbansen genom att subtrahera resultaten från test brunnstommen.
- Normalisera resultaten genom att dividera de värden som erhålls med hjälp av GST-inhibitorlösningen med kontrollens absorbans per minut utan inhibitor.
- Plotta de icke-linjära regressionsgraferna av den logaritmiska koncentrationen (x-axeln) av inhibitorn mot GST-aktiviteten (y-axeln), och bestäm därmed IC50.
OBS: GraphPad Prism beräknar IC50 från de icke-linjära regressionsområdena genom att förutsäga den koncentration som kommer att visa 50% av den enzymatiska aktiviteten i kontrollen. Förutsägelsen är baserad på botten och topp platåer, liksom kurvan för lutningen som bildas av sigmoid grafen.
5. Bedömning av Ki ochtypen av hämning
- Förbered fyra olika CDNB-koncentrationer: tre högre och en lika med Km som tidigare hittats.
- Förbered tre olika GST-hämmare koncentrationer, lika med eller under de tidigare funna IC50.
- Utför hämningsanalysen enligt beskrivningen i steg 4.2 till 4.7.
- Beräkna reaktionernas hastighet med hjälp av ekvation 2.
- Rita in Michaelis–Menten-graferna för varje inhibitorkoncentration och beräkna Vmax och Km av varje reaktion.
- Enligt förändringarna i Vmax och Km vid användning av olika koncentrationer, bedöm GST-hämmarens sätt att hämma.
OBS: Detta steg förklaras mer ingående i resultat- och diskussionsavsnitten. - Baserat på hämningssättet beräknar du Ki.
OBS: I GraphPad Prism kommer olika ekvationer att användas för att beräkna Ki enligt hämningens natur. De ekvationer som används baseras på den observerade Km och Vmax efter tillsats av inhibitorn och jämfört med kontrollens Km och Vmax.
Representative Results
Michaelis-Menten konstant (Km) av CDNB med GST från hästlever
Curcumin är en säker naturlig förening även efter intag vid högre doser27 som visade anticancer egenskaper16. Den hämmande potensen hos denna molekyl har påvisats på human rekombinanta GSTs19,20. Genom att använda det beskrivna protokollet utvärderade vi curcumins effekt på GST-aktivitet med hjälp av en pool av GST-isoformer från hästlever. Enligt leverantören är den specifika aktiviteten av denna blandning av proteiner 25 U/mg. En stamlösning på 0,1 U/mL framställdes genom upplösning av det lyofilaterade pulvret i lämplig mängd vatten. Ethacrynic syra användes parallellt som en positiv kontroll eftersom denna förening är den mest använda GST-hämmaren i studier. Steg i inrättandet av en GST aktivitetsanalys och testning av hämmare beskrivs i figur 1.
Km måste definieras för varje enzymsubstratreaktion eftersom användning av substratkoncentrationen motsvarande Km skulle säkerställa någon bias när det gäller bestämning av hämningssätt28. Sex olika koncentrationer av CDNB, som sträcker sig från 0,5 mM till 5 mM, testades för att mäta denna parameter, med hjälp av en fast koncentration på 2,5 mM GSH.
Reaktionens slutliga volym var 200 μL, i en 96-brunnsplatta. Ett specifikt blankt användes för varje experiment, med samma koncentration av CDNB som testet väl eftersom spontan konjugering av CDNB och GSH kunde uppstå och kan öka absorbansen. En slutlig enzymkoncentration på 0,01 enhet/mL användes för alla reaktioner, genom att 20 μL av stamlösningen tillstärsmixen lades till. Absorbans vid 340 nm spelades in varje minut i 10 minuter. Hastigheten (i mM/min) för reaktionen beräknades med hjälp av ekvation 2. En Michaelis–Menten-graf ritades av substratkoncentrationen (mM) mot hastigheten (μM/min) (Figur 2), och Km av reaktionen beräknades. Experimentet upprepades tills minst tre uppsättningar data visade liknande resultat. Km av CDNB med GST från hästlever mättes som 0,26 ± 0,08 mM. En koncentration på 0,2 mM CDNB användes för varje hämmande analys med hjälp av denna sats av GSTs.
Ingen spontan bildning av en metabolit som absorberas vid 340 nm mättes under experiment med hjälp av curcumin inkuberas ensam med GSH och CDNB. Samma tomrum användes för varje hämmare koncentration i varje experiment.
Curcumins hämmande potens på GSTs
Curcumin s hämmande potens förutspåddes med hjälp av en in silico dockning simulering med programvara (t.ex., AutoDock Vina version 1.1.2). 29 Den fria bindande energin mellan olika GST-isoformer (nämligen GSTA1, GSTM1 och GSTP1) och curcumin förutsades (data visades inte). Sedan, den konstant av hämning Ki beräknades med hjälp av Ekvation 3.
Ekvation 3:
där ∆G är den fria bindande energi som finns med hjälp av in silico-analysen, R är gaskonstanten på 1,987 cal*K-1*mol-1, och T är temperaturen under försöket, i detta fall i Kelvin (298 K).
Baserat på de fria bindande energiresultat som returnerades av AutoDock Vina, är curcumin en potent GST-hämmare av human GSTA1, GSTM1 och GSTP1, med Ki-värden på 78,1 μM, 78,1 μM respektive 27,4 μM. De första inhibitoriska analyserna genomfördes med hjälp av dessa beräkningsmässiga Ki uppskattningar, och koncentrationerna justerades enligt resultaten, om det behövs.
Först uppskattades IC50. Denna egenskap är koncentrationen av inhibitor som minskar ett enzym reaktionshastighet med 50%. Det är därför beroende av enzymkoncentrationen30. Nio slutliga koncentrationer av inhibitorn utarbetades, från 0,39 μM till 100 μM med varje koncentration som var dubbelt så stor som den föregående. Analysen lösningen var sammansatt av 20 μL av GSH 2.5 mM, 20 μL av GST från equine lever vid 0.01 U/mL slutlig, 2 μL av curcumin lösningen, och 148 μL av PBS. Kontrollen var sammansatt av samma lösning med spädningsvätskan som används för curcumin. Denna blandning inkuberades i 15 minuter för att påbörja enzymanalysen och för att undvika nedbrytning av curcumin i analyslösningen, eftersom denna förening är instabil i buffertlösningar31. Därefter tillsattes 10 μL CDNB-lösning vid 4 mM till varje brunn, för en slutkoncentration på 0,2 mM CDNB. Absorbans vid 340 nm registrerades varje minut i 10 minuter, för att beräkna förändringar i absorbans per minut. För att beräkna IC50 normaliserades varje prov som inkuberades med curcumin till kontrollen, för att ge procentandelen aktivitet. Dessa resultat analyserades med hjälp av plottningsprogramvaran genom att beräkna icke-linjär regression av den logaritmiska koncentrationen av inhibitorn kontra hämningen. IC50 som hittades för curcumin på GST från hästlever var 31,6 ± 3,6 μM (Figur 3A).
Samma experiment utfördes parallellt med att man använde ethacrynic acid som en positiv kontroll, med koncentrationer från 0,39 till 100 μM, som med curcumin. IC50 befanns vara 6,6 ± 1,1 μM (Figur 3B).
Nästa steg var att bedöma curcumins sätt att hämning på dessa transferaser. Fyra olika koncentrationer av curcumin testades: 0, 7,5, 15 och 30 μM, tillsammans med fyra olika koncentrationer av CDNB: 0,2, 0,4, 1 och 1,5 mM. Protokollet var samma som för det tidigare experimentet. Varje villkors hastighet beräknades med hjälp av ekvation 2. En kurva ritades för varje hämmarekoncentration, med hastigheten (i μM/min) mot substratkoncentrationen (mM) (Figur 3C). Vmax och Km bestämdes baserat på varje tomt med GraphPad Prism. Den potentiella inhibitorns hämningssätt bedömdes enligt förändringarna i dessa två parametrar och analysernas olika tillstånd. 24 Eftersom Vmax inte väsentligt ändrades mellan förhållandena men Km ökade med de olika inhibitorkoncentrationerna, är curcumins hämning av de allmänna testerna konkurrenskraftig. Detta mönster av hämning uppstår när hämmaren konkurrerar med substratet för den aktiva platsen för enzymet. För att mäta K i av en konkurrenskraftig hämmare, använder GraphPad Ekvation 4 och ekvation 5 som beskrivsav Copeland et al.32.
Ekvation 4:
Ekvation 5:
där Km obs är den observerade Michaelis–Menten-konstanten, Km är Michaelis–Menten-konstanten av kontrollen, [I] är inhibitorkoncentrationen, K iär hämningens konstant, Y är hastigheten, och X är substratkoncentrationen.
Beräkningarna bygger på samma experiment som bedömningen av hämningssättet. Ki uppskattade för curcumins hämning av GST från hästlever var 23,2 ± 3,2 μM.
Bild 1: Flödesschema som beskriver stegen i GST-enzymatiska och hämningsanalyser. Detaljer om förfarandet presenteras i protokollsektionen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Michaelis-Menten tomt av GST enzym aktivitet. Ökad koncentration av substraten CDNB användes med en fast koncentration av GSH (2,5 mM) för att bestämma GST-aktiviteten från en pool av GST från hästlever. Km värde för CDNB bestämdes som 0,26 ± 0,08 mM enligt kurvan i grafen. Varje datapunkt på tomten representerar medelvärdet av fyra olika experimentella körningar med SD. Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av curcumin och ethacrynic syra på GST enzymaktivitet. (A-B) Tillsats av ökande koncentrationer av antingen curcumin (A) eller den positiva kontrollen ethacrynic acid (B), samtidigt som samma GST (0,01 U/mL), GSH (2,5 mM) och CDNB (0,2 mM) slutliga koncentrationer för att beräkna IC50 av båda föreningarna för GST från hästlever med en icke-linjär regression. IC50 fastställdes som 31,6 ± 3,6 μM för curcumin och 6,6 ± 1,1 μM för ethacrynic syra. (C) Michaelis–Menten tomt av olika koncentrationer av curcumin, testas mot varierande koncentrationer av CDNB substrat som anger ett konkurrenskraftigt läge av hämning. Med ingen inhibitor mättes Vmax och Km som 132,7 ± 4,6 μM respektive 0,5 ± 0,08 μM. Med 30 μM curcumin var Vmax och Km 130,4 ± 13,1 μM och 1,08 ± 0,39 μM. Datapunkter i alla grafer (A-C) representerar hjälpmedlet för tre olika experimentella körningar med SD. Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Vi tillhandahåller ett protokoll som beskriver varje steg av en spektrofotometrisk GST enzym assay, att skärmen förmodade hämmare (Figur 1, Tabell 1) och kvantifiera deras hämmande potens. Vi betonade också de mest avgörande kriterierna att överväga för korrekt enzym analyser ger reproducerbara resultat. Stora fördelar med det beskrivna protokollet jämfört med andra kolorimemetriska metoder eller masspektrometri är att detta protokoll är snabbt och enkelt att utföra och ge kvantitativa mätningar av GST-aktiviteten samt hämningspotensen hos skärmade molekyler.
Vi presenterar sättet att beräkna de två viktigaste Michaelis–Menten parametrarna för en enzymhämmare: IC50 och Ki. En potent hämmare kommer att utöva lägsta möjliga Ki och IC50, vilket indikerar att affiniteten mellan hämmaren och enzymet är hög30. Eftersom IC50 är beroende av enzymkoncentrationen och assay-tillstånden33, kan det vara svårt att använda detta värde för att jämföra inhibitorer från olika experiment eller erhålls med hjälp av andra analysförhållanden34. Använda konstanten av hämning Ki är en bättre indikator på den hämmande potensen av potentiella föreningar. Ki kan användas för att jämföra två hämmare med olika lägen för hämning, eftersom den enbart bygger på samhörigheten mellan hämmaren och enzymet. Men att ha en klar uppfattning om vilken typ av hämning man måste bestämma båda av inhibitorns parametrar30. Vi mätte curcumins IC50 och Ki som 31,6 ± 3,6 μM och 23,2 ± 3,2 μM, respektive, vilket indikerar att denna förening är en potent GST-hämmare. Dessa resultat bekräftade in silico förutsägelser, som uppskattade Ki värden mellan 27,4 till 78,1 μM för olika mänskliga GST isoformer och curcumin.
Enzymatisk aktivitet eller reaktionshastighet och enzymmängd
Som anges ovan, IC50 är beroende av enzymkoncentrationen, och genomföra ett experiment med en okänd nivå av enzymatisk aktivitet kan leda till falska slutsatser33. För att kontrollera för andra faktorer, vilket kan minska hämmande aktivitet, bör man överväga och mäta enzymatisk aktivitet för varje ny sats av GST. Till exempel kan nedbrytning av en enzymatisk sats, orsakad av för många frys-/töcykler, minska aktiviteten och därmed leda till en lägre IC50 även om experimentet körts under samma förhållanden. Med andra ord, med hjälp av 0,01 enheter av enzym kommer inte att ge samma resultat som att använda 1 enhet. Att använda för många enzymer kan leda till en snabb utarmning av substratet och reaktionen kommer inte att ha en linjär form. Denna parameter skulle således kunna leda till ett inexakt resultat, eftersom ingen förändring av absorbansen skulle ses efter en lång inkubationstid.
Km Värde
För att säkerställa de bästa förutsättningarna för att bedöma vilken typ av hämning som uppvisas av en inhibitor måste substratkoncentrationen vara lika med eller under Michaelis–Menten-konstanten (Km). Km representeras av koncentrationen av substrat som krävs för att uppta hälften av de aktiva platserna på enzymet28. Till exempel, högre substratkoncentration kan motverka en konkurrenskraftig hämmare och bedöma denna typ av hämning kommer att bli svårt i en sådan inställning. Således är ett av de avgörande stegen i denna metodik bestämningen av enzymets Km för det valda substratet (här CDNB). I vissa studier var detta värde inte bestämt och detta kan leda till falska slutsatser om mönstret av hämning orsakas av inhibitorn, och, om läget förhämning är felaktig, K i kommer att beräknas felaktigt som ekvationen bygger på mönstret av hämning26,28. Om en annan GST-isoform testas är en ny bedömning av Km-värdet obligatorisk, eftersom detta värde är unikt för ett par enzym och ligand. Som vi använde en koncentration av CDNB något lägre än Km (0,2 mM), som vi definierade som 0,26 ± 0,08 mM, var den förutsagda konkurrenskraftiga läge av hämning av curcumin på GST exakt bestämd.
IC50
Att få en bra sigmoidal kurva som att uppskatta IC50 kräver att hitta både botten och topp platåer. Bottenplatån representerar koncentrationerna av en inhibitor som ger den maximala hämmande aktiviteten. I vissa fall, en förening kanske inte hämmar enzymet helt, även vid höga koncentrationer, på grund av sådana tekniska frågor som löslighet. Men, verktyg som GraphPad Prism kan passa botten platån ganska exakt. Den översta platån består av koncentrationer av hämmaren, som är otillräckliga för att hämma enzymet, och därför är aktiviteten maximal. Båda dessa platåer är avgörande för att bestämma IC50 samt koncentrationer däremellan, för att hitta lutningen på kurvan-då IC50 kan härledas från formen av sigmoid kurvan35. Curcumin är dåligt löslig i vatten, således den maximala koncentrationen som används i denna analys är begränsad, för att undvika nederbörd i analysen lösning. Således användes mindre koncentrerade lösningar, som inte hämmar fullt ut GST-aktiviteten. Detta väckte frågor för fastställandet av botten platån. För att motverka detta problem förutspådde vi bottenvärden baserat på icke-linjär regressionsgrafen, som gav en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM för curcumin (Figur 3A). För etanakrynsyra fanns det inget behov av att förutsäga värdena för bottenplatån eftersom denna förening är löslig i analyslösningen och IC50 mättes till 6,6 ± 1,1 μM.
Denna metod kan tillämpas på de mest uttryckta GST-isoformerna i mänskliga, nämligen GSTA1, GSTM1 eller GSTP1. Detta protokoll är dock inte lämpa sig för att kvantifiera aktiviteten hos GSTT1-isoformen, eftersom CDNB inte är ett substrat för denna subtyp. 36, 37 Under tiden kan protokollet ändras något för att motverka denna fråga. Till exempel , med 1,2-epoxy-3-(4'-nitrophenoxy)propan (ENPP) som ett substrat för GSTT1 och mäta mängden konjugat på 360nm i stället för 340nm. 37
Steg av protokoll kan vara anpassade och tillämpas för att testa GST aktivitet och inhibitor testning i cellkultur experiment. Mätning av GST-aktiviteten på celler som behandlas med och utan GST-hämmare kommer att indikera om denna förening kan användas i sådan experimentell miljö. Det är särskilt intressant när hämmaren är lipofila. Till exempel presenterade vi att curcumin är en potent GST-hämmare med hjälp av detta protokoll. Ändå, dess tillämpning på cellulära studier kan vara begränsad, eftersom molekylen är dåligt löslig i vatten och bryts ned snabbt i medium. 31 En annan förbättring av detta protokoll är möjlig beträffande substrat CDNB:s icke-isoforms specificitet. Med hjälp av detta protokoll i cellstudier kommer bara att ge information om den övergripande GST-aktiviteten, men inte om aktiviteten hos exakt GST-subtyp. Att tillsätta isoformspecifikt substrat och/eller använda specifik rekombinant GST-isoform gör det att det blir tillstånd att testa isoformspecifika GST-hämmare.
Avslutningsvis beskriver vi ett komplett förfarande för att testa GST-hämmare som har potential att användas i kombination med elektrofil kemoterapi. Vi betonade de avgörande stegen i en GST enzym och hämning analys, att testa potentiella intressant molekyl och bestämma deras effektivitet som hämmare med kvantitativa värden, IC50 och Ki. Denna metod kan tillämpas på någon förmodade förening och utföras på de mest uttryckta mänskliga GST-isoformerna (GSTA1, GSTM1 och GSTP1), eller något anpassad för att utföra cellodlingsstudier med GST-hämmare eller mäta aktiviteten hos andra intressanta GST-isoform val.
| Reagenser | Namn | Koncentration i analyslösningen | Andra |
| Substrat | CDNB | Uppmätt Km (mM) | Utspädd i 95% etanol. Den slutliga etanolkoncentrationen ska ≤ 5 % (v/v) |
| Konjugera substrat | Gsh | 2,5 mM | Utspätt i vatten. |
| Koncentrationen måste mätta lösningen. | |||
| Buffert | Pbs | - | pH = 7,1 |
| Enzym | Pool av GST isoformer eller ren isoform | 0,01 enhet/mL, bestämd experimentellt. | Utspätt i vatten. |
| GST-hämmare | Potentiell förening av val | IC50: 3 koncentrationer som maximalt hämmar, 3 som minimalt hämmar, och 3 däremellan. | Utspädd i DMSO och sedan i vatten, att ha en slutlig koncentration av DMSO ≤ 1% (v / v) |
| Ki: 3 koncentrationer runt IC50. | |||
| Parametrar | |||
| Rumstemperatur (25°C) | |||
| pH = 7,1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| Etanol ≤ 5% (v/v) | |||
Tabell 1: Sammanfattning av de reagenser och parametrar som ska övervägas under en GST-inhibitionsanalys.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta forskningsarbete stöddes av STIFTELSEN CANSEARCH. Författarna vill erkänna Ms Laurence Lesne och Mr Yoann Sarmiento för tekniskt stöd, särskilt i genomförandet av replikera experiment samtidigt standardisera analyser med hämmare. Fruktbara diskussioner och ingångar av Mr Denis Marino, Dr Simona Mlakar och Dr Vid Mlakar är mycket erkända. Vi tackar Dr.Patricia Huezo-Diaz Curtis för hennes hjälp med berättandet av videon. Vi tackar Dr Muthukumar för hans insatsvaror på i silico förutsägelser. Vi tackar också Mr Darren Hart för hans hjälp i engelska språket bevisläsning av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
References
- Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
- Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S.
- Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
- Beckett, G. J., Hayes, J. D.
- Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
- Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
- Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
- Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
- Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
- Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R.
- Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
- Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
- Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
- Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
- Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
- Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
- Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
- Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
- Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
- Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
- Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
- Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
- Ochs, R. S.
- Bisswanger, H.
- Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
- Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
- Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
- Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
- Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
- Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
- Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
- Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
- Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
- Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).
