In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.
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Articolo metodologico
Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica
In questo articolo
Sommario
Abstract
I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un'importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l'esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.
Introduzione
Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all'inibizione transitoria della crescita1. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby2, ma il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina3.
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Protocollo
1. Preparazione del mezzo di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte di cellule E. coli
- Mezzo regolare Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.
- Piastre di agar LB: Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua DI e sterilizzare il mezzo mediante autoclave. Alla temperatura desiderata (~55 °C), versare ~30 mL di mezzo agar in piastre quadrate (10 x 10 cm). Asciugare i piatti e conservare a 4 °C.
- Mezzo LB m....
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Risultati
La figura 1 descrive il nostro protocollo sperimentale. Gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo n. 2) sono stati adattati da uno studio condotto da Keren etal. La figura 2A è un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate in mezzo LB modificato con osmoliti.......
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Discussione
Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fase d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri di Orman Lab per i loro preziosi contributi durante questo studio. Questo studio è stato finanziato dal nih/NIAID K22AI125468 career transition award e da una borsa di studio per le startup dell'Università di Houston.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| provetta da 14 ml | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Ceppo di E. coli MG1655 | Università | Ottenuto dal laboratorio Brynildsen | |
| Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Membrana sigillante permeabile ai gas | VWR | 102097-058 | Sterilizzato mediante irradiazione gamma e privo di citotossine |
| Mezza area piastra a fondo piatto a 96 pozzetti | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Grado di genetica molecolare |
| Sale di ofloxacina | VWR | 103466-232 | HPLC ≥ 97.5 |
| Microarray fenotipico (PM-9 e PM-10) | Biolog | N/A | Le piastre PM-9 e PM-10 contenevano rispettivamente vari osmoliti e tamponi |
| Piastra a fondo tondo a 96 pozzetti | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | S271-500 | Certificato ACS |
| Nitrato di sodio | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS |
| Nitrito di sodio | Fisher Scientific | AAA186680B | Purezza del 98% |
| Piastra di Petri quadrata | Fisher | Scientific FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Lettore |
| di micropiastre multimodale Varioskan lux | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Utilizzato per la misurazione della densità ottica a 600 nm |
| Estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422-100 | Grado di genetica molecolare |
Riferimenti
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281....
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Ristampe e permessi
