Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Screening af kemiske forbindelser med høj gennemstrømning for at belyse deres virkninger på bakteriel persistens

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61597
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Summary

I denne metode papir, præsenterer vi en høj-gennemløb screening strategi for at identificere kemiske forbindelser, såsom osmolytter, der har en betydelig indvirkning på bakteriel persistens.

Abstract

Bakterie persisters er defineret som en lille delpopulation af fænotypiske varianter med evnen til at tolerere høje koncentrationer af antibiotika. De er et vigtigt sundhedsproblem, da de har været forbundet med tilbagevendende kroniske infektioner. Selv om man ved, at stokastiske og deterministiske dynamikker i stressrelaterede mekanismer spiller en væsentlig rolle i persistensen, forstås de mekanismer, der ligger til grund for det fænotypiske skift til/fra persistenstilstanden, ikke fuldstændigt. Mens vedvarende faktorer udløst af miljøsignaler (f.eks. udtømning af kulstof-, nitrogen- og iltkilder) er blevet grundigt undersøgt, er osmolytternes indvirkning på persistens endnu ikke fastlagt. Ved hjælp af mikroarrays (dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige kemikalier), har vi designet en tilgang til at belyse virkningerne af forskellige osmolytter på Escherichia coli persistens på en høj gennemløbsmåde. Denne tilgang er transformativ, da den let kan tilpasses til andre screening arrays, såsom lægemiddelpaneler og gen knockout biblioteker.

Introduction

Bakteriekulturer indeholder en lille delpopulation af persister celler, der er midlertidigt tolerante over for usædvanligt høje niveauer af antibiotika. Persister celler er genetisk identiske med deres antibiotika-følsomme kins, og deres overlevelse er blevet tilskrevet forbigående vækst hæmning1. Persister celler blev først opdaget af Gladys Hobby2, men udtrykket blev først brugt af Joseph Bigger, da han identificerede dem i penicillin-behandlede Staphylococcus pyogenes kulturer3. En skelsættende undersøgelse offentliggjort af Balaban et al.4 opdagede to vedholdende typer: type I-varianter, der primært dannes ved passage gennem den stationære fase, og type II-varianter, der kontinuerligt genereres under eksponentiel vækst. Persisters opdages ved clonogenic overlevelsesanalyser, hvor kulturprøver tages med forskellige intervaller under antibiotikabehandlinger, vaskes og belægges på et typisk vækstmedium for at tælle de overlevende celler, der kan kolonisere i mangel af antibiotika. Eksistensen af persisters i en cellekultur vurderes af en bifasisk kill curve4,5 hvor det oprindelige eksponentielle henfald indikerer antibiotikafølsomme cellers død. Men drabstendensen falder over tid, hvilket i sidste ende fører til et plateauområde, der repræsenterer de overlevende vedholdende celler.

Persisterceller har været forbundet med forskellige sygdomme som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinvejsinfektioner9. Næsten alle mikroorganismer, der hidtil er blevet testet, viste sig at generere persister fænotyper, herunder højpatogen Mycobacterium tuberkulose6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nylige undersøgelser viser også , at der er fremgangen af multiresistente mutanter fra vedvarende delpopulationer11,12. En betydelig indsats på dette område har vist, at vedholdenhedsmekanismerne er meget komplekse og forskelligartede; både stokastiske og deterministiske faktorer i forbindelse med SOS-respons13,14, reaktive iltarter (ROS)15, toksin-/antitoksinsystemer (TA)16, autofagi eller selvfordøjelse17 og ppGpp-relateret stringentrespons 18 er kendt for at lette persisterdannelsen.

På trods af betydelige fremskridt med at forstå persistens fænotypen er virkningerne af osmolytter på bakteriel persistens ikke blevet fuldt forstået. Da opretholdelsen af optimalt osmotisk tryk er en nødvendighed for cellernes vækst, funktion og overlevelse, kan en dybdegående undersøgelse af osmolytter føre til potentielle mål for anti-persister strategier. Selv om besværlige, høj-gennemstrømning screening er en meget effektiv tilgang til at identificere metabolitter og andre kemikalier, der spiller en afgørende rolle i vedholdenhed fænotype19,20. I dette arbejde vil vi diskutere vores offentliggjorte metode19, hvor vi har brugt mikroarrays, dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige osmolytter (f.eks. natriumchlorid, urinstof, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumchlorid), for at identificere osmolytter, der har væsentlig indflydelse på E. coli persistens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af vækstmedium, loxacinopløsning og E. coli-cellelagre

  1. Almindeligt Luria-Bertani (LB) medium: Tilsæt 10 g/L tryptone, 10 g/l natriumchlorid (NaCl) og 5 g/l gærekstrakt i deioniseret (DI) vand. Steriliser mediet ved autoklavering.
  2. LB agar plader: Tilsæt 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/l gærekstrakt og 15 g/l agar i DI-vand og steriliser mediet ved autoklavering. Ved den ønskede temperatur (~55 °C) hældes ~30 mL agarmedium i firkantede plader (10 x 10 cm). Pladerne tørres og opbevares ved 4 °C.
  3. Modificeret LB-medium: Tilsæt 10 g/L tryptone og 5 g/l gærekstrakt i DI-vand. Steriliser mediet ved autoklavering.
  4. Modificeret LB-medium, herunder et osmolyte: Bland 2x modificeret LB-medium med en 2x osmolytopløsning i lige store mængder. For at forberede 2x modificeret LB medium, tilsæt 20 g / L tryptone og 10 g / L gær ekstrakt i DI vand og sterilisere ved autoklavering. For at forberede 2x osmolytopløsningen opløses osmolytten af interesse (2x mængde) i DI-vand, og derefter filtreres sterilisere opløsningen.
    BEMÆRK: Osmolyten af interesse og dens koncentrationer kan bestemmes ud fra phenotypen Mikroarray-screeningsanalyser (se protokol 4). Den testede osmolyte og den tilhørende 2x koncentration kan dog justeres afhængigt af forskningens art. For at undersøge virkningen af 1 mM natriumchlorid ville en 2x osmolytopløsning f.eks.
  5. Ofloxacin stamopløsning (5 mg/mL): Tilsæt 5 mg ofloxacin (OFX) salt i 1 ml DI vand. Der tilsættes 10 μL 10 M natriumhydroxid for at øge OPLØSELIGHEDEN af OFX i vand, og derefter filtrere steriliseres opløsningen. Forbered aliquots og opbevares ved -20 °C.
    BEMÆRK: Ofloxacin er et quinolone antibiotikum, der har været meget anvendt til både voksende og ikke-voksende bakterieceller14,21. Den mindste hæmmende koncentration (MIC) af OFX for E. coli MG1655-celler ligger inden for området 0,039-0,078 μg/mL19,20. Bemærk også, at andre antibiotika såsom ampicillin og kanamycin er almindeligt anvendt i persister forskning. Valget af antibiotika afhænger af undersøgelsens art.
  6. E. coli MG1655 cellelagre: Pod 2 mL almindeligt LB-medium med en enkelt koloni i et 14 mL reagensglas (snap-capped) og kultur cellerne i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C. Når cellerne når den stationære fase, blandes 500 μL af cellekulturen med 500 μL på 50% glycerol (steril) i et kryogent hætteglas og opbevares ved -80 °C.

2. Overførsel af celler for at eliminere allerede eksisterende persisters

  1. For at forberede en natkultur skrabes en lille mængde celler fra en frossen cellebestand med en steril pipettespids (tø ikke glycerolcellelageret op), og cellerne podes i 2 mL modificeret LB-medium i et 14 mL snap-capped reagensglas. Cellerne dyrkes i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C i 12 timer.
  2. Første formering
    1. Efter 12 timer overføres 250 μL natten over til 25 mL frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe dækket af en steril aluminiumsfolie.
    2. Cellekulturen dyrkes i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C, indtil cellerne når den mellem eksponentielle fase (OD600 = 0,5).
    3. Den optiske massefylde måles ved 600 nm (OD600)ved hjælp af en mikropladelæser hvert 30. minut.
  3. Anden formering
    1. Ved OD600 = 0,5 fortyndes 250 μL cellekultur fra den første kolbe til 25 mL frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe.
    2. Den anden cellekultur dyrkes i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C indtil OD600=0,5.
    3. Mål den optiske tæthed hvert 30. minut.
      BEMÆRK: En overnatningskultur kan have en betydelig mængde persisterceller4,5,22. Den ovenfor beskrevne fortyndings-/vækstcyklusmetode5 kan bruges til at eliminere disse allerede eksisterende persisters, før cellerne overføres til mikroarrays. Deres afskaffelse kan valideres ved at kvantificere vedvarende niveauer af kulturer fra den ene dag til den anden med den analyse, der er beskrevet i protokol 3. Denne metode er allerede valideret i en tidligere undersøgelse19.

3. Validering af elimineringen af allerede eksisterende persisterceller

  1. Efter den anden formering (se trin 2.3) fortyndes 250 μL af cellekulturen (OD600 = 0,5) i 25 mL frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe.
    BEMÆRK: For kontroller fortyndes 250 μL over natten (se trin 2.1) i 25 mL frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe. Før cellerne overføres til kolben, justeres celletætheden af natten over-kulturen i frisk modificeret LB-medium for at opnå OD600 = 0,5.
  2. Der tilsættes 25 μL OFX-stamopløsning (5 mg/mL) i celleaffjedringen, og kolben rystes forsigtigt for at gøre analysen homogen. Den endelige koncentration af OFX er 5 μg/mL i analysen.
  3. Analysen inkuberes i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C.
  4. Ved hver time under behandlingen (herunder 0 h, tidspunktet før tilsætning af OFX i analysen kultur), overføre 1 mL af analysen kultur fra kolben til en 1,5 mL mikrocentrifuge rør.
  5. Centrifuge analysen kultur i mikrocentrifuge røret på 17.000 x g i 3 min.
  6. Fjern forsigtigt 950 μL af supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
  7. Der tilsættes 950 μL fosfatbufferet saltvandsopløsning (PBS) til mikrocentrifugerøret.
  8. Vask trin 3,5-3,7 for 3x i alt, indtil antibiotikakoncentrationen er under den minimale hæmmende koncentration (MIC).
  9. Efter den endelige vask blev cellepillen genbrugt i 100 μL PBS-opløsning, hvilket resulterede i en 10x koncentreret prøve.
  10. Der tages 10 μL af celleaffjedringen, og der fortyndes serielt seks gange i 90 μL PBS-opløsning ved hjælp af en 96 lang rund bundplade.
  11. Spot 10 μL fortyndede celleaffjedring på antibiotikafrie friske agarplader. For at øge detektionsgrænsen skal de resterende 90 μL celleaffjedring på en frisk agarplade være plader.
  12. Agarpladerne inkuberes ved 37 °C i 16 timer, og der regnes derefter med de kolonidannende enheder (CFU'er). Tegne sig for fortyndingssatserne ved beregningen af det samlede antal CFU'er i 1 mL analysekultur. Kill kurver genereres ved at plotte den logaritmiske CFU værdier med hensyn til varigheden af antibiotikabehandling.
    BEMÆRK: En 6 h OFX-behandling er tilstrækkelig til at opnå en bifasisk afspilningskurve for E. coli-celler 19,20. Det vedvarende niveau af opformerede celler (målt ved CFU-tællinger ved 6 timer) bør være betydeligt mindre end niveauet for dag-til-dag-kulturen. De procedurer, der er beskrevet i protokol 2 og 3, kan udføres med regelmæssig LB afhængigt af forskningsdesignet.

4. Microarray plade screeninger

  1. Forberedelse af mikroarray-cellekulturer
    1. 250 μL eksponentiel faseceller overføres til 25 mL frisk modificeret LB-medium i et 50 mL centrifugerør. Bland forsigtigt celleaffjedringen for at gøre den homogen.
      BEMÆRK: De eksponentielle faseceller (OD600 = 0,5) hentes fra det andet formeringstrin (se trin 2.3).
    2. Den fortyndede celleaffjedring overføres til et sterilt 50 mL-reservoir.
    3. Ved hjælp af en multikanalpipette overføres 150 μL af celleaffjedringen til hver brønd i en mikroarray, dvs.
      BEMÆRK: Brønde, der ikke har osmolytter, fungerer som kontroller.
    4. Dæk mikroarray med en gas-gennemtrængelig forsegling membran.
    5. Pladen inkuberes i en orbital shaker ved 37 °C og 250 omdrejninger i minuttet i 24 timer.
      BEMÆRK: I disse forsøg blev der anvendt kommercielt tilgængelige plader, såsom Phenotype Microarrays (PM-9 og PM-10), der omfatter en bred vifte af osmolytter, pH-buffere og andre kemikalier i tørret tilstand i forskellige koncentrationer. Disse mikroarrays er i halv-område 96 godt plade formater. Kulturmængderne bør justeres afhængigt af den type plader, der anvendes. Mikroarrays kan også genereres manuelt (se nedenfor).
  2. Manuel tilberedning af mikroarrayplader
    1. 75 μL af 2x osmolytopløsninger overføres til brøndene på en brøndplade i et halvt område og 96.
    2. 500 μL eksponentielle faseceller overføres til 25 mL 2x modificeret LB-medium i et 50 mL centrifugerør. Bland forsigtigt celleaffjedringen for at gøre den homogen.
      BEMÆRK: Vaccinationshastigheden blev justeret for at være i overensstemmelse med den i 4.1 beskrevne mikroarrayscreeningsprotokol.
    3. Der tilsættes 75 μL af celleophænget til hver brønd i halvområde 96-brøndpladen, der indeholder 2x osmolytopløsninger.
    4. Pladen inkuberes i en orbital shaker ved 37 °C og 250 omdrejninger i minuttet i 24 timer.
  3. Forberedelse af vedholdende assayplader
    1. Der fremstilles 25 mL modificeret LB-medium, der indeholder 5 μg/mL OFX i et 50 mL centrifugerør, og dette medium overføres til et sterilt reservoir.
    2. 190 μL modificeret LB-medium overføres med OFX fra reservoiret til hver brønd af en generisk fladbundet 96-brøndplade (persister-assayplade) ved hjælp af en multikanalpipette.
    3. Mikroarrayen fjernes fra shakeren (efter dyrkning i 24 timer) og overføres 10 μL cellekulturer fra mikroarrayen til brøndene på den vedholdende assayplade, der indeholder modificeret LB-medium med OFX.
    4. Der tages 10 μL celleaffjedringer fra den vedholdende analyseplade, og der fortyndes serielt tre gange i 290 μL PBS-opløsning ved hjælp af en rundbundet 96-brøndplade og en multikanalpipette.
    5. Efter den serielle fortynding punkt 10 μL af alle serielt fortyndede celleaffjedringer på antibiotikafrie friske agarplader ved hjælp af en multikanalpipette.
    6. Den persister-assayplade (tilberedt i trin 4.3.3) inkuberes i en orbital shaker ved 37 °C og 250 omdrejninger i minuttet i 6 timer efter at have dækket pladen med en gaspermeable tætningsmembran.
    7. Efter 6 timers inkubation i en shaker skal du tage den vedholdende analyseplade ud og gentage trinene 4.3.4-4.3.5.
    8. Agarpladerne inkuberes i 16 timer ved 37 °C, og der tælles derefter CFU'er. CFU niveauer før og 6 timer efter antibiotika behandling gør det muligt at beregne den vedholdende fraktion i hver brønd. CFU tæller før OFX-behandlingen hjælper også med at vurdere virkningerne af osmolytter og på E. coli levedygtighed.

5. Validering af de identificerede betingelser

  1. 250 μL af de eksponentielle faseceller overføres fra trin 2.3 til 25 mL frisk modificeret LB-medium, der indeholder osmolyten identificeret fra mikroarrayscreeningen (se protokol 4).
  2. Kolben inkuberes i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C i 24 timer.
  3. Efter 24 timer fjernes kolben fra rysteren, og cellkulturens 250 μL overføres til 25 mL frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe.
  4. Der tilsættes 25 μL OFX-stamopløsning (5 mg/mL) i celleaffjedringen, og kolben rystes forsigtigt for at gøre analysen homogen. Kolben inkuberes i en shaker ved 37 °C og 250 omdrejninger i minuttet.
  5. Ved hver time under behandlingen overføres 1 mL analysekultur fra kolben til et 1,5 mL mikrocentrifugerør.
  6. Centrifuge analysen kultur i mikrocentrifuge røret på 17.000 x g i 3 min.
  7. 950 μL supernatant fjernes, og der tilsættes 950 μL PBS.
  8. Vask trin 5.6 og 5.7 for 3x.
  9. Efter den endelige vask blev cellepillen genbrugt i 100 μL PBS-opløsning.
  10. Der tages 10 μL af celleaffjedringen, og der fortyndes serielt 6x i 90 μL PBS-opløsning ved hjælp af en 96 lang rund bundplade.
  11. Spot 10 μL af de fortyndede celle suspensioner på en antibiotikafri frisk agar plade. For at øge detektionsgrænsen skal de resterende 90 μL celleaffjedring på en frisk agarplade være plader.
  12. Agarpladen inkuberes ved 37 °C i 16 timer, og tæl derefter CFU'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 beskriver vores eksperimentelle protokol. Fortyndings-/vækstcyklusforsøgene (se protokol 2) er blevet tilpasset på basis af en undersøgelse foretaget af Keren et al.5 for at eliminere de vedholdende, der stammer fra dag-til-dag kulturer. Figur 2A er et repræsentativt billede af agarplader, der anvendes til at bestemme CFU-niveauet af cellekulturer før og efter OFX-behandling. I disse forsøg blev cellerne dyrket i modificeret LB-medium med osmolytter i halvområde 96 brøndplader som beskrevet i trin 4.2. Efter inkubation af pladen i en orbital shaker i 24 timer, den vedholdende analyse blev udført ved hjælp af en generisk flad bund 96 godt plade (se trin 4.3). Osmolytterne og den koncentration, der testes her, blev valgt på grundlag af vores tidligere undersøgelse19, hvor vi udførte trin 4.1 og 4.3 ved hjælp af PM-9-pladen, der indeholder forskellige osmolytter i forskellige koncentrationer (natriumchlorid, kaliumchlorid, natriumsulfat, ethylenglycol, natriumformat, urinstof, natriumlaktat, natriumphosphat, natriumbenzenat, ammoniumsulfat, natriumnitrit og natriumnitrat). Den første kolonne i figur 2A viser CFU-optællingerne for kontrolgruppen. Den anden kolonne repræsenterer en tilstand, hvor celler blev dyrket i 100 mM natriumnitrat; denne betingelse viste sig tidligere at øge de vedvarende niveauer en smule19. Den tredje kolonne repræsenterer en tilstand, hvor celler blev dyrket i 60 mM natriumnitrit, og denne tilstand viste sig tidligere at reducere de vedvarende niveauer betydeligt sammenlignet med kontroller19. Figur 2B er en grafisk gengivelse af CFU-data fra agarpladerne. Figur 2C viser de vedholdende fraktioner af cellekulturerne testet i 96 brøndplader. For at beregne fraktionerne blev persistertællinger normaliseret til de celletællinger, der blev opnået før antibiotikabehandlingerne. Figur 3 viser de bifasiske drabskurver og de vedholdende fraktioner for de analysekulturer, der udføres i forvirrede kolber. I disse forsøg blev cellerne først dyrket i 25 mL modificeret LB-medium med de angivne osmolytter i 250 mL forvirrede kolber i 24 timer, og derefter blev cellerne overført til persister-assay kolber til vedvarende optælling som beskrevet i protokol 5.

Figure 1
Figur 1: Forsøgsproceduren. Celler fra en frossen cellebestand blev dyrket natten over (12 timer) i frisk LB medium. Ved 12 timer blev natten kultur fortyndet (1:100) i 25 mL modificeret LB medium og dyrkes indtil OD600= 0,5. Dette overførselstrin blev gentaget to gange. Efter det endelige formeringstrin blev de eksponentielle faseceller (ved OD600=0,5) fortyndet (1:100) i henholdsvis frisk modificeret LB-medium i en 250 mL forvirret kolbe og et 50 mL centrifugerør. Celleaffjedringen i den 250 mL røgede kolbe blev behandlet med 5 μg/mL OFX for at kvantificere persisters. Celleaffjedringen i 50 mL centrifugerøret blev overført til mikroarrays og inkuberet i 24 timer i en orbital shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 °C. Cellerne fra mikroarrays blev derefter overført til persister-assay plader til at kvantificere persisters. Dette tal blev oprettet ved hjælp af biorender.com. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere publikation19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Mikroarray eksperimenter. (A) Cellerne blev først dyrket i modificeret LB-medium med eller uden angivne osmolytter i et halvt areal 96 brøndplade i 24 timer. Cellerne blev derefter overført til en generisk fladbundet 96 brøndplade og behandlet med 5 μg/mL OFX i 6 timer. Før og efter 6 timers behandling blev cellerne serielt fortyndet i PBS, belagt på agarplader og inkuberet ved 37 °C i 16 timer. Hver betingelse har 8 tekniske replikater. (B) Der blev foretaget CFU-målinger for at vurdere osmolytters indvirkning på henholdsvis celleygtighed og persistens. Den lige linje angiver detektionsgrænsen (600 CFU'er). (C) Grafen repræsenterer de vedvarende fraktioner af cellekulturerne, beregnet ved at tage forholdet mellem CFU-tællingerne efter og før OFX-behandlingen. Den persisterfraktion af cellekulturen, der har 60 mM natriumnitrit, blev ikke beregnet, da dens persisterniveau er under detektionsgrænsen. Hvert datapunkt blev angivet ved middelværdi ± standardafvigelse beregnet ud fra 8 tekniske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Valideringseksperimenter. (A) Eksponentielle faseceller blev overført til 25 mL frisk modificeret LB-medium med angivne osmolytter i 250 mL forvirrede kolber og dyrket i 24 timer. Derefter blev cellerne fortyndet (1:100) i 250 mL forvirrede kolber, der indeholder 25 mL modificeret LB-medium og behandlet med 5 μg/mL OFX i 6 timer. CFU-optællingerne i analysens kulturer blev overvåget hver time for at generere bifasiske drabskurver. * angiver den tilstand, der i væsentlig grad påvirker OFX persister niveauer i forhold til no-osmolyte kontrol (to-tailed ulige varians t-test, p<0,05). (B) Grafen repræsenterer de vedvarende fraktioner af kulturerne. Hvert datapunkt blev angivet ved middelværdi ± standardafvigelse beregnet ud fra 3 biologiske replikater. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere publikation19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den høje gennemstrømning persister assay beskrevet her blev udviklet for at belyse virkningerne af forskellige kemikalier på E. coli persistens. Ud over kommercielle PM-plader kan mikroarrays konstrueres manuelt som beskrevet i trin 4.2. Desuden er den protokol, der præsenteres her, fleksibel og kan bruges til at screene andre mikroarrays, såsom lægemiddelpaneler og cellebiblioteker, der er i 96 brøndpladeformater. De eksperimentelle forhold, herunder vækstfasen, vaccinationshastigheden og mediet, kan justeres for at teste disse biblioteker. For eksempel, hvis man ønsker at screene en celle bibliotek, såsom Keio E. coli knockout samling23, kan de først overføre stammer fra biblioteket til 96 godt plader, der omfatter friske medier, ved hjælp af en multikanal pipette. Når cellerne når den ønskede vækstfase (f.eks. eksponentiel eller stationær fase), overføres cellerne derefter til vedholdende assayplader som beskrevet i trin 4.3 for at optælle de vedvarende niveauer af knockoutstammerne. Tilsvarende kan denne strategi bruges til at screene E. coli Promoter indsamling24 (et bibliotek af fluorescerende reporter stammer i 96 godt plade formater) for at identificere initiativtagere, der aktiveres af antibiotika. Disse promotorer kan let påvises ved at måle fluorescenssignalerne fra stammer i persister-assay plader under antibiotikabehandlingen.

I vores eksperimenter brugte vi en modificeret LB (mangler NaCl) for at undgå yderligere effekt, der kunne opstå fra NaCl, i betragtning af at mikroarrays allerede har forskellige osmolytter. Selvom NaCl i almindeligt LB-medium er kendt for at være godt for at bevare cellernes membranintegritet, er det blevet rapporteret, at NaCl ved 0-1% rækkevidde har en minimal effekt på cellevækst25. Desuden har resultater fra propidium jod (PI) farvning og persisters assays i vores tidligere undersøgelse vist, at fraværet af NaCl ikke påvirker membranens integritet og persistensen af E. coli celler19. Denne ændring blev foretaget specifikt for at løse de problemer, der er i vores undersøgelse, og kan ændres baseret på forskningens art.

Vi har også tilpasset en metode udviklet af Keren et al.5 til at fjerne allerede eksisterende persisters i vores cellekulturer før podning i mikroarrays. Type I-persisters vides at være genereret i den stationære fase; Derfor vil den direkte podning af cellerne fra kulturer fra den ene dag til den anden til mikroarrayplader overføre et betydeligt antal vedholdende, hvilket kan hindre virkningerne af osmolytter. Med fortyndings-/vækstcyklusforsøgene (se protokol 2) var vi i stand til at reducere disse allerede eksisterende persisters som følge af dag-til-dag-kulturerne19. Vi bemærker, at vi har dyrket cellerne i mikroarray plader i 24 timer for at kunne tælle alle persisters, herunder type I varianter, der dannes under den stationære fase i nærværelse af osmolytter. Disse tilpassede teknikker kan dog altid ændres afhængigt af undersøgelsens art.

Vi behandlede cellerne i mikroarrays med 5 μg/mL OFX for at opregne de vedholdende. Da vaskeproceduren for at fjerne antibiotika fra 96 prøver ville være meget arbejdskrævende, blev cellerne efter behandlingen serielt fortyndet i PBS uden vask (se trin 4.2). Denne procedure fortyndede OFX-koncentrationen mere end 30 gange. De fortyndede celleaffjedring blev derefter belagt på antibiotikafrie agarplader, hvor OFX blev yderligere spredt. Vores foreløbige undersøgelser, hvor vi gentog disse eksperimenter med og uden vask, har verificeret, at denne seriefortyndingsmetode ikke påvirkede de vedholdende niveauer19.

Under flerkanalspipetting i 96 brøndplader skal man omhyggeligt blande celleaffjedringerne for at opretholde en homogen cellefordeling. For at gøre dette, afhængigt af arbejdsvolumen, ville det være gavnligt at bemærke det mindste antal pipetter, der er nødvendige for at gøre opløsningen homogen. Til dette formål gennemførte vi et simpelt kontroleksperiment, hvor vi overvågede pipetterne (op og ned) ved at sprede et farvemolekyle i PBS og medium under de forhold, der undersøges her. Derudover, hvis du arbejder med mere komplekse miljøer såsom pH-buffere, vil vi foreslå at måle cellekulturens pH før og under inkubationen i en shaker, da cellekulturen har tendens til at være meget alkalisk (pH-≈ 8) over tid. Dette kan give en idé om kvaliteten samt pH-området af den anvendte buffer. For at opnå tællelige CFU'er på agarplader fra analyseerne med høj gennemløb bør visse betingelser, såsom celleokuleringshastigheden, kulturernes alder og seriefortyndingsparametre (PBS-volumen, fortyndingshastigheder og antallet af fortyndingstrin osv.), optimeres, før mikroarrays testes. Endelig bør resultaterne fra mikroarrays yderligere valideres i kolber, da mængden af dyrkning, overfladeareal og bestråling i en 96 brøndplade kan have yderligere virkninger på de observerede resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke medlemmerne af Orman Lab for deres værdifulde input i løbet af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH / NIAID K22AI125468 karriere overgang tildeling og en University of Houston start tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

Tags

Tilbagetrækning Problem 168 persisters high-throughput screening fænotype mikroarrays pH osmolytter antibiotika
Screening af kemiske forbindelser med høj gennemstrømning for at belyse deres virkninger på bakteriel persistens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karki, P., Orman, M. A.… More

Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter