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Biochemistry

सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना

Published: March 5, 2021 doi: 10.3791/61603
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

Summary

यहां, हम कोशिका झिल्ली पर सोने के नैनोरोड (AuNRs) की गतिशीलता की निगरानी के लिए पारंपरिक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग दिखाते हैं। इमेजजे और मैटलैब का उपयोग करके एकल AuNRs के स्थान और अभिविन्यास का पता लगाया जाता है, और AuNRs के विसारक राज्यों को एकल कण ट्रैकिंग विश्लेषण की विशेषता है।

Abstract

कोशिका झिल्ली पर नैनोकणों की प्रसार गतिशीलता का विश्लेषण सेलुलर तेज प्रक्रिया को बेहतर तरह समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और नैनो-मेडिसिन डिलीवरी के तर्कसंगत डिजाइन के लिए सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है। एकल कण ट्रैकिंग (एसपीटी) विश्लेषण कोशिका झिल्ली पर व्यक्तिगत नैनोकणों की स्थिति और अभिविन्यास की जांच कर सकता है, और उनके अनुवादात्मक और घूर्णन राज्यों को प्रकट कर सकता है। यहां, हम लाइव सेल झिल्ली पर सोने के नैनोरोड (AuNRs) की गतिशीलता की निगरानी के लिए पारंपरिक डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करते हैं। हम यह भी दिखाते हैं कि इमेजजे और मैटलैब का उपयोग करके AuNRs का स्थान और अभिविन्यास कैसे निकाला जाए, और AuNRs के विसारक राज्यों की विशेषता कैसे बनाई जाए। सैकड़ों कणों के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि एकल AuNRs U87 एमजी कोशिका झिल्ली की सतह पर ब्राउनियन गति प्रदर्शन करते हैं । हालांकि, व्यक्तिगत लंबे प्रक्षेपवक्र विश्लेषण से पता चलता है कि AuNRs झिल्ली पर गति राज्यों के दो अलग अलग प्रकार है, अर्थात् लंबी दूरी के परिवहन और सीमित क्षेत्र कारावास । हमारे एसपीटी विधियों का उपयोग संभावित रूप से विभिन्न जैविक कोशिकाओं में सतह या इंट्रासेलुलर कण प्रसार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और जटिल सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन सकता है।

Introduction

झिल्ली पर नैनोकणों (एनपीएस) की गतिशीलता सेलुलर तेज प्रक्रिया से निकटता से जुड़ी हुई है, जो सेल कार्यों, वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण और कृत्रिम नैनोमेडिकल डिलीवरी सिस्टम के विकास के लिए आवश्यक है1,2। सिंगल पार्टिकल ट्रैकिंग (एसपीटी) तकनीक एनपीएस3,4के विषम व्यवहारों की विशेषता के लिए एक मजबूत उपकरण है। सामान्य तौर पर, कोशिका झिल्ली तरल होती है, जिसका अर्थ है कि प्रोटीन और लिपिड जैसे घटक प्लाज्माझिल्ली विमान5,6,7में बाद में स्थानांतरित हो सकते हैं। झिल्ली संगठन और संरचना की स्थानिक जटिलता से एनपीएस और झिल्ली के बीच बातचीत की स्थानिक टेम्परल विषमता हो सकती है। इसलिए, झिल्ली पर एनपीएस के आंदोलन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प दोनों की आवश्यकता होती है।

जीवित कोशिकाओं में अलग - अलग कणों के स्थानीयकरण पर नज़र रखने वाली एकल कण ों की पहचान करने वाले दसियों नैनोमीटर के स्थानिक संकल्प और मिलीसेकंड का एक समय संकल्प8,9 को एनपीएस या झिल्ली अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अच्छीतरहसे विकसित किया गया है । फ्लोरेसेंस आधारित सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक जीवित कोशिका पर्यावरण 9 , 10 , 11,12में एनपीएस/अणुओं को देखने के लिए मूल्यवान उपकरण बन गई हैं । उदाहरण के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, जो एक उच्च स्थानिकप्रेम संकल्प के साथ सब्सट्रेट/समाधान इंटरफेस पर नमूने की पतली परतों (~ 100 एनएम) को झिल्ली अणुओं गतिशीलता13, 14के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, कम तीव्रता और तेजी से अपरिवर्तनीय फोटोब्लैचिंग जैसे एकल फ्लोरोफोरस के अंतर्निहित नुकसान13ट्रैकिंग की सटीकता और अवधि को कम करते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट जांच की जगह लेने वाले गैर-फ्लोरोसेंट प्लाज्मोनिक एनपीएस ने अपनी अनूठी ऑप्टिकल विशेषताओं15के कारण दीर्घकालिक इमेजिंग अध्ययनों में अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। प्लाज्मोनिक एनपी जांच के बिखरने वाले संकेतों के आधार पर, कई प्रकार की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग जैविक प्रक्रियाओं के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जैसे डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी (डीएफएम)16,इंटरफेरोमेट्रिक बिखरने (iSCAT) माइक्रोस्कोपी17 और अंतर हस्तक्षेप सूक्ष्मस्कोपी (डीआईसीएम)18। इसके अलावा, डीएफएम और डीआईसीएम18, 19, 20,21, 22का उपयोग करके ओएनआर की गति और रोटेशन गतिशील प्राप्त किया जा सकताहै। आमतौर पर, एक एसपीटी प्रयोग में, ऑब्जेक्ट की गति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप द्वारा दर्ज की जाती है, और फिर एसपीटी विश्लेषण विधियों द्वारा विश्लेषण किया जाता है3। व्यक्तिगत एनपीएस द्वारा उत्पन्न समय-हल किए गए प्रक्षेप-पथ और अभिविन्यास कोण सामान्य रूप से स्टोचस्टिक और विषम होते हैं, इसलिए विभिन्न विश्लेषण विधियों के साथ प्रचुर मात्रा में गतिशील जानकारी पेश करना आवश्यक है।

यहां, हम एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो डीएफएम का उपयोग करके सेल झिल्ली पर AuNRs की गतिशीलता पर नज़र रखता है, इमेजजे और मैटलैब के साथ AuNRs के स्थान और अभिविन्यास को निकालता है और एसपीटी विश्लेषण विधियों के साथ AuNRs के प्रसार की विशेषता है। एक प्रदर्शन के रूप में, हम यहां दिखाते हैं कि U87 एमजी सेल झिल्ली पर असंशोधित AuNRs (CTAB-AuNRs, सेटिल्रिमिथाइलाम्मोनियमनियम अमोनियम ब्रोमाइड अणु द्वारा सुरक्षात्मक एजेंट के रूप में संश्लेषित) की गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एसपीटी प्रोटोकॉल का उपयोग कैसे करें। यह प्रदर्शित किया गया है कि सीटीएबी-ओएनआर जैविक वातावरण में प्रोटीन को सोख सकता है, कोशिका झिल्ली पर आगे बढ़ सकता है और फिर कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है2,20,22। U87 एमजी सेल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का सबसे आम और सबसे घातक ट्यूमर है, और इसकी झिल्ली रिसेप्टर्स असामान्य रूप से व्यक्त किए जाते हैं। झिल्ली रिसेप्टर्स AuNRs पर प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकते हैं, जो AuNRs की गतिशीलता को प्रभावित करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल आम तौर पर जीव विज्ञान के क्षेत्र में अन्य एसपीटी प्रयोगों पर लागू होता है।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. भ्रूण गोजातीय सीरम (अंतिम एकाग्रता 10%) जोड़कर U87 एमजी कोशिकाओं के लिए पूरा माध्यम तैयार करें और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1%) न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के लिए। कोशिकाओं उपसंस्कृति के लिए प्लास्टिक सेल संस्कृति पकवान का प्रयोग करें।
  2. पैसेज कोशिकाएं सप्ताह में 2 से 3 बार।
    1. संस्कृति माध्यम को हटा दें और दुलबेक्को के फॉस्फेट-बफर खारा (डी-पीबीएस) के साथ सेल लेयर को 2 ~ 3 बार जब कॉन्फ्ल्यूंट (80%~ 90%) के साथ कुल्ला।
    2. सेल कल्चर डिश में ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1.0 से 2.0 मिलियन जोड़ें और कोशिकाओं के गोल (3 ~ 5 मिनट) तक एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    3. तैयार पूर्ण माध्यम के 3.0 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे पाइपिंग करके कोशिकाओं को तितर-बितर करें।
    4. ताजा सेल माध्यम (3 एमएल) के साथ नए कल्चर डिश में सेल सस्पेंशन (1 एमएल) जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर आर्द्र वातावरण में बनाए रखें।

2. माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयारी

नोट: उच्च गतिविधि के साथ तीसरी से दसवीं पीढ़ी की U87 एमजी कोशिकाओं का उपयोग एसपीटी प्रयोगों में किया जाता है।

  1. 22 मिमी × 22 मिमी कवर्लिप को पहले से ही इथेनॉल (99.9%) में डुबोकर पिरान्हा समाधान के साथ साफ किया गया है।
  2. इथेनॉल समाधान (चरण 2.1) से कवर स्लिप लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और लौ पर इथेनॉल जलाकर स्टरलाइज करें। एक बार जब सभी इथेनॉल जल जाता है, तो सेल माध्यम (कोई फिनॉल लाल) के 2 एमएल से भरा प्लास्टिक सेल कल्चर डिश (35 x 10 मिमी) में कवरस्लिप रखें।
  3. कवरस्लिप पर चरण 1.2.3 से सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें और धीरे से कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए आगे और बाएं और सही पकवान धक्का। इसे उमस भरे वातावरण में रखें।
  4. जब कवरस्लिप पर U87 एमजी कोशिकाएं 20%-40% संकुचन (~ 12 घंटे) तक पहुंचती हैं, तो सीटीएबी-औनर्स (138 पीएम) के 20 माइक्रोन को डिश में जोड़ें और तितर-बितर करें। 5 मिनट के लिए आर्द्र वातावरण में इनक्यूबेट।
  5. संस्कृति माध्यम के 100 μL जोड़ें (कोई फिनोल लाल) कदम 2.4 में डिश से नाली ग्लास स्लाइड(चित्रा 1)जो पिरान्हा समाधान के साथ पूर्वक्वीनीकृत है की नाली में।
  6. कवरलिप को डिश से बाहर निकालें और माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड(चित्रा 1)के नाली के शीर्ष पर उलटा करें। नेल पॉलिश के साथ सील, इसे सूखने दें और इसे एसपीटी प्रयोग करने के लिए मंच पर रखें।

3. डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1)के साथ एकल कण ट्रैकिंग प्रयोगों का प्रदर्शन ।

  1. तेल डूबे डार्कफील्ड कंडेनसर (एनए 1.43-1.20) पर तेल की एक बूंद रखें और कंडेनसर को ग्लास स्लाइड से संपर्क करने के लिए घुंडी चालू करें।
  2. कवर ग्लास के शीर्ष पर तेल की एक बूंद रखो और ध्यान केंद्रित घुंडी बारी करने के लिए 60x तेल विसर्जन उद्देश्य (NA 0.7-1.25) तेल को छूने बनाने के लिए ।
  3. प्रकाश स्रोत चालू करें और इमेजिंग विमान को केंद्रित करने के लिए फोकसिंग नॉब को थोड़ा चालू करें।
    नोट: देखने के क्षेत्र में, पृष्ठभूमि काली है, कोशिकाएं उज्ज्वल हैं, और सीटीबीएबी-एयूएनआर (आस्पेक्ट रेशियो ~ 2:1, चित्रा 2)छोटे रंग (लाल, पीले या हरे) बिखरने वाले धब्बे हैं।
  4. एक रंग CMOS कैमरे से नमूना बिखरने प्रकाश पर कब्जा। छवियों को सहेजने के लिए झगड़ा प्रारूप रिकॉर्ड और निर्यात करने के लिए सॉफ्टवेयर में"कैमरा आइकन"पर क्लिक करें।

4. डेटा अधिग्रहण

  1. एकल दीर्घकालिक प्रक्षेप पथ निकालें
    1. "आरजीबी रंग" मोड से "8 बिट" मोड में टाइम-सीरीज डार्क-फील्ड छवियों को परिवर्तित करने के लिए चित्र 3 में वर्णित के रूप में काम करें। इमेज जे क्लिक में इमेज | | टाइप करें 8 सा। कंट्रास्ट को एडजस्ट करने के लिए इमेज | पर क्लिक करें | समायोजित करें | चमक इसके विपरीत।
    2. एक लक्ष्य कण का चयन करें और मुक्केबाजी और"Ctrl + X"के साथ पृष्ठभूमि को हटाने के द्वारा समय श्रृंखला पृष्ठभूमि कटऑफ ।
    3. "प्लगइन्स | पर क्लिक करके कण का पता लगाने और कण लिंकिंग विंडोखोलें कण ट्रैकर क्लासिक | कण ट्रैकर"।
    4. रेडियस को 6, कटऑफ को 0 और परसेंटाइल को 0.01% सेट करें।
      नोट: कण का पता लगाने के लिए, पूर्वावलोकन की सहायता से तीन मापदंडों से ऊपर समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि त्रिज्या लक्षित कण से थोड़ा बड़ा है और सबसे छोटे अंतर-कण जुदाई से छोटा है। शतमक तीव्रता वितरण की निचली सीमा है जो उम्मीदवार कणों के लिए होती है।
    5. लिंक रेंज को 5 और विस्थापन को 10 तक सेट करें।
      नोट: लगातार आसन्न फ्रेम के बीच कण को जोड़ने के लिए, उपरोक्त दो मापदंडों को समायोजित करें। विस्थापन अधिकतम पिक्सेल है कि एक कण दो सफल फ्रेम के बीच स्थानांतरित कर सकते हैं, और लिंक रेंज लगातार फ्रेम की संख्या पर विचार करने के लिए जब सबसे अच्छा इसी मैच का निर्धारण है ।
    6. परिणाम देखने के लिए पार्टिकलट्रैकर परिणाम खिड़की खोलने के लिए"ओके"पर क्लिक करें।
    7. क्लिक करें उत्पन्न प्रक्षेप पथ का निरीक्षण करने के लिए"सभी प्रक्षेपपथोंकी कल्पना करें"।
    8. क्लिक करें"रीलिंक कण"शीर्ष पर मेनू विभिन्न लिंक रेंज और शतमक मापदंडों के साथ पता लगाया कणों को फिर से जोड़ने के लिए, अगर सॉफ्टवेयर जनित प्रक्षेपवक्र AuNR के चलती प्रक्षेपवक्र से मेल नहीं खाती है ।
    9. क्लिक करें"सेव फुल रिपोर्ट"परिणामों को बचाने के लिए यदि सॉफ्टवेयर ने प्रक्षेपवक्र उत्पन्न किया है और AuNR की गति का मिलान किया जाता है।
      नोट: छवि J के साथ एकल दीर्घकालिक प्रक्षेपवक्र निकालने का एक उदाहरण चित्र 4में दिखाया गया है ।
  2. बहु-प्रक्षेप पथ निकालना
    नोट: फिजी के साथ बहु-प्रक्षेप पथ निकालने का एक उदाहरण चित्र 5में दिखाया गया है। कई चरण हैं, और प्रत्येक चरण ट्रैकिंग प्रक्रिया में एक कदम बनता है। प्रत्येक चरण का परिणाम तुरंत प्रदर्शित होता है, जो उपयोगकर्ता को आउटपुट असंतोषजनक होने पर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए वापस जाने की अनुमति देता है।
    1. "आरजीबी रंग" मोड से "8 बिट" मोड में टाइम-सीरीज डार्क-फील्ड छवियों को परिवर्तित करने के लिए चित्र 3 में वर्णित के रूप में काम करें। इमेज जे पाथवे में क्लिक करें "इमेज | | टाइप करें 8 बिट"। उनके कंट्रास्ट को एडजस्ट करने के लिए क्लिक करें "इमेज | | समायोजित करें | चमक इसके विपरीत "।
    2. "प्लगइन्स | पर क्लिक करके स्टार्ट पैनल खोलें ट्रैकिंग | ट्रैकमेट"। क्लिक करें'अगला'।
    3. ड्रॉप-डाउन मेन्यू से'लोग डिटेक्टर'चुनें और'नेक्स्ट'पर क्लिक करें।
    4. डिटेक्टर कॉन्फ़िगरेशन पैनल के मापदंडों को समायोजित करें। अनुमानित ब्लॉब व्यास को 10 तक सेट करें, सीमा को 0 सेट करें, और"उप-पिक्सेल स्थानीयकरण करें"का चयन करें।
    5. क्लिक करें"अगले"प्रारंभिक स्पॉट फ़िल्टरिंग पैनल खोलने के लिए।
      नोट: लक्ष्य बिंदुओं को और अनुकूलित करने के लिए कई मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। इस उदाहरण में, कोई अन्य पैरामीटर समायोजित नहीं किए गए थे।
    6. क्लिक करें'नेक्स्ट'और ड्रॉप-डाउन मेन्यू से'हाइपरस्टैक डिस्प्लेर'का चयन करें।
    7. स्पॉट फ़िल्टरिंग पैनल खोलने के लिए'नेक्स्ट'पर क्लिक करें। 1.88 से ऊपर की गुणवत्ता सेट करें, एक्स 38.86 से ऊपर, वाई 56.54 से ऊपर।
    8. क्लिक करें'नेक्स्ट'और ड्रॉप-डाउन मेन्यू से'सिंपल लैप ट्रैकर'चुनें। तीन मापदंडों को समायोजित करके सरल लैप ट्रैकर को कॉन्फ़िगर करें, यानी लिंकिंग अधिकतम दूरी = 15, गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी = 15 और गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप = 5।
      नोट: लिंकिंग-अधिकतम दूरी दो फ्रेम के बीच एक बिंदु का अधिकतम विस्थापन है। गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी दो खंडों का अधिकतम विस्थापन है। गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप दो बिंदुओं के बीच सबसे बड़ा फ्रेम है जिसे पाटा जाना है ।
    9. ट्रैक करने के लिए'नेक्स्ट'पर क्लिक करें। समाप्त होने पर,"नेक्स्ट"पर क्लिक करना जारी रखें।
    10. पटरियों पर फ़िल्टर सेट करें, जैसे 300 से ऊपर ट्रैक में स्पॉट की संख्या सेट करें।
    11. अंतिम सेव पैनल खुलने तक"नेक्स्ट"पर क्लिक करते रहें। ड्रॉप-डाउन मेन्यू से"एक्सपोर्ट ट्रैक्स टू एक्सएमएल फाइल"चुनें और फिर सीएसवी फॉर्मेट में सेव करने के लिए'निष्पादित'पर क्लिक करें।
  3. आर/जी मान
    नोट: आर और जी चैनलों में लक्षित AuNRs की बिखरने तीव्रता MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle) में लिखे गए एक कोड का उपयोग करके रंग डार्कफील्ड छवियों से प्राप्त कर रहे हैं, और निष्कर्षण सिद्धांत चित्रा 6में प्रस्तुत किया जाता है ।
    1. एक्स-वाई समन्वय (ImageJ/Fiji द्वारा निकाले गए) के अनुसार प्रत्येक फ्रेम में AuNR के केंद्र पिक्सेल समन्वय खोजने के लिए xycoordination.m के कार्य का उपयोग करें।
    2. 3 x 3 पिक्सल मैट्रिक्स को परिसीमन करने.m आरईजीएक्सट्राक्शन के कार्य का उपयोग करें, आर या जी चैनलों के 9 बिखरने-तीव्रता वाले मूल्यों को निकालें, और एक औसत मूल्य (μ, आर या जी के रूप में परिभाषित) की गणना करें।
      नोट: 3 x 3 पिक्सल मैट्रिक्स चरण 4.3.1 से प्राप्त पिक्सेल निर्देशांक पर केंद्रित है।
  4. ध्रुवीय कोण
    नोट: ध्रुवीय कोण AuNR और ऑप्टिकल धुरी (जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है) के देशांतर के बीच कोण है, जो AuNR के स्थानिक (जेड अक्ष) रोटेशन गतिशीलता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं ।
    1. ध्रुवीय कोण के कार्य का उपयोग करें.m दोहरे चैनल अंतर विधि22द्वारा ध्रुवीय कोणों (θ) की गणना करने के लिए, Equation 11 ।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: एसपीटी विश्लेषण विधियों के प्रदर्शन और दक्षता के लिए एक व्यवस्थित और मजबूत डेटा विश्लेषण ढांचा आवश्यक है। मैटलैब में लिखे कस्टम सॉफ्टवेयर (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters) का इस्तेमाल किया जाता है। भूखंडों को तैयार करने के लिए एक रेखांकन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है।

  1. विश्लेषण पैरामीटर
    1. तालिका 1 में दिखाए गए सूत्रों के अनुसार गतिशील मापदंडों की गणना करने के लिए csv_data_extract_dis_vel_ss.m और csv_data_MSD.m की लिपियों का उपयोग करें।
      नोट: इन मापदंडों का उपयोग AuNRs की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है और इसमें तीन भाग होते हैं। (1) प्रक्षेप पथ संबंधित पैरामीटर: विस्थापन, चरण आकार, वेग, जायरेशन (आरजी)का त्रिज्या, और टर्निंग एंगल (टीए); (2) एमएसडी पैरामीटर: प्रसार गुणांक (डीटी)और असामान्य प्रसार एक्सपोनेंट (α); और (3) रोटेशन संबंधित पैरामीटर: ध्रुवीय कोण और घूर्णन लैबिलिटी (σ)।
उपाय परिभाषा शारीरिक अर्थ
विस्थापन Equation 1 वस्तुओं की स्थिति में परिवर्तन
चरण का आकार Equation 2 दो आसन्न बिंदुओं के बीच की दूरी
वेग Equation 3 वस्तुओं की गति की गति
आरजी Equation 4 एक विशिष्ट समय अंतराल में वस्तुओं की चलती सीमा
टीए Equation 5 दो आसन्न बिंदुओं के बीच वस्तुओं की गति दिशा
एमएसडी Equation 6 एक विशिष्ट समय अंतराल में वस्तुओं की औसत गति दूरी
डीटी Equation 7 वस्तुओं की प्रसार क्षमता
α Equation 8 सामान्य प्रसार (α ~ 1)
ध्रुवीय कोण Equation 9 वस्तुओं की 3डी अभिविन्यास जानकारी
σ Equation 10 ध्रुवीय कोण डेटा सेट के फैलाव की डिग्री

तालिका 1: विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन प्रकार के पैरामीटर। इनमें प्रक्षेप पथ से संबंधित पैरामीटर (विस्थापन, स्टेप साइज, वेग, आरजी और टीए),एमएसडी पैरामीटर (एमएसडी, डीटी और α) और रोटेशन से संबंधित पैरामीटर (ध्रुवीय कोण और घूर्णन लेबिलिटी) शामिल हैं।

  1. प्रक्षेपवक्र का दृश्य विश्लेषण
    नोट: प्रक्षेप पथ दृश्य सहज रूप से कण गति की स्थानिक विषमता और गतिशील मापदंडों के प्रक्षेपवक्र (समन्वय) वितरण, जैसे समय-मानचित्रण प्रक्षेपवक्र, आरजी-औरडी टी-मैपिंग प्रक्षेपवक्र, और ध्रुवीय-कोण मानचित्रण प्रक्षेपवक्र को सहज रूप से प्रस्तुतकरसकता है । ग्राफिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मानचित्रण प्रक्षेप पथ तैयार किए गए थे।
    1. एक्स के रूप में एक्स समन्वय सेट करें, वाई वाई के रूप में समन्वय करें, और जेड के रूप में समय (आरजी,डीटी,ध्रुवीय कोण) ।
    2. क्लिक करें'प्लॉट | बिखराव साजिश | रंग मानचित्रण प्लॉट"।
    3. कलर बार जोड़ें।
  2. एमएसडी विश्लेषण
    नोट: गति गतिविधि और कणों की गति मोड MSD विश्लेषण23द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । डीटीजितना बड़ा होगा, कणों की प्रसार गति उतनी ही सक्रिय होगी। जब α ~ 1, कण सामान्य प्रसार गति करते हैं, अन्यथा वे असामान्य प्रसार गति करते हैं।
    1. एमएसडी-α आंकड़े
      1. समय अंतराल (α) एक्स के रूप में निर्धारित करें, वाई के रूप में एमएसडी डेटा।
      2. क्लिक करें'प्लॉट | तितर बितर साजिश"
      3. "विश्लेषण | पर क्लिक करके डेटा फिट करें फिटिंग | Nonlinear वक्र फिटिंग (समारोह: Allometricl)"।
    2. एमएसडी-τ डबल-लॉगरिथमिक आंकड़ा
      नोट: एमएसडी-τ डबल-लॉगरिथम आंकड़ा, जिसका ढलान α है और अवरोधन डीटीहै, सहज रूप से कण गति पेश कर सकता है।
      1. एक्स के रूप में लॉगरिथम समय अंतराल सेट करें, और वाई के रूप में लॉगरिथम एमएसडी।
      2. क्लिक करें'प्लॉट | तितर बितर साजिश"।
      3. "विश्लेषण | पर क्लिक करके डेटा फिट करें फिटिंग | रैखिक वक्र फिटिंग"।
    3. डी-ο आंकड़ा (MSD/4t)
      नोट: डी = MSD/4ο, समय α और विसंगति कारक α का एक समारोह है, और डी-τ आंकड़ा सीधे समय के साथ प्रसार गुणांक के परिवर्तन से पता चलता है । जब डी समय के साथ बढ़ता है, α 1 से अधिक है और कणों superdiffusion गति करते हैं ।
      1. एक्स के रूप में लॉगरिथमिक समय अंतराल (α) सेट करें, और वाई के रूप में लॉगरिथम डी।
      2. क्लिक करें'प्लॉट | तितर बितर साजिश"।
      3. "विश्लेषण | पर क्लिक करके डेटा फिट करें फिटिंग | Nonlinear वक्र फिटिंग (समारोह: "Allometricl")"।
        नोट: प्रक्षेप पथ जितना छोटा होगा, प्रसार अनुमानों की अशुद्धि उतनी ही अधिक होगी । सामान्य तौर पर, लंबे अंतराल समय (> 30 ο) के एमएसडी-एनए विश्लेषण के माध्यम से डीटी और α प्राप्त किए गए थे। हालांकि, सरल और किसी न किसी फिटिंग गति विवरण चिकनी होगा । इसलिए, कम अंतराल समय (< 10 ο) का एमएसडी-एनए विश्लेषण कम समय में कणों के गति व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए किया जाना चाहिए।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण
      नोट: बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण एक स्थानिक क्षेत्र में कणों की गति स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकता है, जो अप्रत्यक्ष रूप से स्थानिक विषमता वातावरण को इंगित करता है। उदाहरण के लिए, यदि डीटी का हिस्टोग्राम बड़े पैमाने पर वितरण या बहु-चोटियों के वितरण को प्रदर्शित करता है, तो इसका मतलब है कि कणों की गति गतिविधियां विषम हैं।
      1. वाई के रूप में गतिशील मापदंडों (जैसे डीटी,आरजी,अधिकतम विस्थापन) सेट करें।
      2. क्लिक करें'प्लॉट | हिस्टोग्राम"।
      3. हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें, और डिवीजन आकार या डिवीजनों की संख्या निर्धारित करें। क्लिक करें"लागू करें"।
    2. एकल कण सांख्यिकीय विश्लेषण
      नोट: एकल कणों का सांख्यिकीय विश्लेषण व्यक्तिगत कणों के गति व्यवहार को दिखा सकता है, जो अप्रत्यक्ष रूप से आसपास के वातावरण की स्थानिक विषमता को भी दर्शाता है।
      1. कई फ्रेम
        1. एकल लंबे प्रक्षेपवक्र के सभी फ्रेमों के गतिशील मापदंडों (जैसे टीए,स्टेप साइज, ध्रुवीय कोण) की गणना करें, और मूल तालिका की प्रतिलिपि करें और वाई के रूप में सेट करें।
        2. क्लिक करें'प्लॉट | हिस्टोग्राम"।
        3. हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें, और डिवीजन आकार या डिवीजनों की संख्या निर्धारित करें। क्लिक करें"लागू करें"।
          नोट: यदि टीए और स्टेप दोनों का आकार एक छोटा सा मूल्य वितरण प्रदर्शित करता है, तो कण एक छोटे कदम वाले सुपर-प्रसार गति करते हैं।
      2. चलती खिड़कियां
        1. चलती खिड़की विधि (11 फ्रेम) के माध्यम से एकल लंबे प्रक्षेपवक्र के सभी फ्रेम के गतिशील मापदंडों (जैसे आरजी,डीटी)की गणना करें, और मूल तालिका में कॉपी करें और वाई के रूप में सेट करें।
        2. क्लिक करें'प्लॉट | हिस्टोग्राम"।
        3. हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें, और डिवीजन आकार या डिवीजनों की संख्या निर्धारित करें। क्लिक करें"लागू करें"।
  4. समय-श्रृंखला विश्लेषण
    नोट: सांख्यिकीय विश्लेषण एनपीएस की गति स्थिति को प्रकट कर सकता है, और समय-श्रृंखला विश्लेषण प्रस्ताव व्यवहार को पूरक के रूप में पेश कर सकता है। कई बार श्रृंखला मापदंडों के संयोजन, यह लौकिक और स्थानिक स्तरों पर एनपीएस के गति व्यवहार भेदभाव कर सकते हैं ।
    1. एक्स के रूप में समय निर्धारित करें, वाई (जैसे विस्थापन, ध्रुवीय कोण और आरजी)के रूप में समय-श्रृंखला पैरामीटर।
    2. क्लिक करें'प्लॉट | बहु फलक आरेख | खड़ी साजिश | रेखा + प्रतीक"।

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Representative Results

प्रोटोकॉल में असंशोधित 40 x 85 एनएम सीटीएबी-एएनआर का इस्तेमाल किया गया। जैसा कि चित्रा 2Bमें दिखाया गया है, इसका देशांतर प्लाज्मोनिक अधिकतम ~ 650 एनएम (लाल क्षेत्र) है और ट्रांसवर्स प्रतिध्वनि 520 एनएम (हरित क्षेत्र) पर है। पिछले साहित्यकारों ने खुलासा किया है कि प्लाज्मोनिक एनएनआर के ऑप्टिकल गुण (जैसे एलएसपीआर तीव्रता) उनके व्यास20,22के साथ काफी बदल जाएंगे। चित्रा 2 सीमें, U87 सेल झिल्ली पर CTAB-AuNRs से बिखरने की तीव्रता, संकीर्ण चौड़ाई के साथ ठेठ गॉसियन वितरण दिखाया और कांच पर CTAB-AuNRs के अनुरूप था, जो इंगित करता है कि इस प्रयोग में ट्रैक CTAB-AuNRs अच्छी तरह से मोनोडिस्प्ड थे ।

झिल्ली पर सीटीबीएबी-एयूएनआर के गतिशील की निगरानी डीएफएम (12 एफपीएस) द्वारा की गई थी। जैसा कि चित्रा 7में दिखाया गया है, 500 से अधिक प्रक्षेप पथ (प्रक्षेप पथ की लंबाई 300 फ्रेम से अधिक) प्राप्त की गई थी। इसके अतिरिक्त, प्रति सेल लगभग 40 प्रक्षेप पथ उत्पन्न किए जा सकते हैं। सभी 500 प्रक्षेप पथ के आरजी ने एक छोटे मूल्य का वितरण दिखाया, मतलब आरजी 0.5 माइक्रोन (एसडी = 0.6 माइक्रोन) था, और अधिकतम-विस्थापन भी छोटे मूल्यों(चित्र 8)पर अधिक वितरित किया गया था। सभी 500 प्रक्षेप पथ को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: लंबी दूरी की प्रसार (आरजीऔर 0.5 माइक्रोन, ब्लैक प्रक्षेपवक्र) और सीमित प्रसार (आरजी<0.5 माइक्रोन, लाल प्रक्षेप पथ)।

CTAB-AuNRs की स्थिति और अभिविन्यास के अनुसार, डेटा विश्लेषण के लिए कई मापदंडों की गणना की जाती है। एसपीटी विश्लेषण के दौरान मापदंडों का विश्लेषण करने और पेश करने के लिए कई मेस हैं। पहनावा समय औसत MSD चित्रा 9A में दिखाया विश्लेषण से पता चलता है कि CTAB-AuNRs आम तौर पर α ~ 1 के साथ फैलाना । हालांकि, सभी प्रक्षेप पथ से प्राप्त डीटी-αके घनत्व वितरण से पता चलता है कि AuNRs के गतिशील ने सुपरडिफ्यूजन मोशन, ब्राउनियन मोशन और सबडिफ्यूजन मोशन(चित्रा 9B)के साथ एक विषम वितरण दिखाया ।

बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण के अलावा, एकल कण (बहु-फ्रेम) सांख्यिकीय विश्लेषण भी किया गया था। चित्रा 10 दो प्रतिनिधि दीर्घकालिक प्रक्षेप पथ दिखाता है: सीमित (आरजी= 0.34 माइक्रोन) और चलती (आरजी= 1.48 माइक्रोन)। ध्रुवीय मानचित्रण प्रक्षेपवक्र से पता चला है कि गति सीमा और सीमित AuNRs के ध्रुवीय कोण दोनों AuNRs, जिसका अर्थ है कि AuNRs और झिल्ली के बीच बातचीत मजबूत की तुलना में छोटे थे, और अधिक अपने अनुवाद और घूर्णन गतिशीलता के कारावास की सेवा । तदनुसार, दो AuNRs के टीए और ध्रुवीय कोण के हिस्टोग्राम ने अलग-अलग मोड दिखाए।

AuNRs के गति व्यवहार का आगे अध्ययन करने के लिए, समय श्रृंखला के मापदंडों का विश्लेषण किया गया, जिसमें प्रक्षेपवक्र, विस्थापन, ध्रुवीय कोण और आरजीशामिल हैं । जैसा कि चित्र 11में दिखाया गया है, समय के साथ अलग-अलग पैटर्न प्रस्तुत किए गए थे। लंबी दूरी के प्रसार AuNR के साथ तुलना में, सीमित AuNR का रोटेशन अपेक्षाकृत सीमित था, और इसके ध्रुवीय कोण अधिक केंद्रित थे, 10 डिग्री ~ 40 डिग्री की सीमा में वितरित किए गए थे। हालांकि, हालांकि चलती AuNR के समग्र आरजी सीमित AuNR के समग्र आरजी से बड़ा था, समय श्रृंखला AuNR चलती के आरजी छोटा था । प्रक्षेप पथ बिंदुओं और विस्थापन के समय-श्रृंखला वितरण के संयोजन, यह अनुमानित किया जा सकता है कि सीमित क्षेत्र में सीमित AuNR चलता है, लेकिन कम समय में इसकी गति सीमा झिल्ली पर सीमित चलती AuNR की तुलना में बड़ी है । कुल मिलाकर, ट्रांसलेशनल और घूर्णन गतिशीलता का स्थानिक विषम वितरण झिल्ली संगठन और संरचना की स्थानिक और लौकिक जटिलता के कारण होता है।

Figure 1
चित्रा 1: डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी के ऑप्टिकल पथ का योजनाबद्ध आरेख, माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयारी, और AuNRs के ध्रुवीय कोण (θ) की गणना के लिए दोहरी चैनल अंतर विधि। छवि में स्केल बार 2 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CTAB-AuNRs का लक्षण वर्णन। (A)CTAB@AuNRs की TEM छवियां । (ख)CTAB@AuNRs के एलएसपीआर स्पेक्ट्रम । (ग)एकल कण तीव्रता का वितरण: कांच (बाएं पैनल) पर CTAB@AuNRs, प्लाज्मोन झिल्ली (दाएं पैनल) पर CTAB@AuNRs । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डार्कफील्ड छवियों का प्रीट्रीटमेंट। टाइम-सीरीज रंग छवियों को "8 बिट" मोड में परिवर्तित किया गया था और उनके विपरीत समायोजित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ImageJ के साथ एकल दीर्घकालिक प्रक्षेपवक्र का निष्कर्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फिजी के साथ बहु-प्रक्षेप पथ का निष्कर्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: MATLAB के साथ AuNRs के आर/जी मूल्यों की निकासी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: फिजी के साथ ट्रैक की गई U87 एमजी सेल झिल्ली पर CTAB@AuNRs के सभी 527 प्रक्षेप पथ। दो समूह थे: लाल प्रक्षेप पथ (आरजी& 0.5 माइक्रोन) और काले प्रक्षेप पथ (आरजीऔर 0.5 माइक्रोन) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: सभी 527 प्रक्षेप पथ के बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण। आरजी (ए)और अधिकतम विस्थापन(बी)का वितरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: सभी 527 प्रक्षेप पथ का एमएसडी विश्लेषण। (A)एनसेंबल-टाइम का प्लॉट औसत एमएसडी बनाम एनएजी(बी)घनत्व भूखंड α में लॉग (डीटी)प्लेन । रंग कोड 0 (नीला) और 1 (लाल) के बीच प्रक्षेप पथ के स्थानीय घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: एकल कण सांख्यिकीय विश्लेषण। (ए-बी) दो प्रतिनिधि दीर्घकालिक ध्रुवीय मानचित्रण प्रक्षेप पथ जो ImageJ के साथ ट्रैक किए गए थे । रंग कोड 0 (हरा) और 90 (लाल) के बीच ध्रुवीय कोण मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। टर्निंग एंगल (सी-डी) और पोलर एंगल (ई-एफ) का वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: समय श्रृंखला विश्लेषण । (ए,सी) समय-मानचित्रण प्रक्षेप पथ। लाल से नीले रंग का रंग समय की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। (B,D) मापदंडों की समय-श्रृंखला: विस्थापन (नीला), ध्रुवीय कोण (हरा) और जायरन का त्रिज्या (आरजी,लाल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिका झिल्ली पर AuNRs की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल में चार भाग होते हैं, जिनमें माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग, डेटा निष्कर्षण, गतिशील पैरामीटर गणना और डेटा विश्लेषण विधियां शामिल हैं, और प्रत्येक हिस्सा लचीला और सार्वभौमिक है। इसलिए, भविष्य के कई संभावित अनुप्रयोग हैं, उदाहरण के लिए, झिल्ली पर एनपी से जुड़े झिल्ली अणुओं के आंदोलन का अध्ययन, एनपी-लेबल रिसेप्टर्स की एंडोसाइटोसिस गतिशीलता, इंट्रासेलुलर एनपीएस का गतिशील विश्लेषण और माइक्रोट्यूबल के साथ वेसिकल-लेपित एनपीएस परिवहन, आदि।

मूल कदम कोशिका झिल्ली पर AuNRs के आंदोलन को छवि बनाने के लिए DFM का उपयोग करना है। वर्तमान में, कोशिका झिल्ली गतिशीलता के विश्लेषण के लिए कई इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का विकास किया गया है, जिनमें से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है24। हालांकि, फ्लोरोसेंट जांच के फोटोब्लैचिंग गुणों से लंबे समय तक कण गतिशीलता को ट्रैक करने में असमर्थता होती है। यहां, हल्के स्थिर प्लाज्मोनिक AuNRs का उपयोग किया गया था। प्लाज्मोनिक एनपीएस15की बिखरती विशेषताओं के आधार पर कई इमेजिंग तकनीक विकसित की गई हैं । विशेष रूप से, तिरछी रोशनी मोड के साथ डीएफएम केवल नमूनों से बिखरे हुए प्रकाश एकत्र करता है, जिससे यह उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है।

AuNRs के ट्रांसलेशनल और घूर्णन गतिशीलता दोनों प्राप्त और विश्लेषण किए जाते हैं। अधिकांश अध्ययन झिल्ली पर एनपीएस के स्थितीय उतार-चढ़ाव की जांच करने और अभिविन्यास परिवर्तन25के प्रभावों की अनदेखी करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके अलावा, सेल झिल्ली विमान और इमेजिंग विमान (एक्स-वाई विमान) ज्यादातर मामलों में काफी हद तक समान हैं, और एयूएनआर और कोशिका झिल्ली के बीच बातचीत में अंतर जेड दिशा में अधिक उल्लेखनीय है। इसलिए, यहां तक कि अज़ीमुथ कोणों के बिना, ध्रुवीय कोण AuNRs और कोशिका झिल्ली के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए मूल्यवान है। डीएफएम और AuNRs के अद्वितीय ऑप्टिकल गुणों के आधार पर, दोहरे चैनल ध्रुवीकरण डीएफएम का उपयोग AuNRs(I1+ I2 सिन 2θ)19, Equation 1 26की उन्मुखीकरण जानकारी प्राप्त करनेकेलिए कियाजाताहै। फिर भी, ध्रुवीय कोणों की गणना सटीकता अधिकतम और न्यूनतम पता लगाने की तीव्रता से प्रभावित होती है जो परिवेश से दृढ़ता से प्रभावित होती है। इसलिए कुछ संशोधन किए जाने की जरूरत है। यहां, (आर-जी) का उपयोग ध्रुवीय कोण की गणना करने के लिए किया गया था, और आंतरिक संदर्भ के रूप में सेवारत जी मूल्य व्यवस्थित त्रुटियों को कुशलतापूर्वक कम कर सकता है और माप सटीकता को बढ़ा सकता है। 

महत्वपूर्ण कदम डेटा निष्कर्षण और गतिशील पैरामीटर गणना हैं, जो झिल्ली पर एनपी की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है। झिल्ली पर AuNRs के प्रक्षेप पथ को इमेजजे/फिजी का उपयोग करके अनुक्रम विश्लेषण से उच्च स्थानिक संकल्प27,28 के साथ निकाला जाता है। आर \जी मूल्यों और ध्रुवीय कोणों की गणना MATLAB(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020) केसाथ की जाती है। कई मापदंडों की गणना इसी तरह पदों और ध्रुवीय कोणों(तालिका 1)के अनुसार मैटलैब का उपयोग करके की जाती है। एसपीटी विश्लेषण में, पैरामीटर विश्लेषण और प्रदर्शन करने के कई तरीके हैं। इसलिए, एनपी की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए यथासंभव कई विश्लेषण विधियों और दृश्य उपकरणों का उपयोग करना आवश्यक है, और फिर कई विश्लेषण परिणामों से एक उपन्यास दृष्टिकोण को संक्षेप में प्रस्तुत करना और निकालना। आम तौर पर, वहां हमेशा कुछ व्यापार बनाने के लिए बंद कर रहे हैं, जो एक आसान काम नहीं है ।

एनपीएस के गतिशील राज्य और गति व्यवहार का विश्लेषण किया जा सकता है और व्यापक विश्लेषणात्मक तरीकों और बहुविध प्रस्तुति तरीकों का उपयोग करके ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित रूप से प्रस्तुत किया जा सकता है। बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करके, हम पूरे सेल झिल्ली विमान में एनपीएस की कलाकारों की टुकड़ी गति राज्य प्राप्त कर सकते हैं। फ्लोरेसेंस इमेजिंग29 पर आधारित व्यक्तिगत एनपीएस/अणुओं पर गतिशील अध्ययन ज्यादातर इस समग्र सांख्यिकीय विधि का उपयोग करते हैं क्योंकि केवल बड़ी संख्या में अल्पकालिक प्रक्षेप पथों की निगरानी की जा सकती है । हालांकि, पहनावा औसत विधि चिकनी और व्यक्तिगत विवरण की अनदेखी करेगा । एक पूरक के रूप में, एकल कण सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग व्यक्तिगत एनपीएस की गतिशील स्थिति को मात्रात्मक रूप से प्रस्तुत करने के लिए किया जाता है। इस बीच, व्यक्तिगत या सेगमेंट प्रक्षेप पथ का समय-श्रृंखला पैरामीटर विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है, जो समय के कार्य के रूप में एनपीएस के गति व्यवहार प्रदान कर सकता है।

संक्षेप में, हम एसपीटी विधि के साथ लाइव सेल झिल्ली पर AuNRs की प्रसार गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। AuNRs के गतिशील एकल नैनोपार्टिकल डीएफएम के साथ निगरानी की गई थी, जो इमेजजे और मैटलैब का उपयोग करके निकाला गया था, और व्यापक विश्लेषणात्मक तरीकों की विशेषता थी। AuNRs U87 एमजी कोशिका झिल्ली पर असामान्य प्रसार गति किया था, और इसकी गति स्थानिक विषमता से पता चलता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य प्रकार की जटिल जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए संभावित रूप से किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ने 21425519, 91853105 और 21621003 के ग्रांट नंबरों के साथ सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) Nanoseedz NR-40-650 85 nm * 40 nm
Color CMOS camera Olympus DP74 Japan
Coverslips Citoglas z10212222C 22*22 mm
Dark-field microscopy Nikon 80i upright microscope
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10099141
Fiji National Institutes of Health 2.0.0-rc-69/1.52 p a distribution of ImageJ
Grooved glass slide Sail brand 7103 Single concave
Image J National Institutes of Health 1.52 j
MATLAB MathWorks R2019b
MATLAB Code https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum essential medium (MEM) Gibco 10-010-CVR with phenol red
Minimum essential medium (MEM) Gibco 51200038 no phenol red
Origin OriginLab Origin Pro 2018C
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Plastic cell culture dishes Falcon 353002
Plastic cell culture dishes Falcon 353001 35*10 mm
U87 MG cell American Type Culture Collection ATCC HTB-14 a human primary glioblastoma cell line

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References

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सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना
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Ge, F., Xue, J., He, Y. Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy. J. Vis. Exp. (169), e61603, doi:10.3791/61603 (2021).

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