Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Hoewel replicatievorkbotsingen met DNA-adducten dubbele strengsbreuken kunnen veroorzaken, is er minder bekend over de interactie tussen replisomen en blokkerende laesies. We hebben de proximity ligation assay gebruikt om deze ontmoetingen te visualiseren en de gevolgen voor de replisoomsamenstelling te karakteriseren.

Abstract

Er is veel inzicht aanwezig in de cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken (DSB's), geïnduceerd door nucleasen, straling en andere DNA-brekers. Voor een deel weerspiegelt dit de beschikbaarheid van methoden voor de identificatie van pauzeplaatsen en de karakterisering van factoren die bij die sequenties voor DSB's zijn gerekruteerd. DSB's verschijnen echter ook als tussenproducten tijdens de verwerking van DNA-adducten gevormd door verbindingen die niet direct breuken veroorzaken en niet reageren op specifieke sequentieplaatsen. Bijgevolg zijn voor de meeste van deze middelen technologieën die de analyse van bindingsinteracties met responsfactoren en reparatie-eiwitten mogelijk maken, onbekend. DNA interstrand crosslinks (ICL's) kunnen bijvoorbeeld breuken veroorzaken na replicatievorkontmoetingen. Hoewel gevormd door geneesmiddelen die veel worden gebruikt als kankerchemotherapeutica, is er geen methodologie voor het monitoren van hun interacties met replicatie-eiwitten.

Hier beschrijven we onze strategie voor het volgen van de cellulaire reactie op vorkbotsingen met deze uitdagende adducten. We koppelden een steroïde antigeen aan psoraleen, dat fotoactivatieafhankelijke ICL's vormt in kernen van levende cellen. De ICL's werden gevisualiseerd door immunofluorescentie tegen de antigeentag. De tag kan ook een partner zijn in de Proximity Ligation Assay (PLA) die de nauwe associatie van twee antigenen rapporteert. De PLA werd gebruikt om eiwitten te onderscheiden die nauw verbonden waren met de gelabelde ICL's en eiwitten die dat niet waren. Het was mogelijk om replisoomeiwitten te definiëren die werden behouden na ontmoetingen met ICL's en andere te identificeren die verloren waren gegaan. Deze aanpak is van toepassing op elke structuur of DNA-adduct dat immunologisch kan worden gedetecteerd.

Introduction

De cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken is goed gedocumenteerd dankzij een opeenvolging van steeds krachtigere methoden om breuken naar specifieke genomische locaties te leiden 1,2,3. De zekerheid van locatie maakt een eenduidige karakterisering mogelijk van eiwitten en andere factoren die zich op de locatie ophopen en deelnemen aan de DNA Damage Response (DDR), waardoor de niet-homologe eindverbindingsroutes (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) worden aangedreven die breuken repareren. Natuurlijk worden veel pauzes geïntroduceerd door middelen zoals straling en chemische soorten die specifieke sequenties niet aanvallen4. Hiervoor zijn er echter procedures beschikbaar die de uiteinden kunnen omzetten in structuren die geschikt zijn voor tagging en lokalisatie 5,6. Onderbrekingen worden ook geïntroduceerd door biologische processen, zoals immunoglobuline-herschikking, en recente technologie maakt hun lokalisatie mogelijk, evenals7. De relatie tussen responsieve factoren en die sites kan dan worden bepaald.

Breuken verschijnen ook als een indirect gevolg van adducten gevormd door verbindingen die geen inherente brekers zijn, maar DNA-transacties zoals transcriptie en replicatie verstoren. Ze kunnen worden gevormd als een kenmerk van de cellulaire reactie op deze obstructies, misschien tijdens reparatie of omdat ze een structuur veroorzaken die kwetsbaar is voor nuclease-aanval. Meestal is de fysieke relatie tussen het adduct, de breuk en de associatie met reagerende factoren inferentieel. ICL's worden bijvoorbeeld gevormd door chemotherapeutica zoals cisplatine en Mitomycine C8 en als reactieproduct van abasisch sites9. ICL's staan bekend als krachtige blokken voor replicatievorken10, waardoor vorken worden geblokkeerd die kunnen worden gesplitst door nucleasen11. De covalente koppeling tussen strengen wordt vaak verlicht door paden met obligate breuken als tussenproducten 12,13, waardoor homologe recombinatie nodig is om de replicatievork14 opnieuw op te bouwen. In de meeste experimenten volgt de onderzoeker de reactie van factoren die van belang zijn op de breuken die worden gevormd stroomafwaarts van de botsing van een replicatievork met een ICL. Omdat er echter geen technologie is geweest voor de lokalisatie van een provocerende laesie, kan de nabijheid van het replisoom en zijn samenstellende delen tot de ICL alleen worden aangenomen.

We hebben een strategie ontwikkeld om de analyse van eiwitassociaties met niet-sequentiespecifieke covalente adducten mogelijk te maken, hier geïllustreerd door ICL's. In ons systeem worden deze geïntroduceerd door psoraleen, een fotoactief natuurproduct dat al duizenden jaren wordt gebruikt als therapeutisch middel voor huidaandoeningen15. Onze aanpak is gebaseerd op twee belangrijke kenmerken van psoralenen. De eerste is hun hoge frequentie van crosslinkvorming, die 90% van de adducten kan overschrijden, in tegenstelling tot de minder dan 10% gevormd door populaire verbindingen zoals cisplatine of Mitomycine C 8,16. De tweede is de toegankelijkheid van de verbinding tot conjugatie zonder verlies van crosslinking-capaciteit. We hebben trimethyl psoraleen covalent gekoppeld aan Digoxigenin (Dig), een lang gevestigde immunotag. Dit maakt detectie van de psoraleenadducten in genomisch DNA mogelijk door immunostaining van de Dig-tag en visualisatie door conventionele immunofluorescentie17.

Dit reagens werd in ons vorige werk toegepast op de analyse van replicatievorkontmoetingen met ICL's met behulp van een op DNA-vezels gebaseerde test16. In dat werk ontdekten we dat replicatie verder kon gaan dan een intacte ICL. Dit was afhankelijk van het ATR-kinase, dat wordt geactiveerd door replicatiestress. De herstart van de replicatie was onverwacht gezien de structuur van de CMG-replicatieve helicase. Dit bestaat uit de MCM hetero-hexamer (M) die een offset gapped ring vormt rond de sjabloonstreng voor leidende strengsynthese die wordt vergrendeld door de eiwitten van het GINS-complex (G, bestaande uit PSF1, 2, 3 en SLD5) en CDC45 (C)18. Het voorstel dat replicatie opnieuw kon starten aan de kant van de ICL-distale naar de kant van de replisoombotsing pleitte voor een verandering in de structuur van het replisoom. Om de vraag te beantwoorden welke componenten zich in het replisoom bevonden op het moment van de ontmoeting met een ICL hebben we de hier beschreven aanpak ontwikkeld. We gebruikten de Dig-tag als partner in Proximity Ligation Assays (PLA)19 om de nauwe associatie van de ICL met eiwitten van het replisoom20 te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celvoorbereiding

  1. Dag 1
    1. Voorbehandel kweekschalen met glazen bodem van 35 mm met een celkleefoplossing.
    2. Plaatcellen in de voorbehandelde schotels een dag voor de behandeling. Cel moet actief delen en 50-70% confluent zijn op de dag van het experiment.
      OPMERKING: HeLa-cellen werden in dit experiment gebruikt met Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1x penicilline / streptomycine. Er is geen beperking voor aanhangende cellijnen. Niet-hechtende cellen moeten echter op dia's worden gecentrifugeerd en voorafgaand aan de analyse door PLA worden gefixeerd.
  2. Dag 2
    1. Bereid een stamoplossing van Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) door een bevroren aliquot van eerder gesynthetiseerd Dig-TMP opnieuw te suspenderen in 1:1 EtOH:H2 O. Bepaal de concentratie door OD te meten bij 250 nm van een 100x verdunning (in H2O) van het opgeloste Dig-TMP. De extinctiecoëfficiënt van Dig-TMP is 25.000. Controleer de concentratie door vóór elk gebruik OD bij 250 nm te meten en bereken de voorraadconcentratie: Abs x 100 x 106/25.000 = Concentratie (in μM). Over het algemeen is de voorraadoplossing ongeveer 3 mM. De oplossing kan ongeveer een maand bij –20 °C worden bewaard.
      OPMERKING: Dig-TMP moet van tevoren chemisch worden gesynthetiseerd, volgens de hier beschreven procedure. Reflux 4'-chloormethyl-4,5',8-trimethylpsoraleen met 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine in tolueen onder stikstof gedurende 12 uur. Verwijder het oplosmiddel en recupereer het 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoraleenproduct door middel van silicagelchromatografie. Conjuteert het product aan digoxigenine NHS-ester in dimethylformamide en triethylamine bij 50 °C gedurende 18 uur. Verwijder het oplosmiddel en zuiver het residu door preparatieve dunne laag silicagelchromatografie. Elueer de productband chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8:1:0.1) mengsel. Verdamp de oplosmiddelen en los de pellet op in 50% EtOH:H2O.
    2. Voeg Dig-TMP-bouillon in 50% EtOH:H2O toe aan het celkweekmedium tot een eindconcentratie van 5 μM. Breng het medium op 37 °C. Zuig het medium uit de platen, voeg de voorverwarmde Dig-TMP bevattende media toe en plaats de platen gedurende 30 minuten in een incubator (37 °C, 5% CO2) om de Dig-TMP in evenwicht te brengen.
    3. Terwijl de cellen aan het broeden zijn, verwarmt u de UV-box (zie materiaaltabel) voor tot 37 °C.
    4. Plaats de platen in de voorverwarmde UV-doos en stel de cellen bloot aan een dosis van 3 J/cm2 UVA-licht gedurende 5 minuten voor dit experiment. De platen werden bovenop een thermoblok geplaatst dat tijdens de bestraling op 37 °C werd gehouden. Bereken de tijd met behulp van de formule:
      Equation 1
    5. Zuig het medium op met behulp van een pipet, voeg vers voorverwarmd medium toe en plaats de platen terug in de incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
    6. Verwijder media en was de afwas eenmaal voorzichtig met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    7. Verwijder PBS en voeg 0,1% formaldehyde (FA) toe in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Dit voorkomt celloslating tijdens CSK-R (cytoskeletextractiebuffer met RNase, beschreven in 1.2.9.) voorbehandeling die nodig is om de cytoplasmatische elementen te extraheren en de PLA-achtergrond te verminderen.
    8. Zuig FA af en was één keer met PBS.
    9. Voeg CSK-R buffer toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT om cytoplasma te verwijderen [CSK-R buffer: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 0.5%Triton X-100, 300 μg/ml RNase A]. Zuig de buffer op, voeg verse CSK-R toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Een voorraad CSK-buffer kan worden opgeslagen bij 4 °C en Triton X en RNaseA kunnen direct voor gebruik worden toegevoegd.
    10. Was driemaal met PBS.
    11. Fixeer cellen met 4% formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
    12. Was cellen met PBS. Voer deze stap drie keer uit.
    13. Voeg koude 100% methanol toe en incubeer gedurende 20 minuten bij -20 °C.
    14. Was cellen driemaal met PBS. Op dit punt kunnen cellen in PBS worden opgeslagen in een vochtige kamer bij 4 °C gedurende maximaal een week.
    15. Incubeer cellen in 80 μL van 5 mM TritonX-100 gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    16. Incubeer cellen met 100 μL van 5 mM EDTA in PBS aangevuld met 1 μL van 100 mg/ml RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    17. Was cellen driemaal met PBS.
    18. Bewaar cellen in blokkerende buffer (5% BSA en 10% geitenserum in PBS) in een vochtige kamer 's nachts bij 4 °C.

2. Nabijheidsligatietest

OPMERKING: Voer de nabijheidsligatietest uit op dag 3.

  1. Antilichaamkleuring
    1. Bereid 40 μL van de primaire antilichaamoplossing per plaat voor: Voeg het juiste volume primaire antilichamen toe om de gewenste verdunning te bereiken (muisantidigoxigenine en konijnenantilichaam tegen een replisoomcomponent zoals MCM5, CDC45, PSF1 of pMCM2, verdunningen gespecificeerd in de materiaaltabel) in de blokkeringsbuffer (om een eindvolume van 24 μl te bereiken). Mix door te tikken en laat het 20 minuten staan bij RT. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en mix door te tikken voordat je het op de putten aanbrengt.
    2. Voeg 40 μL primaire antilichaamoplossing toe aan het midden van de put en incubeer gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37 °C. Laat tijdens het kleuren de PLA-sondes en de blokkerende buffer opwarmen tot kamertemperatuur.
    3. Was cellen met PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 in 1X PBS] bij RT. Voer deze stap drie keer uit.
    4. Bereid tijdens het wassen 40 μL PLA-sondeoplossing per schaal voor (PLA-sondes bestaan uit een secundair antilichaam dat IgG van konijn of muis herkent, covalent gekoppeld aan een PLUS- of MIN-oligonucleotide): 8 μL PLA-sonde antimuis-PLUS + 8 μL PLA-sonde antikonijn-MINUS-antilichaam + 24 μL blokkeringsbuffer. Meng en laat het 20 minuten staan bij RT. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en meng goed voordat je het op de putten aanbrengt. Plaats de oplossing in het midden van de put in de plaat.
    5. Verwijder de laatste was, voeg 40 μL PLA-sondeoplossing toe aan het midden van de put en incubeer gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37 °C.
    6. Was in buffer A driemaal, gedurende 10 minuten elk, op een kantelbaar platform bij RT. Breng tijdens het wassen het ligatiemengsel naar RT.
  2. Ligatie en amplificatie
    1. Bereid 40 μL ligatiemengsel per plaat: 8 μL (5x) ligatiebouillon + 31 μL gedestilleerd water + 1 μL ligase. Bereid mastermix voor meerdere platen en meng goed voordat u het op de putten aanbrengt.
    2. Voeg 40 μL ligatieoplossing toe aan elke plaat en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige kamer bij 37 °C.
    3. Was cellen 3x met buffer A, elk gedurende 2 min, op een kantelplatform bij RT.
    4. Bereid 40 μL amplificatieoplossing per schaal: 8 μL (5x) amplificatievoorraad + 31,5 μL gedestilleerd water + 0,5 μL DNA Polymerase. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en meng goed voordat u deze op de putten aanbrengt.
    5. Voeg 40 μL amplificatieoplossing toe aan elke plaat en incubeer gedurende 100 minuten in een vochtige kamer bij 37 °C.
    6. Zuig de versterkingsoplossing af en was met buffer B. Voer 6 wasbeurten uit gedurende elk 10 minuten, op een kantelplatform bij RT.
    7. Was één keer met 0,01x buffer B gedurende 1 min bij RT.
    8. Aspireerbuffer B en incubeer platen met secundaire antilichamen, Alexa Fluor 488 antimuis IgG en Alexa Fluor 568 anti-konijn IgG in blokkerende oplossing bij geschikte verdunningen in blokkerende buffer, in een vochtige kamer, gedurende 30 minuten bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
    9. Was cellen drie keer met PBS-T, gedurende 10 minuten elk op een kantelplatform bij RT.
    10. Zuig PBS-T aan en monteer in montagemedium met DAPI. De gemonteerde platen kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of bij 4 °C in het donker worden bewaard gedurende niet langer dan 4 dagen voordat ze worden afgebeeld.

3. Beeldvorming en kwantificering

  1. Voer beeldvorming uit in een epifluorescente of confocale microscoop (als 3D-beeldvorming wenselijk is, bedek dan ten minste 3 μm in 15 stapels). Voer experimenten uit in drievoud en breng voldoende velden in beeld om ten minste 100 waarnemingen per monster of toestand te doen. Bekijk alle velden en voorbeelden, inclusief besturingselementen, met dezelfde belichtingsinstellingen.
  2. Kwantificeren met een geschikte beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel voor open source en commerciële software die deze analyse kan uitvoeren in enkele of meerdere vlakbeelden).
    1. Segmenteer celkernen op basis van de DAPI-kleuring. Voer detectie uit van nucleaire PLA-stippen. Wijs PLA-stippen toe aan hun overeenkomstige kern. Exporteer PLA-punten per kernresultaten als een csv-bestand (zie Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2).
  3. Statistische analyse (zie Materiaaltabel voor voorgestelde open source en commerciële software).
    1. Controleer of de monsters een normale verdeling volgen met een Shapiro-Wilk-test.
    2. Bepaal of er een significant verschil is tussen twee steekproeven met behulp van een Student-t-test (als aan de normale verdelingsaanname is voldaan) of een Wilcoxon-Rank Sum-test (als de normale verdelingsaanname voor een steekproef wordt geschonden).
  4. Datavisualisatie: Genereer dot plots in combinatie met box plots om datadistributie, mediaan (Q2), 25th (Q1) en 75e percentiel voor de verschillende samples te visualiseren (zie Table of Materials voor voorgestelde open source en commerciële software).

4.3D weergave van pMCM2: ICL-interacties

  1. Afbeelding PLA platen op een draaiende schijf confocale microscoop, met behulp van een Plan Fluor 60x/1.25 numerieke diafragma olie objectief. Schaf 16 stapels van 1,6 mm aan en genereer de 3D-reconstructie met de juiste beeldanalysesoftware (zie materiaaltabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA van Dig-TMP met replisome eiwitten
De structuur van de Dig-TMP is weergegeven in figuur 1. De details van de synthese, waarbij trimethylpsoraleen via een glycollinker werd geconjugeerd aan digoxigenine, zijn eerder besproken17,21. Incubatie van cellen met de verbinding gevolgd door blootstelling aan 365 nm licht (UVA) fotoactiveert de verbinding en drijft de crosslinkingreactie aan. Iets meer dan 90% van de adducten zijn ICLs16. De Dig-tag kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie die de aanwezigheid van ICL's in de kern onthult (figuur 2). Immunofluorescentie van een replisoomeiwit zoals MCM2 duidt ook op een verdeling door de kern, een verdeling die niet wordt beïnvloed door de introductie van ICL's. Deze resultaten toonden aan dat het focale uiterlijk van reagerende eiwitten, zoals gezien in de DNA Damage Response (DDR) op DSB's, geen kenmerk is van replisoom: ICL-interacties.

Om de interactie van replisomen met ICL's in het experiment in Fig 2 te visualiseren, hebben we de PLA toegepast, die de nabijheid van twee antigenen rapporteert (Figuur 3a). We hebben de associatiefrequentie van MCM5 en de Dig-tag 1 uur gemeten na introductie van de ICL's (figuur 3b). De PLA-signalen toonden de nabijheid van replisomen tot ICL's.

Replicatiestress, inclusief die van ICL's, activeert het ATR-kinase22. Onder de vele substraten van ATR zijn MCM-eiwitten, waaronder MCM2 bij serine 10823. Een replisoomontmoeting met de ICL zou naar verwachting resulteren in de fosforylering van MCM2, naast vele andere substraten. In overeenstemming met deze verwachting was de PLA tussen pMCM2Ser108 en de Dig-tag positief (figuur 3c). In andere experimenten vonden we dat de plateaufrequentie werd bereikt na 1 h20. We interpreteerden deze resultaten als een indicatie dat replisomen die zich op verschillende manieren in het genoom bevinden en variabel ver van een ICL verwijderd zijn, uiteindelijk het blok tegenkomen, waardoor ATR-activering en MCM2-fosforylering worden geactiveerd.

De PLA-resultaten in de voorgaande figuren worden gepresenteerd als een gecomprimeerde optelsom van meerdere optische vlakken. De resultaten van individuele kernen kunnen echter ook worden gepresenteerd in een driedimensionale reconstructie, zoals getoond voor de pMCM2: Dig-TMP PLA in Video 1. Deze analyse gaf aan dat replisoomontmoetingen met de ICL's in de hele kern konden worden waargenomen.

Onze studie van replicatievork toonde aan dat ICL-ontmoetingen een onverwacht replicatieherstartfenomeen onthulden16. Gezien de gesloten ringstructuur van een functioneel replisoom, was het van groot belang om te vragen of de samenstelling van het replicatieapparaat veranderde bij een botsing met een ICL. Aangezien minder dan 10% van de replicatievorken contact maakt met een ICL, zou het simpelweg testen van de eiwitsamenstelling van alle replisomen niet productief zijn geweest. De PLA tussen Dig en verschillende componenten stelde ons echter in staat om deze vraag te beantwoorden. In tegenstelling tot de positieve resultaten met pMCM2, vonden we dat de eiwitten van het GINS-complex geen PLA-signaal gaven met de ICLs. Aan de andere kant was de test met CDC45 positief, wat aangeeft dat het andere vergrendelingseiwit behouden bleef (figuur 4a,b). Wanneer cellen werden geïncubeerd met een remmer van ATR, werd de herstart volledig onderdrukt en was de GINS: Dig PLA sterk positief (figuur 4c). Onze interpretatie van deze resultaten was dat bij afwezigheid van ATR-activiteit de GINS-eiwitten werden behouden, de CMG-helicase in een vergrendelde configuratie bleef en er geen replicatieherstart was na de ICL20.

Figure 1
Figuur 1: Structuur van trimethyl psoraleen gekoppeld aan het digoxigenine antigeen tag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Immunofluorescentie van replisoomeiwit MCM5 en DIG TMP vertoont geen discrete foci. Cellen werden behandeld met Dig-TMP en UVA en na 1 uur immunogekleurd voor MCM5 en Dig. De witte balk vertegenwoordigt 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: PLA tussen Dig-TMP en MCM5. a) Schema van de proximity ligation assay toegepast op de interactie tussen het MCM5 replisome eiwit en de Dig tag op de ICL. De regeling wordt vereenvoudigd. In de praktijk werden primaire antilichamen gebonden door secundaire antilichamen die covalent gekoppeld waren aan de oligonucleotiden. b) PLA tussen MCM5 en Dig-TMP. Let op de discrete signalen die plaatsen van interactie aangeven. Punt- en doosdiagrammen met signaalverdeling (dot plot) en de mediaan (box plot rode balk), de 25e en 75e percentielen (box ends) en dehoogste en laagste waarden exclusief uitschieters (extreme lijnen). Wilcoxon-Rank Sum-test bevestigde dat er een significant verschil is tussen de twee voorwaarden (p<0,001). De witte balken vertegenwoordigen 5 μm. (c) PLA tussen pMCM2 en Dig-TMP. Deze signalen vertegenwoordigen de ontmoeting van het replisoom met de ICL, die een ATR-afhankelijke fosforylering van MCM2 veroorzaakt. De PLA rapporteert de variabiliteit van de ontmoetingsfrequentie in verschillende cellen. De witte balk vertegenwoordigt 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: PLA tussen Dig-TMP en de replisome locking proteins. (a) CDC45: Dig-TMP. De witte balk vertegenwoordigt 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. De minimale signaalfrequentie wordt sterk verhoogd door behandeling met een ATR-remmer, die de traverseroute en de afgifte van het GINS-complex met PSF1 blokkeert. De witte balken vertegenwoordigen 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Driedimensionale reconstructie van pMCM2: Dig PLA-signalen toont de verdeling door de kern. PCNA is groen gekleurd, PLA rood, DAPI blauw. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Cellprofiler-pijplijn voor PLA-kwantificering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: IMARIS celmodule batchparameters voor PLA-kwantificering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel de PLA een zeer krachtige techniek is, zijn er technische problemen die moeten worden opgelost om duidelijke en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De antilichamen moeten een hoge affiniteit en specificiteit hebben. Verder is het belangrijk om de niet-specifieke achtergrondsignalen zoveel mogelijk te beperken. We hebben ontdekt dat membranen en cellulair puin bijdragen aan de achtergrond en we hebben ze zoveel mogelijk verwijderd. De wasbeurten met wasmiddel met buffers voorafgaand aan het fixeren en de was met methanol na het fixeren helpen de niet-specifieke binding te verminderen. Het voorbehoud is dat wasmiddelbehandeling voorafgaand aan fixatie kan leiden tot celloslating. We vinden dat het behandelen van de platen met een cellijm en voorvoegsel met 0,1% FA vóór de CSK-behandeling dit probleem verlicht.

Het is ook nuttig om niet-S-fasecellen te identificeren bij het monitoren van S-fasespecifieke gebeurtenissen. Dit kan door post PLA kleuring met celcyclusmarkers zoals PCNA of NPAT24,25. Deze markers bevestigen niet alleen S-faseverschijnselen, maar bieden ook een interne biologische controle voor niet-specifieke interacties. Positieve signalen in G1-fasecellen, in assays die gebeurtenissen meten die exclusief voor de S-fase zouden moeten zijn, zijn een indicatie dat extra inspanning nodig is om niet-specifieke interacties te verminderen.

Single cell imaging strategieën hebben voordelen die niet beschikbaar zijn met andere benaderingen voor het monitoren van moleculaire interacties. Homogenisatietechnieken, zoals gebruikt in immunoprecipitatie-experimenten, elimineren elk verband met gebeurtenissen in individuele cellen. Hierdoor gaat inzicht in de invloed van de celcyclusstatus, of de variabiliteit over een celpopulatie, verloren. Omdat de PLA echter gebeurtenisfrequenties in individuele cellen rapporteert, kunnen deze inzichten worden hersteld.

Een frequente beperking van de PLA is het ontbreken van immunologische detectiereagentia voor doelwitten van belang. Dit is een punt van zorg bij het beantwoorden van vragen over de cellulaire reactie op DNA-verstoringen die worden geïntroduceerd door andere middelen dan directe brekers. We hebben die beperking overwonnen door het gebruik van een immunotagged DNA-reactief reagens. Hoewel we onze studies hebben gericht op interstrand crosslinks, zijn er veel genotoxische verbindingen, waaronder chemotherapiegeneesmiddelen, die zich voor deze aanpak zouden lenen. Daarnaast kunnen interacties tussen eiwitten en DNA-structuren, zoals G quadruplexen, ook onderzocht worden met deze strategie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH, National Institute on Aging, Verenigde Staten (Z01-AG000746-08). J.H. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundations of China (21708007 en 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Biologie replisome blocking laesion PLA proximity ligation assay DNA interstrand crosslinks antigen-tagged crosslinks

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter