Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

DNA adduktları ile replikasyon çatalı çarpışmaları çift iplikçik kopmalarına neden olabilirken, replikomlar ve bloke edici lezyonlar arasındaki etkileşim hakkında daha az şey bilinmektedir. Bu karşılaşmaları görselleştirmek ve replisome kompozisyonunun sonuçlarını karakterize etmek için yakınlık ligasyon testini kullandık.

Abstract

Nükleazlar, radyasyon ve diğer DNA kırıcılar tarafından indüklenen çift iplikçik kırılmalarına (DSB'ler) hücresel yanıt hakkında önemli bilgiler mevcuttur. Bu kısmen, kırılma yerlerinin tanımlanması için yöntemlerin kullanılabilirliğini ve bu dizilerde DSB'lere alınan faktörlerin karakterizasyonunu yansıtır. Bununla birlikte, DSB'ler, doğrudan kırılmalara neden olmayan ve belirli sekans bölgelerinde reaksiyona girmeyen bileşikler tarafından oluşturulan DNA adduktlarının işlenmesi sırasında ara ürünler olarak da görünür. Sonuç olarak, bu ajanların çoğu için, yanıt faktörleri ile bağlanma etkileşimlerinin analizine ve onarım proteinlerine izin veren teknolojiler bilinmemektedir. Örneğin, DNA interstrand çapraz bağları (ICL'ler), replikasyon çatalı karşılaşmalarını takiben kırılmalara neden olabilir. Kanser kemoterapötikleri olarak yaygın olarak kullanılan ilaçlar tarafından oluşturulmasına rağmen, replikasyon proteinleri ile etkileşimlerini izlemek için herhangi bir metodoloji bulunmamaktadır.

Burada, bu zorlu adduct'larla çatal çarpışmalarına hücresel tepkiyi takip etme stratejimizi açıklıyoruz. Bir steroid antijenini, canlı hücrelerin çekirdeklerinde fotoaktivasyona bağımlı ICL'ler oluşturan psoralen'e bağladık. ICL'ler antijen etiketine karşı immünofloresan ile görselleştirildi. Etiket ayrıca iki antijenin yakın ilişkisini bildiren Yakınlık Ligasyon Testi'nde (PLA) bir ortak olabilir. PLA, etiketlenmiş ICL'lerle yakından ilişkili olan proteinleri olmayanlardan ayırt etmek için kullanıldı. ICL'lerle karşılaştıktan sonra tutulan replisome proteinleri tanımlamak ve kaybolan diğerlerini tanımlamak mümkündü. Bu yaklaşım, immünolojik olarak tespit edilebilen herhangi bir yapı veya DNA katkısı için geçerlidir.

Introduction

Çift iplikçik kopmalarına hücresel yanıt, kopmaları spesifik genomik bölgelere yönlendirmek için giderek daha güçlü yöntemlerin art arda gelmesi nedeniyle iyi belgelenmiştir 1,2,3. Konumun kesinliği, bölgede biriken ve DNA Hasar Yanıtına (DDR) katılan proteinlerin ve diğer faktörlerin kesin karakterizasyonunu sağlar, böylece kırılmaları onaran Homolog Olmayan Son Birleştirme (NHEJ) ve Homolog Rekombinasyon (HR) yollarını yönlendirir. Tabii ki, birçok kırılma, radyasyon ve belirli dizilere saldırmayan kimyasal türler gibi ajanlar tarafından tanıtılır4. Bununla birlikte, bunlar için uçları etiketleme ve yerelleştirme için uygun yapılara dönüştürebilen prosedürler mevcuttur 5,6. Kırılmalar, immünoglobulinin yeniden düzenlenmesi gibi biyolojik süreçlerle de ortaya çıkar ve son teknoloji, lokalizasyonlarına da izin verir7. Yanıt veren faktörler ve bu siteler arasındaki ilişki daha sonra belirlenebilir.

Kırılmalar ayrıca, doğal kırıcılar olmayan, ancak transkripsiyon ve replikasyon gibi DNA işlemlerini bozan bileşikler tarafından oluşturulan adduktların dolaylı bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bu tıkanıklıklara hücresel yanıtın bir özelliği olarak, belki onarım sırasında veya nükleaz saldırısına karşı savunmasız bir yapıyı tetikledikleri için oluşabilirler. Tipik olarak, addukt, mola ve yanıt veren faktörlerle ilişki arasındaki fiziksel ilişki çıkarımsaldır. Örneğin, ICL'ler sisplatin ve Mitomisin C8 gibi kemoterapötikler tarafından ve abazik bölgeler9'un bir reaksiyon ürünü olarak oluşturulur. ICL'ler, replikasyon çatalları10'a güçlü bloklar olarak bilinir, böylece nükleazlar11 tarafından bölünebilen çatalları durdurur. İplikçikler arasındaki kovalent bağlantı genellikle ara12,13 olarak zorunlu kırılmalara sahip yollar tarafından rahatlatılır ve replikasyon çatalı14'ü yeniden oluşturmak için homolog rekombinasyon gerektirir. Çoğu deneyde araştırmacı, bir replikasyon çatalının bir ICL ile çarpışmasının aşağı yönünde oluşan kırılmalara ilgi faktörlerinin tepkisini takip eder. Bununla birlikte, provokatif bir lezyonun lokalizasyonu için herhangi bir teknoloji bulunmadığından, replisome'un ve bileşen parçalarının ICL'ye yakınlığı ancak varsayılabilir.

Burada ICL'ler tarafından gösterilen, sekansa özgü olmayan kovalent katkılarla protein ilişkilerinin analizini sağlamak için bir strateji geliştirdik. Sistemimizde bunlar, binlerce yıldır cilt bozuklukları için terapötik olarak kullanılan fotoaktif bir doğal ürün olan psoralen tarafından tanıtılmaktadır15. Yaklaşımımız psoralenslerin iki önemli özelliğine dayanmaktadır. Birincisi, sisplatin veya Mitomisin C 8,16 gibi popüler bileşiklerin oluşturduğu% 10'dan azının aksine, adduktların% 90'ını aşabilen yüksek çapraz bağlantı oluşum sıklığıdır. İkincisi, bileşiğin çapraz bağlama kapasitesi kaybı olmadan konjugasyona erişilebilirliğidir. Trimetil psoralen'i kovalent olarak uzun zamandır kurulmuş bir immünoetiket olan Digoxigenin'e (Dig) bağladık. Bu, genomik DNA'daki psoralen adduktlarının Dig etiketinin immünoboyaması ile tespit edilmesini ve konvansiyonel immünofloresan17 ile görselleştirilmesini sağlar.

Bu reaktif, önceki çalışmamızda, DNA lifi bazlı bir tahlil16 kullanılarak ICL'lerle replikasyon çatalı karşılaşmalarının analizine uygulandı. Bu çalışmada, replikasyonun bozulmamış bir ICL'den sonra devam edebileceğini bulduk. Bu, replikasyon stresi ile aktive olan ATR kinazına bağlıydı. CMG replikatif helikazın yapısı göz önüne alındığında replikasyon yeniden başlatma beklenmiyordu. Bu, GINS kompleksinin (PSF1, 2, 3 ve SLD5'ten oluşan G) ve CDC45 (C)18'in proteinleri tarafından kilitlenen lider iplik sentezi için şablon ipliği etrafında ofset aralıklı bir halka oluşturan MCM hetero-heksamerinden (M) oluşur. Replikasyonun, ICL distal tarafında, replisome çarpışmasının yanına kadar yeniden başlayabileceği önerisi, replisome'un yapısında bir değişiklik yapılmasını savundu. Bir ICL ile karşılaşma sırasında hangi bileşenlerin yanıt verdiği sorusunu ele almak için, burada açıklanan yaklaşımı geliştirdik. Dig etiketini, ICL'nin replisome20'nin proteinleriyle yakın ilişkisini sorgulamak için Proximity Ligation Assays'da (PLA)19'da bir ortak olarak kullandık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre hazırlığı

  1. 1. Gün
    1. 35 mm'lik cam tabanlı kültür tabaklarını hücre yapıştırıcı çözeltisi ile ön işlemden geçirin.
    2. Tedaviden bir gün önce önceden işlenmiş bulaşıklardaki plaka hücreleri. Hücre deney gününde aktif olarak bölünmeli ve% 50-70 oranında birleşmelidir.
      NOT: Bu deneyde HeLa hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta DMEM ile kullanılmıştır. Yapışkan hücre hatları için herhangi bir kısıtlama yoktur. Bununla birlikte, yapışkan olmayan hücreler slaytlar üzerine santrifüj edilmeli ve PLA tarafından analizden önce sabitlenmelidir.
  2. 2. Gün
    1. Daha önce sentezlenmiş Dig-TMP'nin dondurulmuş bir alikotunu 1: 1 EtOH: H 2 O'da yeniden askıya alarak bir Digoxigenin Trimetil psoralen (Dig-TMP) stok çözeltisi hazırlayın. çözünmüş Dig-TMP'nin 100x seyreltmesinin (H2O cinsinden) 250 nm'de OD'yi ölçerek konsantrasyonu belirleyin. Dig-TMP'nin yok olma katsayısı 25.000'dir. Her kullanımdan önce OD'yi 250 nm'de ölçerek konsantrasyonu doğrulayın ve stok konsantrasyonunu hesaplayın: Abs x 100 x 106/25.000 = Konsantrasyon (μM cinsinden). Genel olarak, stok çözeltisi yaklaşık 3 mM'dir. Çözelti yaklaşık bir ay boyunca –20 ° C'de saklanabilir.
      NOT: Dig-TMP, burada açıklanan prosedürü izleyerek önceden kimyasal olarak sentezlenmelidir. Reflü 4'-klorometil-4,5',8-trimetilpsoralen, 12 saat boyunca azot altında toluen içinde 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanidi-amin ile. Çözücüyü çıkarın ve silika jel kromatografisi ile 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoralen ürününü geri kazanın. Ürünü, 18 saat boyunca 50 ° C'de dimetil formamid ve trietilamin içinde digoxigenin NHS esterine konjuge edin. Çözücüyü çıkarın ve hazırlayıcı ince tabaka silika jel kromatografisi ile kalıntıyı saflaştırın. Ürün bandı kloroformunu elute edin: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı. Solventleri buharlaştırın ve peleti %50 EtOH:H2O içinde çözün.
    2. Dig-TMP stoğunu% 50 EtOH: H2O'da hücre kültürü ortamına 5 μM'lik son bir konsantrasyona kadar ekleyin. Ortamı plakalardan aspire edin, önceden ısıtılmış Dig-TMP içeren ortamı ekleyin ve Dig-TMP'nin dengelenmesini sağlamak için plakaları 30 dakika boyunca bir inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin.
    3. Hücreler inkübe edilirken, UV kutusunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye önceden ısıtın.
    4. Plakaları önceden ısıtılmış UV kutusuna yerleştirin ve hücreleri bu deney için 5 dakika boyunca 3 J /cm2 UVA ışığı dozuna maruz bırakın. Plakalar, ışınlama sırasında 37 ° C'de tutulan bir termo-bloğun üzerine yerleştirildi. Formülü kullanarak zamanı hesaplayın:
      Equation 1
    5. Bir pipet kullanarak ortamı aspire edin, taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve plakaları inkübatöre 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 5 CO2'de geri yerleştirin.
    6. Ortamı çıkarın ve bulaşıkları fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez nazikçe yıkayın.
    7. PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca PBS'ye% 0.1 formaldehit (FA) ekleyin. Bu, sitoplazmik elementleri çıkarmak ve PLA arka planını azaltmak için gereken CSK-R (RNaz içeren sitoiskelet ekstraksiyon tamponu, 1.2.9'da tarif edilmiştir.) ön işlemi sırasında hücre ayrılmasını önler.
    8. FA'dan kurtulun ve bulaşıkları PBS ile bir kez yıkayın.
    9. CSK-R tamponu ekleyin ve sitoplazmayı çıkarmak için RT'de 5 dakika inkübe edin [CSK-R tamponu: 10 mM BORULAR, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2, %0.5 Triton X-100, 300 μg/mL RNaz A]. Arabelleği aspire edin, taze CSK-R ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: CSK tampon stoğu 4 °C'de saklanabilir ve kullanımdan hemen önce Triton X ve RNaseA eklenebilir.
    10. PBS ile üç kez yıkayın.
    11. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 formaldehit içeren hücreleri sabitleyin.
    12. PBS ile hücreleri yıkayın. Bu adımı üç kez gerçekleştirin.
    13. Soğuk% 100 metanol ekleyin ve -20 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    14. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Bu noktada hücreler PBS'de 4 °C'de nemli bir odada bir haftaya kadar saklanabilir.
    15. Hücreleri 80 μL 5 mM TritonX-100'de 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
    16. PBS'de 100 μL 5 mM EDTA içeren hücreleri, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 1 μL 100 mg / mL RNaz A ile desteklenmiş olarak inkübe edin.
    17. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
    18. Hücreleri bloke edici tamponda (PBS'de% 5 BSA ve% 10 keçi serumu) 4 ° C'de bir gece boyunca nemli bir odada saklayın.

2. Yakınlık ligasyon testi

NOT: 3. Günde yakınlık ligasyon testi yapın.

  1. Antikor boyama
    1. Plaka başına 40 μL birincil antikor çözeltisi hazırlayın: İstenilen seyreltmeyi elde etmek için uygun miktarda birincil antikorları ekleyin (MCM5, CDC45, PSF1 veya pMCM2 gibi replisome bir bileşene karşı fare anti Digoxigenin ve tavşan antikoru, Malzeme Tablosunda belirtilen seyreltmeler) bloke tamponuna (24 μL'lik nihai hacme ulaşmak için). Dokunarak karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce dokunarak karıştırın.
    2. Kuyunun merkezine 40 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca nemli bir odada inkübe edin. Boyama sırasında, PLA problarının ve bloke edici tamponun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
    3. RT'de PBS-T [PBS-T: 1X PBS'de% 0.05 Ara-20] ile hücreleri yıkayın.
    4. Yıkarken bulaşık başına 40 μL PLA probu çözeltisi hazırlayın (PLA probları, bir PLUS veya MINUS oligonükleotidine kovalent olarak bağlı tavşan veya fare IgG'sini tanıyan ikincil bir antikordan oluşur): 8 μL PLA probu anti mouse-PLUS + 8 μL PLA probu anti tavşan-EKSI antikoru + 24 μL bloke tamponu. Karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın. Çözeltiyi plakadaki kuyunun ortasına yerleştirin.
    5. Son yıkamayı çıkarın, kuyunun ortasına 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat nemli bir odada inkübe edin.
    6. Tamponda yıkayın RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez. Yıkama sırasında, ligasyon karışımını RT'ye getirin.
  2. Ligasyon ve amplifikasyon
    1. Plaka başına 40 μL Ligasyon karışımı hazırlayın: 8 μL (5x) ligasyon stoğu + 31 μL damıtılmış su + 1 μL ligaz. Birden fazla plaka için ana karışımı hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
    2. Her plakaya 40 μL ligasyon çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca nemli bir odada inkübe edin.
    3. RT'de eğilebilen bir platformda hücreleri tampon A ile her biri 2 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
    4. Çanak başına 40 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlayın: 8 μL (5x) amplifikasyon stoğu + 31.5 μL damıtılmış su + 0.5 μL DNA Polimeraz. Birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
    5. Her plakaya 40 μL amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve 100 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir odada inkübe edin.
    6. Amplifikasyon çözeltisini aspire edin ve tampon B ile yıkayın. RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca 6 yıkama yapın.
    7. RT'de 1 dakika boyunca 0.01x tampon B ile bir kez yıkayın.
    8. Tampon B'yi aspire edin ve ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke edici çözelti içinde ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke eden çözeltide, bloke edici tamponda, nemli bir odada, 37 ° C'de 30 dakika veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin.
    9. PBS-T ile hücreleri RT'de eğilebilir bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    10. PBS-T'yi aspire edin ve DAPI ile montaj ortamına monte edin. Monte edilen plakalar hemen görüntülenebilir veya görüntülemeden önce karanlıkta en fazla 4 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

3. Görüntüleme ve nicelleştirme

  1. Bir epifloresan veya konfokal mikroskopta görüntüleme yapın (3D görüntüleme isteniyorsa, 15 yığında en az 3 μm örtün). Üçlü deneyler yapın ve numune veya koşul başına en az 100 gözlem yapmak için yeterli sayıda alanı görüntüleyin. Aynı pozlama ayarlarını kullanarak kontroller de dahil olmak üzere tüm alanları ve örnekleri görüntüleyin.
  2. Uygun bir görüntü analiz yazılımı ile sayısallaştırın (bu analizi tek veya çoklu düzlem görüntülerinde gerçekleştirebilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
    1. DAPI boyamasına dayalı hücre çekirdeklerini segmentlere ayırın. Nükleer PLA noktalarının tespitini gerçekleştirin. PLA noktalarını karşılık gelen çekirdeklerine atayın. Çekirdek başına PLA noktalarını csv dosyası olarak dışa aktarın (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2).
  3. İstatistiksel analiz (önerilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
    1. Numunelerin Shapiro-Wilk testi ile normal bir dağılımı takip edip etmediğini doğrulayın.
    2. Bir Student-t testi (normal dağılım varsayımı karşılanıyorsa) veya Wilcoxon-Rank Sum testi (bir örnek için normal dağılım varsayımı ihlal edilmişse) kullanarak iki örnek arasında anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyin.
  4. Veri görselleştirme: Farklı örnekler için veri dağılımını, medyan (Q2), 25. (Q 1) ve 75. yüzdelik dilimi görselleştirmek için kutu grafikleriyle birleştirilmiş nokta grafikleri oluşturun (Önerilen açık kaynak ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakın).

pMCM2'nin 4.3D gösterimi: ICL etkileşimleri

  1. Plan Fluor 60x/1.25 sayısal diyaframlı yağ hedefi kullanarak dönen diskli konfokal mikroskop üzerinde PLA plakalarını görüntüleyin. 1,6 mm'yi kapsayan 16 yığın elde edin ve uygun görüntü analiz yazılımıyla 3B rekonstrüksiyonu oluşturun (bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sürüngen proteinler ile Dig-TMP'nin PLA'sı
Dig-TMP'nin yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir. Trimetil psoralenin bir glikol bağlayıcı aracılığıyla digoxigenin'e konjuge edildiği sentezin detayları daha öncetartışılmıştı 17,21. Hücrelerin bileşik ile inkübasyonu ve ardından 365 nm ışığa (UVA) maruz kalmak, bileşiği fotoaktive eder ve çapraz bağlama reaksiyonunu yönlendirir. Adducts'un% 90'ından biraz fazlası ICL'lerdir16. Dig etiketi, çekirdek boyunca ICL'lerin varlığını ortaya koyan immünofloresan ile görselleştirilebilir (Şekil 2). MCM2 gibi bir replisome proteinin immünofloresansı, ICL'lerin girişinden etkilenmeyen bir dağılım olan çekirdek boyunca bir dağılımı da gösterir. Bu sonuçlar, DSB'lere DNA Hasar Yanıtı'nda (DDR) görüldüğü gibi, yanıt veren proteinlerin odak görünümünün, yanıtın bir özelliği olmadığını göstermiştir: ICL etkileşimleri.

Şekil 2'de gösterilen deneyde yanıtlayıcıların ICL'lerle etkileşimini görselleştirmek için, iki antijenin yakınlığını bildiren PLA'yı uyguladık (Şekil 3a). ICL'lerin uygulanmasından 1 saat sonra MCM5 ve Dig etiketinin ilişki sıklığını ölçtük (Şekil 3b). PLA sinyalleri, yanıtların ICL'lere yakınlığını gösterdi.

ICL'ler tarafından sunulanlar da dahil olmak üzere çoğaltma stresi, ATR kinaz22'yi aktive eder. ATR'nin birçok substratı arasında, serin 10823'teki MCM2 de dahil olmak üzere MCM proteinleri bulunur. ICL ile tekrarlanabilir bir karşılaşmanın, diğer birçok substratın yanı sıra MCM2'nin fosforilasyonuna neden olması beklenir. Bu beklentiye uygun olarak, pMCM2Ser108 ile Dig etiketi arasındaki PLA pozitifti (Şekil 3c). Diğer deneylerde plato frekansına 1 saat20'de ulaşıldığını bulduk. Bu sonuçları, genom boyunca çeşitli şekillerde yerleştirilmiş ve bir ICL'den değişken olarak uzak olan replisomelerin sonunda blokla karşılaştığını, ATR aktivasyonunu ve MCM2 fosforilasyonunu tetiklediğini gösteren olarak yorumladık.

Önceki şekillerdeki PLA sonuçları, çoklu optik düzlemlerin sıkıştırılmış bir toplamı olarak sunulmaktadır. Bununla birlikte, bireysel çekirdeklerden elde edilen sonuçlar, Video 1'deki pMCM2: Dig-TMP PLA için gösterildiği gibi üç boyutlu bir rekonstrüksiyonda da sunulabilir. Bu analiz, ICL'lerle replisome karşılaşmaların çekirdek boyunca gözlemlenebileceğini göstermiştir.

Replikasyon çatalı çalışmamız, ICL karşılaşmalarının beklenmedik bir replikasyon yeniden başlatma fenomeni16'yı ortaya çıkardığını göstermiştir. İşlevsel bir yanıtın kilitli halka yapısı göz önüne alındığında, replikasyon aparatının bileşiminin bir ICL ile çarpıştığında değişip değişmediğini sormak oldukça ilgi çekiciydi. Replikasyon çatallarının% 10'undan azı bir ICL ile temas ettiğinden, tüm replisomelerin protein bileşimini basitçe analiz etmek üretken olmazdı. Bununla birlikte, Dig ve çeşitli bileşenler arasındaki PLA bu soruyu ele almamıza izin verdi. pMCM2 ile elde edilen olumlu sonuçların aksine, GINS kompleksinin proteinlerinin ICL'lerle PLA sinyali veremediğini bulduk. Öte yandan, CDC45 ile yapılan tahlil pozitifti, bu da diğer kilitleme proteininin tutulduğunu gösteriyordu (Şekil 4a,b). Hücreler bir ATR inhibitörü ile inkübe edildiğinde, yeniden başlatma tamamen bastırıldı ve GINS: Dig PLA güçlü bir şekilde pozitifti (Şekil 4c). Bu sonuçları yorumlamamız, ATR aktivitesinin yokluğunda GINS proteinlerinin tutulduğu, CMG helikazın kilitli bir konfigürasyonda kaldığı ve ICL20'den sonra replikasyon yeniden başlatma olmadığı yönündeydi.

Figure 1
Şekil 1: Digoxigenin antijen etiketine bağlı trimetil psoralenin yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Replisome protein MCM5 ve DIG TMP'nin immünofloresansı ayrık odaklar göstermez. Hücreler Dig-TMP ve UVA ile tedavi edildi ve 1 saat sonra MCM5 ve Dig için immün boya uygulandı. Beyaz çubuk 5 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Dig-TMP ve MCM5 arasındaki PLA. (a) MCM5 replisome proteini ile ICL üzerindeki Dig etiketi arasındaki etkileşime uygulanan Proximity Ligation Assay'ın şeması. Şema basitleştirilmiştir. Pratikte primer antikorlar, oligonükleotidlere kovalent olarak bağlanmış sekonder antikorlar tarafından bağlandı. (b) MCM5 ve Dig-TMP arasındaki PLA. Etkileşim alanlarını gösteren ayrık sinyallere dikkat edin. Sinyal dağılımını (nokta grafiği) ve medyanı (kutu grafiği kırmızı çubuk), 25. ve 75. yüzdelik dilimleri (kutu uçları) ve aykırı değerler (aşırı çizgiler) hariç enyüksek ve en düşük değerleri gösteren nokta ve kutu grafikleri. Wilcoxon-Rank Sum testi, iki koşul arasında anlamlı bir fark olduğunu doğruladı (p<0.001). Beyaz çubuklar, pMCM2 ve Dig-TMP arasında 5 μm. (c) PLA'yı temsil eder. Bu sinyaller, MCM2'nin ATR'ye bağımlı fosforilasyonunu tetikleyen ICL ile replisome'un karşılaşmasını temsil eder. PLA, farklı hücrelerdeki karşılaşma sıklığının değişkenliğini bildirir. Beyaz çubuk 5 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Dig-TMP ve replisome kilitleme proteinleri arasındaki PLA. (a) CDC45: Dig-TMP. Beyaz çubuk 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP'yi temsil eder. Minimum sinyal frekansı, çapraz yolu bloke eden bir ATR inhibitörü ve PSF1 içeren GINS kompleksinin salınımı ile tedavi edilerek büyük ölçüde arttırılır. Beyaz çubuklar 5 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: pMCM2'nin üç boyutlu rekonstrüksiyonu: PLA sinyallerini kazmak, çekirdek boyunca dağılımı gösterir. PCNA yeşil, PLA kırmızı, DAPI mavi renkte boyanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: PLA ölçümü için hücre profili işlem hattı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: PLA ölçümü için IMARIS hücre modülü toplu iş parametreleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PLA çok güçlü bir teknik olmasına rağmen, net ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çözülmesi gereken teknik kaygılar vardır. Antikorlar yüksek afinite ve özgüllükte olmalıdır. Ayrıca, spesifik olmayan arka plan sinyallerini mümkün olduğunca azaltmak önemlidir. Membranların ve hücresel kalıntıların arka plana katkıda bulunduğunu bulduk ve bunları mümkün olduğunca çıkardık. Sabitlemeden önce deterjan içeren tamponlarla yapılan yıkamalar ve sabitlemeden sonra metanol ile yıkama, spesifik olmayan bağlanmayı azaltmaya yardımcı olur. Uyarı, fiksasyondan önce deterjan tedavisinin hücre ayrılmasına neden olabileceğidir. CSK tedavisinden önce plakaların bir hücre yapıştırıcısı ile muamele edilmesinin ve ön ekinlerin% 0.1 FA ile öneklenmesinin bu sorunu hafiflettiğini bulduk.

S fazına özgü olayları izlerken S faz olmayan hücreleri tanımlamak da yararlıdır. Bu, PCNA veya NPAT24,25 gibi hücre döngüsü belirteçleri ile PLA boyama sonrası yapılabilir. Bu belirteçler sadece S faz fenomenini doğrulamakla kalmaz, aynı zamanda spesifik olmayan etkileşimler için dahili bir biyolojik kontrol sağlar. G1 faz hücrelerindeki pozitif sinyaller, S fazına özgü olması gereken olayları ölçen testlerde, spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için ek çaba sarf edilmesinin gerekli olduğunun bir göstergesidir.

Tek hücreli görüntüleme stratejileri, moleküler etkileşimleri izlemek için diğer yaklaşımlarla birlikte bulunmayan avantajlara sahiptir. İmmünopresipitasyon deneylerinde kullanıldığı gibi homojenizasyon teknikleri, bireysel hücrelerdeki olaylarla herhangi bir bağlantıyı ortadan kaldırır. Sonuç olarak, hücre döngüsü durumunun etkisi veya bir hücre popülasyonu arasındaki değişkenlik ile ilgili içgörü kaybolur. Bununla birlikte, PLA tek tek hücrelerdeki olay frekanslarını bildirdiğinden, bu bilgiler kurtarılabilir.

PLA'nın sık görülen bir sınırlaması, ilgilenilen hedefler için immünolojik tespit reaktiflerinin eksikliğidir. Bu, doğrudan kırıcılar dışındaki ajanlar tarafından tanıtılan DNA pertürbasyonlarına hücresel yanıtla ilgili soruları ele alırken bir endişe kaynağıdır. Bu sınırlamayı, immüno-etiketli bir DNA reaktif reaktifi kullanarak aştık. Çalışmalarımızı interstrand çapraz bağları üzerine odaklamış olsak da, kemoterapi ilaçları da dahil olmak üzere kendilerini bu yaklaşıma ödünç verecek birçok genotoksik bileşik vardır. Ek olarak, proteinler ve G dörtlüleri gibi DNA yapıları arasındaki etkileşimler de bu strateji ile incelenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma, kısmen, NIH, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Amerika Birleşik Devletleri (Z01-AG000746-08) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. J.H., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakıfları (21708007 ve 31871365) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

Biyoloji Sayı 173 replisome bloke edici lezyon PLA yakınlık ligasyon testi DNA interstrand çapraz bağları antijen etiketli çapraz bağlar

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter