Articolo metodologico

Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

DOI:

10.3791/61776

⸱

6 maggio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell'RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all'immunocolorazione e all'ibridazione in situ dell'mRNA.

Abstract

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La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all'invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l'importanza della segnalazione del calcio, l'esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell'embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell'espressione dell'RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell'architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.

Introduzione

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La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l'apoptosi, lo sviluppo, l'invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalazione del calcio controllata dai loro regolatori proteina chinasi A (PKA), Ca2+ / calmodulina-dipendente proteina chinasi II (CaMKII), FK506 proteine leganti (FKBPs), calsequestrina (CSQ), triadina e junctin1,2,3,4,5,6 . L'espressione umana anomala e le mutazioni in queste proteine possono portare a fisiologia patologica come aritmie7 e proliferazione oncogenica8,9.

Le FKBP regolano il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) da parte dei RyR. Questo processo è essenziale per il meccanismo di contrazione, e quindi responsabile di tutti i movimenti meccanici generati dalla contrazione della miosina-actina attraverso il rilascio di calcio indotto dal calcio insieme ai RyR embrionali1,2. Nei modelli murini, la mancanza di RyR2 e del suo regolatore FKBP12/Calstabin è invariabilmente letale, sia durante lo sviluppo embrionale che nel primo periodo postnatale10,11,12. I topi knockout FKBP12/Calstabin presentano difetti cardiaci critici con accoppiamento irregolare eccitazione-contrazione (EC) ed edema cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Ciò indica che FKBP12/Calstabin svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell'espressione del canale RyR2, che è importante sia per lo sviluppo cardiaco che cerebrale10.

Le scintille di calcio condotte da RyR sono state inizialmente scoperte nella fase di formazione dello zigote delle uova medaka fecondate13,14. Tuttavia, poche indagini sono state eseguite sulla funzione della segnalazione del calcio nello sviluppo embrionale precoce. In Drosophila melanogaster, i risultati ottenuti dai mutanti DmFKBP12 S107 forniscono una forte evidenza a sostegno dell'importanza di questo gene per lo sviluppo larvale e una durata di vita sana, che è attribuita alla sua funzione contro lo stress ossidativo15,16. Recentemente, abbiamo identificato la localizzazione dinamica della proteina FKBP12/Calstabin e dell'RNA messaggero durante lo sviluppo precoce di Drosophila melanogaster17. Utilizzando gli approcci descritti in questa metodologia, siamo stati in grado di tracciare l'espressione di FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster durante il blastoderma sinciziale (0-2 h), il blastoderma cellulare (2-3 h), la gastrula precoce (3-12 h) e la gastrula tardiva (12-24 h). In questo articolo, presentiamo i protocolli dettagliati di ogni approccio nello studio precedente, tra cui l'incorporamento pre-embrionale per il sezionamento classico di paraffina, il trattamento con vetrini pre-rivestimento per sezioni embrionali, la colorazione istochimica e l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ dell'mRNA per l'identificazione dell'espressione genica.

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Protocollo

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1. Preparazione di piatti di agar di succo d'uva

  1. Aggiungere 5 g di agar e 5 g di saccarosio a 150 ml di acqua distillata. Farlo bollire usando un forno a microonde fino a quando l'agar e il saccarosio sono completamente sciolti. Mescolare 50 ml di succo d'uva al 100% e la soluzione insieme.
  2. Aggiungere 1 mL di acido propionico al 100% per rendere la concentrazione finale allo 0,5% di acido propionico. Versare 25 ml della soluzione preparata in ogni piastra. Dopo che l'agar si è solidificato, conservare il supporto a 4 °C.

2. Vetrini di rivestimento

  1. Pretrattare i vetrini con detergente. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata. Quindi asciugare i vetrini in un forno a 45 °C per 2 ore.
  2. Immergere i vetrini in circa 450 ml di soluzione di acido solforico dicromato di potassio (20 g di dicromato di potassio, 40 ml di acqua distillata e 400 ml di acido solforico concentrato) per 24 ore. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata.
    1. Asciugare i vetrini in forno a 45 °C per due ore. Immergere in etanolo al 95% per più di 2 ore.
  3. Aggiungere 0,5 g di solfato di cromopotassico e 5 g di gelatina a 1 L di acqua distillata. Sciogliere a bagnomaria a 60 °C prima dell'uso. La gelatina di cromo allume può essere conservata a 4 °C per lunghi periodi.
  4. Far cadere 10 μL di gelatina di cromo allume sul vetrino e coprire completamente e uniformemente l'intera superficie del vetrino con la soluzione. Mettere il vetrino con il lato gelatina in forno a 42 °C per 48 ore. I vetrini preparati possono essere conservati a 4 °C per un uso successivo.
    NOTA: questo è un passaggio critico. Il rivestimento completo è necessario. Per il moscerino della frutta e il suo embrione, questo approccio di rivestimento a vetrino sembra più efficiente del rivestimento in polilisina.

3. Incorporamento dell'embrione di Drosophila

  1. Raccolta di embrioni di Drosophila
    NOTA: Abbiamo raccolto embrioni di Drosophila in quattro periodi di 0-2 ore (blastoderma sinciziale), 2-3 ore (blastoderma cellulare), 3-12 ore (gastrula precoce) e 12-24 ore (gastrula tardiva)18. La proporzione dei principali tipi di embrioni in ciascun periodo è riportata nella Tabella 1.
    1. Metti 400-500 mosche in una bottiglia di raccolta di plastica e copri la bottiglia con il piatto di agar di succo d'uva contenente estratto di lievito. Gli embrioni di Drosophila vengono deposti sul succo d'uva agar a temperatura ambiente.
    2. Raccogliere quattro periodi di embrioni, aggiungendo delicatamente 2 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) a ciascuna piastra per far galleggiare gli embrioni. Trasferire circa 200 embrioni in un tubo di centrifuga da 50 ml e tenerlo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni.
  2. Pre-incorporamento
    1. Trasferire 200 embrioni di Drosophila in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni, quindi scartare con cura il surnatante con la pipetta. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% nel tubo e agitare delicatamente per 2 minuti.
      NOTA: La candeggina deve essere preparata fresca e la quantità di candeggina potrebbe variare a seconda della quantità di embrioni raccolti.
    2. Raccogliere delicatamente gli embrioni versandoli su carta da filtro e lavarli 3 volte con 1 ml di PBS alla volta.
    3. Trasferire gli embrioni con carta da filtro a circa 5 ml di n-eptano.
    4. Trasferire la miscela in un tubo centrifugo fresco da 1,5 ml. Aggiungere 1 ml di metanolo e agitare delicatamente. Raccogliere gli embrioni dopo la sedimentazione.
    5. Rimuovere il surnatante e lavare gli embrioni in 1 ml di PBS 3-5 volte.
    6. Fissare gli embrioni con 400 μL di soluzione di Bouin (71% di acido picrico saturo, 24% formalina, 5% acido acetico) per 30 minuti. Lavare gli embrioni fissi 3 volte in 1 ml di PBS per 5 minuti ogni volta.
    7. Per aggregare gli embrioni, trasferire i campioni in un tappo di gomma e rimuovere il PBS.
    8. Preparare la soluzione di agarosio-PBS all'1,2% e mantenere la soluzione a 60 °C. Aggiungere 200 μL di soluzione di agarosio-PBS all'1,2% sugli embrioni per fissarli in un blocco di agar.
    9. Togliere il blocco dal tappo e memorizzare il blocco in PBS.
      NOTA: durante l'approccio di pre-incorporamento, pro-riscaldamento è fondamentale per il successo. Consigliamo vivamente che i tubi della centrifuga e le punte delle micropipette, che verranno utilizzati in questa fase, siano completamente preriscaldati prima del funzionamento.
  3. Incorporamento di paraffina
    1. Immergere il blocco di agar pre-incorporato in etanolo al 35%, etanolo al 50%, etanolo al 75% etanolo all'85% per 15 minuti ciascuno. Quindi immergere 2 volte in etanolo al 95% e etanolo al 100%.
      NOTE: Circa 5-10x di volume di blocco di ciascuno seguito da un fissativo graduato per 15-30 minuti è necessario a seconda del numero di embrioni nel blocco.
    2. Immergere il blocco embrionale in soluzione di etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 15 minuti.
    3. Trasferire il blocco in xilene per 1 minuto per rendere trasparente il tessuto embrionale.
    4. Immergere il blocco in xilene e paraffina (rapporto 1:1) per 30 min.
    5. Immergere il blocco in paraffina I, paraffina II e paraffina III per 2 ore ogni volta.
    6. Riempi la casella di incorporamento con paraffina in anticipo, quindi trasferisci delicatamente e orizzontalmente il blocco nella parte inferiore della scatola di incorporamento. Dopo che la paraffina si è solidificata naturalmente, il blocco di paraffina solidificato può essere conservato a 4 °C.
      NOTE: Il campione pre-incorporato può essere utilizzato in criosezione seguendo i seguenti passaggi. Dopo che gli embrioni sono pre-incorporati con agarosio come descritto sopra, i campioni sono semplicemente incorporati in OCT Compound. Successivamente, la criosezione può essere eseguita secondo il protocollo di criosezione di routine. Successivamente, è possibile utilizzare approcci di colorazione regolari sulle sezioni.

4. Colorazione dell'ematossilina-eosina

  1. Preparare sezioni di embrioni di Drosophila . Mettere le sezioni preparate in forno a 60 °C per 15 minuti e poi immergere le sezioni in xilene 2 volte per 10 minuti ciascuna. Immergere le sezioni una volta in etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 2 min.
  2. Idratare le sezioni in etanolo I al 100%, etanolo II al 100%, etanolo al 95%, etanolo all'85%, etanolo al 75%, etanolo al 50% e in acqua distillata per 3 minuti.
  3. Macchiare le sezioni con soluzione di ematossilina per 2 minuti. Immergere rapidamente i vetrini in soluzione alcolica acida all'1% (1 mL di acido cloridrico, 100 ml di etanolo al 70%) e lavare i vetrini in acqua distillata.
  4. Immergere i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 75%, etanolo all'85% etanolo al 95% in sequenza.
  5. Macchiare le sezioni con soluzione di eosina per 1 min.
  6. Disidratare i vetrini in etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100%, etanolo II al 100% e etanolo III al 100% per 1 minuto ogni volta.
  7. Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ogni volta.
  8. Montare le diapositive con balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.

5. Colorazione periodica acido-argento metenamina

  1. Deparaffinizzare e idratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in acqua distillata.
  2. Ossidare le sezioni in acido periodico all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente.
  3. Risciacquare i vetrini in acqua distillata 3 volte per 1 minuto ciascuno.
  4. Incubare i vetrini in circa 40 ml di soluzione di lavoro di metenamina d'argento appena filtrata (3% metenamina, 5% nitrato d'argento, soluzione di borato di sodio al 5%) per 1 ora e 20 minuti a 60 °C. Quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
  5. Tonificare i vetrini in cloruro d'oro allo 0,2% per 2 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
  6. Posizionare i vetrini in tiosolfato di sodio al 3% per 3 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
  7. Controbattere le diapositive in ematossilina per 30 s. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 3-5 minuti.
  8. Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100% etanolo II al 100% per 5 minuti ciascuno.
  9. Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.
  10. Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.

6. Immunoistochimica

  1. Deparaffinizzare e reidratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in PBS seguendo il protocollo standard19.
  2. Trattare i vetrini con 0,3% di H2O2 in metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente ed evitare la luce.
  3. Preriscaldare il tampone di recupero dell'antigene appropriato a circa 100 °C in un contenitore con i vetrini nel piroscafo vegetale. Il contenitore dovrebbe anche avere un coperchio. Metti le diapositive nel contenitore. Chiudere il coperchio del piroscafo.
    1. Tenere il contenitore nel piroscafo per 20 minuti da questo punto. Si noti che il coperchio del contenitore a scorrimento non deve essere completamente stretto in modo che il vapore acqueo possa entrare durante il processo di cottura a vapore.
  4. Lasciare che i vetrini tornino a temperatura ambiente prima di risciacquarli delicatamente in PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7,2) 3 volte per 5 minuti ciascuno, quindi risciacquare i vetrini in PBS 3 volte per 1 minuto ciascuno.
  5. Bloccare i vetrini con l'1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 60 minuti a temperatura ambiente.
  6. Incubare i vetrini con anticorpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la notte a 4 °C o a temperatura ambiente per 4 ore.
  7. Lavare le diapositive in PBS-T 4 volte per 5 minuti ciascuna.
  8. Applicare i vetrini con polimero marcato HRP coniugato con anticorpi secondari (anti-Rabbit, 1:5.000) per 90 min a temperatura ambiente. Fallo al buio per evitare lo sbiancamento delle foto.
  9. Lavare i vetrini in PBS-T 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  10. Incubare i vetrini con il 5% di 3,3'-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per 2-10 minuti fino a quando il colore dei prodotti di reazione è appropriato al microscopio.
  11. Controbattere i vetrini in ematossilina per 30 s e lavare i vetrini in acqua distillata 2 volte per 5 minuti ciascuno.
  12. Disidratare i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto ciascuno.
  13. Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.
  14. Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.

7. Ibridazione in situ

NOTA: le sezioni di embrione di Drosophila sono state preparate con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) allo 0,01%. Tutti gli accessori utilizzati per l'ibridazione in situ applicano in anticipo il trattamento notturno DEPC.

  1. Preparazione del riboprobo
    1. Linearizzare il DNA del modello tagliando in un sito enzimatico di restrizione a valle dell'inserto clonato utilizzando un enzima di restrizione che crea sporgenze di 5 '. Dopo la linearizzazione, purificare il DNA del modello tramite estrazione di fenolo / cloroformio e successiva precipitazione di etanolo. Utilizzare protocolli standard.
    2. Aggiungere 1 μg di DNA modello purificato a un tubo centrifugo privo di RNasi. Posizionare il tubo della centrifuga sul ghiaccio. Aggiungere abbastanza acqua trattata con DEPC al volume totale di 13 μL.
      1. Quindi aggiungere i seguenti reagenti nell'ordine: 2 μL di 10x miscela di etichettatura NTP, 2 μL di 10x tampone di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi protettore, 2 μL di RNA polimerasi SP6 o RNA polimerasi T7.
    3. Mescolare la reazione mediante pipettaggio e centrifuga a breve. Incubare per 2 ore a 37 °C.
      NOTA: incubazioni più lunghe non aumentano la resa dell'RNA marcato. Una breve rotazione (~ 800 giri / min) applicata sul tubo di reazione è fondamentale prima di continuare con il passaggio successivo. Questo spin permetterà a tutti i contenuti, che potrebbero generare dall'incubazione, di arrivare sul fondo del tubo.
    4. Aggiungere 2 μL di DNasi I priva di RNasi per rimuovere il DNA modello e incubare per 15 minuti a 37 °C.
    5. Aggiungere 2 μL di 200 mM EDTA (pH 8,0) per arrestare la reazione.
      NOTA: le sonde di RNA marcate DIG possono essere conservate a -15-22 °C in etanolo per un anno.
  2. Pre-ibridazione della sezione embrionale di Drosophila
    1. Mettere sezioni di embrione di Drosophila in un forno a 42 °C per 48 ore.
    2. Deparaffinizzare le diapositive in 100% xilene per 10 minuti due volte.
    3. Idratare i vetrini immergendo sequenzialmente in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 5 minuti.
    4. Incubare i vetrini in PBS per 5 minuti e 3 volte per rimuovere la soluzione fissativa / soluzione di Bouin dal tessuto.
    5. Lavare i vetrini con 100 mmol/L glicina/PBS soluzione 2 volte per 5 minuti ciascuno.
    6. Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
    7. Incubare i vetrini con 0,3% Triton X-100 in PBS per 15 minuti per permeabilizzare le membrane.
    8. Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.
    9. Incubare i vetrini in 15 μg/mL di proteinasi K priva di RNasi per 30 minuti a 37 °C.
    10. Incubare i vetrini con il 4% di paraformaldeide in PBS per 3 minuti per fermare la digestione.
    11. Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
    12. Incubare i vetrini in tampone trietanolammina da 100 mM (pH 8,0) con anidride acetica allo 0,25% (v/v) 2 volte per 5 minuti ciascuno.
    13. Aggiungere acqua DEPC nella camera di umidità della diapositiva. Aggiungere 20 μL di soluzione di pre-ibridazione (contenente 100 μg/mL di DNA di spermatozoi di salmone) sui vetrini. Mettere le diapositive nella camera di umidità della diapositiva. Incubare i vetrini a 42 °C per 4 ore.
      NOTA: È necessario garantire la tenuta del coperchio della scatola bagnata e che la scatola bagnata sia sempre tenuta in orizzontale per evitare volatilizzazione e deviazione dal tessuto della soluzione di pre-ibridazione e della soluzione di ibridazione seguita.
  3. Ibridazione del comparto embrionale di Drosophila
    1. Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione e lavare i vetrini con 0,2x SSC (150 mM di cloruro di sodio, 15 mM di citrato di sodio, pH 7,0) 3 volte per 5 minuti ciascuno. Pulire l'eccesso di SSC 0,2x intorno ai campioni di tessuto.
    2. Applicare 30 μL di soluzione di ibridazione della sonda (contenente 2-6 ng di sonda di RNA marcata con digossina diluendo in soluzione di pre-ibridazione) con una pipetta. Incubare i vetrini nella camera di umidità del vetrino a 42 °C per circa 20 ore.
      NOTA: Assicurarsi della tenuta del cappuccio come suggerimento dell'ultima nota. Altrimenti, il prosciugamento causato dalla perdita di pre-ibridazione o pre-ibridazione genererà uno sfondo sporco incluso pseudo-positivo nelle diapositive.
  4. Ibridazione
    1. Rimuovere la soluzione di ibridazione e lavare i vetrini con 4x soluzione SSC 4 volte per 15 minuti ciascuno a 37 °C.
    2. Lavare i vetrini in 2x soluzione SSC con 20 μg/mL di RNasi A per 30 min a 37 °C.
    3. Lavare i vetrini in 1 soluzione SSC per 15 minuti a 37 °C.
    4. Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,5x per 15 minuti a 37 °C.
    5. Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,1x per 15 minuti a 37 °C.
    6. Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.
    7. Lavare i vetrini nel tampone di lavaggio (100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) per 1 min.
    8. Incubare i vetrini in 100 ml di soluzione bloccante appena preparata (siero di pecora al 2% in tampone di acido maleico senza Tween 20) per 30 minuti.
    9. Incubare i vetrini in 20 ml di soluzione anticorpale per 45 minuti.
      1. Centrifugare l'anticorpo per 5 minuti a 10.000 giri/min nel flaconcino originale prima di ogni utilizzo e pipettare con attenzione la quantità necessaria dalla superficie. Anti-digoxigenina-AP diluita 1:5000 (150 mU/mL) in soluzione bloccante.
    10. Lavare i vetrini in 100 ml di tampone di lavaggio 2 volte per 15 minuti ciascuno per rimuovere il coniugato anticorpale non legato.
    11. Equilibrare le diapositive in 20 mL di tampone di rilevamento (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) per 2-5 min.
    12. Incubare i vetrini con 10 ml di soluzione di substrato colorato appena preparata nella camera di umidità del vetrino. La reazione inizia entro pochi minuti ed è completa dopo 16 ore. Non agitare o mescolare mentre il colore si sta sviluppando.
    13. Lavare i vetrini con 50 ml di acqua distillata per 5 minuti per fermare la reazione.
    14. Asciugare il campione durante la notte al buio.
    15. Disidratare i vetrini in 70% etanolo, 80% etanolo, 90% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo I e 100% etanolo II per 3 minuti ciascuno.
    16. Cancellare le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 20 minuti ciascuna.
    17. Montare gli scivoli con balsamo neutro.
    18. Documenta le immagini e analizzale con la microscopia invertita e il software del produttore. Eseguire l'analisi della distribuzione utilizzando ImageJ in base alla densità del segnale positivo lungo l'asse longitudinale o all'interno della zona differenziale degli embrioni.
      NOTA: Durante l'incubazione con la soluzione di substrato colorante appena preparata nel passaggio 7.4.12, il colore della reazione può essere visto anche ad occhio nudo. Questa osservazione su come lo sviluppo del colore può essere ispezionata sotto stereoscopio. Una volta che il colore della reazione è ragionevole e il passaggio 7.4.13 può essere eseguito per fermare la reazione.

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Risultati

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Le figure descrivono i protocolli utilizzati per superare la sfida di attaccare embrioni di Drosophila ad alto contenuto di lipidi e chitina (Tabella 1) alla superficie del vetrino per l'esame e la sperimentazione. Utilizzando il metodo di rivestimento dei vetrini di gelatina di allume cromato mostrato nella Figura 1, abbiamo migliorato l'attaccamento degli embrioni di Drosophila sulla superficie dei vetrini, mentre il metodo di pre-incorporamento dell'embr...

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Discussione

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La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell'uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si pre...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
-20° C FrigoriferoMeiling Biologia & MedicoDW-YL270Utilizzato per lo stoccaggio reggente-80
° C Frigorifero a bassissima temperaturaThermoForma 90 SeriesUtilizzato per la conservazione dei reggenti
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparazione di piastre di agar per succo d'uva
Anti-Digoxigenina-AP, frammenti Fab Roche11093274910Per la rilevazione di composti marcati con digossigenina
Incubatore biochimicoShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Ibridazione
BouinReagente chimico Sinopharm a Pechino69945460Centrifuga per inclusione di embrioni di Drosophila
Eppendorf540BH07808In-situ Ibridazione
Provetta per centrifugaDenvilleC-2170Raccolta di embrioni di Drosophila
Allume di cromoSinopharm Reagente chimico presso Pechino10001018Coating Slides
Bagno d'acqua a temperatura costanteJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCColorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina Dako
REAL EnVision Detection SystemDakoK5007Nella reazione immunoistochimica o nella reazione di ibridazione in situ, si lega all'anticorpo dell'antigene primario e il bersaglio viene marcato mediante colorazione.
ibridazione in situDEPCSigma-AldrichD5758
Roche11093274910la marcatura dell'RNA con diagoxigenina-UTP mediante trascrizione in vitro con RNA polimerasi SP6 e T7
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Le scorte di Drosophila melanogaster mutant
Forno elettrico di essiccazioneTianjin Taiste Instruments101-0ABPer vetrini di rivestimento e inclusione di paraffina
EosinSigma-Aldrich230251Colorazione con ematossilina-eosina
Reagente chimico Sinopharm a Pechino100092680Inclusione di paraffina, colorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina
Gelatina Sinopharm Reagente Chimico a Pechino10010328Rivestimento Vetrini
Cloruro d'oroSigma-Aldrich379948Periodico Acido-Argento Metenamina Colorazione
EmatossilinaSigma-AldrichH3136Ematossilina-Eosina Colorazione
PCR ad alta purezza Kit di purificazione del prodottoRoche11732668001Per la purificazione dei prodotti
PCRScatola intelligente per la temperatura e l'umidità costantiNingbo Jiangnan InstrumentsHWSPer la manutenzione delle mosche
LE AgarosioHyAgarose14190108029Pre-inclusione
del metanoloSinopharm Reagente chimico a Pechino10014108Microscopio per la raccolta di embrioni di Drosophila
ZEISSObserver.A1Colorazione con ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina
vetrini per microscopioMeVid Labware ManufacturingP105-2001Vetrini per rivestimento
Gomma neutraSinopharm a Pechino10004160Colorazione con ematossilina-eosina
N-eptanoSinopharm Reagente chimico a Pechino40026768Drosophila Affettatrice
per paraffinaStrumento scientifico HuahaiHH-2508IIIem>In-situ Reagente
ibridazione ParaffinaSinopharm a Pechino69019461inclusione in paraffina
SartoriusPB-10Per determinare il valore del pH di una soluzione
Nitrato d'argentoReagente chimico Sinopharm a Pechino10018461Contatore di acqua ultrapura per colorazione periodica acido-argento metenammina
ThermoAFXI-0501-PIn-situ Ibridazione
XileneSinopharm Reagente chimico a Pechino10023418Inclusione di paraffina
Soluzione di Kit di etichettatura dell'RNA DIG di da collezione <chimico per Misuratore di pH/mV per

Riferimenti

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