Articolo metodologico

Lesione da ischemia-riperfusione dell'organo simulando cambiamenti emodinamici nel modello di trapianto di fegato di ratto

4.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61779

⸱

6 marzo 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Intensive Care Unit, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of hepatobiliary surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Hospital of Medical School of Ningbo University, 3Department of transplantation, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 4Digital Technology and Engineering college, Ningbo University of Finance & Economics

In questo articolo

Sommario

Questo documento fornisce una descrizione dettagliata di come costruire un modello animale della fase anepatica (ischemia epatica) nei ratti per facilitare la ricerca di base sulle lesioni da ischemia-riperfusione dopo il trapianto di fegato.

Abstract

Il trapianto di fegato ortotopico (OLT) nei ratti è un modello animale provato e collaudato utilizzato per studi preoperatori, intraoperatori e postoperatori, tra cui lesioni da ischemia-riperfusione (IRI) di organi extraepatici. Questo modello richiede numerosi esperimenti e dispositivi. La durata della fase anepatica è strettamente correlata al tempo in cui sviluppare l'IRI dopo il trapianto. In questo esperimento, abbiamo usato cambiamenti emodinamici per indurre danni extraepatici agli organi nei ratti e determinato il tempo massimo di tolleranza. Il tempo fino alla lesione d'organo più grave variava per diversi organi. Questo metodo può essere facilmente replicato e può anche essere utilizzato per studiare l'IRI degli organi extraepatici dopo il trapianto di fegato.

Introduzione

La lesione da ischemia-riperfusione (IRI) è una complicazione comune dopo il trapianto di fegato. L'IRI epatico è un processo patologico che coinvolge danni cellulari mediati dall'ischemia e deterioramento anomalo della riperfusione epatica. L'IRI epatico e la risposta immunitaria innata locale possono essere suddivisi in IRI caldo e freddo, in base alle differenze nell'ambiente clinico1. L'IRI caldo è indotto da lesioni alle cellule staminali, di solito a seguito di trapianto di fegato, shock e trauma2. L'IRI freddo è una complicazione del trapianto di fegato causata da cellule endoteliali e circolazione periferica3. I rapporti clinici hanno dimostrato che l'IRI epatico è associato al 10% dei fallimenti precoci degli organi e può aumentare l'incidenza delrigetto acuto e cronico 4,5. Inoltre, l'IRI epatico può anche indurre sindromi multiple di disfunzione degli organi o sindrome da risposta infiammatoria sistemica, con alta mortalità6. I pazienti con coinvolgimento di organi extraepatici tendono a rimanere più a lungo in ospedale, spendere più soldi e avere una prognosi peggiore7. Lo sviluppo di complicanze è strettamente correlato alla durata della fase anepatica del trapianto di fegato8.

Il trapianto ortotopico di fegato (OLT) nei ratti è stato segnalato per la prima volta dal professore americano Lee nel 1973. L'operazione sperimentale ha simulato le fasi del trapianto clinico di fegato e l'anastomosi dei vasi sanguigni e il comune condotto biliare (CBD) utilizzando il metodo di sutura. La procedura è difficile e richiede molto tempo con un basso tasso di successo9. Nel 1979, Kamada et al. Nello stesso anno, Zimmermann propose il "metodo dello stent biliare unico". Sulla base del lavoro di Lee, Zimmermann ha utilizzato tubi di polietilene per anastomosi direttamente il CBD del donatore e del ricevente, ha semplificato la ricostruzione del CBD e conservato la funzione dello sfintere, e questo metodo è diventato lo standard per la ricostruzione biliare dei modelli OLT11. Nel 1980, Miyata et al. Tuttavia, c'è il rischio di distorsione della cannula con questo metodo, che può portare all'ostruzione del reflusso di vena cava inferiore12. Nel 1983, il "metodo a due polsini" è stato proposto utilizzando il metodo cuff per l'anastomosi del fotovoltaico e dell'IVC, ma adottando il metodo di sutura per l'SVC13. Questo metodo è stato adottato dagli studiosi di tutto il mondo per stabilire modelli OLT. Da allora, i passaggi di anastomosi del polsino sono stati migliorati per accorciare la fase anepatica e migliorare il tasso di sopravvivenza deiratti 14. Allo stesso modo, nella pratica clinica vengono utilizzati metodi migliorati per abbreviare la fase anepatica15. Tuttavia, la ricerca di base sull'IRI dopo il trapianto di fegato ha dimostrato che il tasso di sopravvivenza è inversamente correlato al grado di lesione agli organi extraepatici. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche ed è necessario un modello animale semplice e riproducibile per simulare l'IRI dopo il trapianto di fegato.

Sulla base della definizione della fase anepatica, abbiamo simulato i cambiamenti emodinamici nel trapianto di fegato con conseguente IRI di organi extraepatici nei ratti. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di come costruire un modello animale della fase anepatica (ischemia epatica) nei ratti per facilitare la ricerca di base sull'IRI dopo il trapianto di fegato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Il Comitato etico animale ha approvato l'esperimento della Guangxi Medical University (No20190920). Tutti gli animali sono stati forniti dall'Animal Experiment Center della Guangxi Medical University. Abbiamo usato ratti Sprague Dawley maschi SPF (200-250 g, 10-12 settimane), mantenuti sotto la temperatura ambiente di 25 ± 2 °C e umidità di 50 ± 10%. L'alimentazione è stata interrotta 24 ore prima dell'operazione; tuttavia, l'acqua è stata fornita.

NOTA: Un operatore può eseguire tutte le operazioni senza una base di microchirurgia o un microscopio chirurgico.

1. Operazione

  1. Dopo la pesatura, anestetizzare i ratti con isoflurane (5%) utilizzando una macchina per l'anestesia animale.
  2. Dopo 1-2 minuti, bloccare delicatamente le dita dei piedi del topo con una pinzetta. Se il topo non risponde dopo aver pizzicato, è entrato in uno stato di anestesia. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Utilizzare lampade per il riscaldamento degli animali per mantenere la temperatura corporea dei ratti a 37-38 °C.
  3. Dopo la disinfezione addominale (soluzione di iodio povidone), fissare il topo sulla tabella della dissezione animale. Fare un'incisione mediana di 3 cm sotto il processo xifoide usando forcep e forbici.
  4. Aprire la cavità addominale, esporre il fegato usando un riavvolgitore e mobilitare il legamento epatogastrico. Utilizzare tamponi di cotone per capovolgere delicatamente il lobo centrale del fegato e girarlo verso l'alto per esporre la porta hepatis. Identificare il CBD, il fotovoltaico e l'HA.
  5. Spingere l'intestino tenue verso la cavità addominale inferiore sinistra usando tamponi di cotone, coprirlo con garza bagnata e spostare la vena cava intraepatica nella vena renale destra.
  6. Isolare la vena porta, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra con una lente intraoculare e forcep contrassegnate con filo di seta 3-0, ognuna con un nodo slip.
  7. Aprire la pelle degli arti inferiori sinistro e destro ed esporre la vena femorale usando le forcep oftalmiche. Iniettare lentamente eparina a basso peso molecolare 625 UI/kg attraverso la vena femorale per eparinare tutto il corpo.
  8. Legare la vena porta, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra con suture n. 3-0, della durata di 45 minuti(Figura 1). Sostituire l'intestino tenue nella cavità addominale e coprirlo con una garza. Ridurre l'anestesia per inalazione durante questi periodi.
  9. Dopo 45 minuti, rilasciare la vena portale, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra.
  10. Suturare il muscolo e la pelle, strato per strato, e terminare l'anestesia inalatoria. Fornire analgesia postoperatoria utilizzando morfina sottocutanea di 5 mg/kg ogni 4 ore.
  11. Osservare il topo fino a quando non è sveglio e nutrirsi a una temperatura di 25 ± 2 °C e umidità di 50 ± 10%. Sono necessarie lampade per il riscaldamento degli animali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Tolleranza dei ratti all'ischemia epatica
In questo modello animale, i siti in cui i vasi sanguigni sono stati legati durante il funzionamento sono mostrati nella figura 1. I ratti sono stati divisi casualmente in 5 gruppi per ischemia per 15 minuti (gruppo I15), 30 minuti (gruppo I30), 45 minuti (gruppo I45), 60 minuti (I60) e gruppo sham, con 10 ratti in ogni gruppo. Il tasso di sopravvivenza di ogni gruppo è stato osservato 14 giorni dopo l'operazione. Tutti i ratti so...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'OLT nei ratti è un modello ideale per studiare la conservazione degli organi nel trapianto di fegato, nell'IRI, nel rigetto dei trapianti, nella tolleranza immunitaria, nella patologia e farmacologia dei trapianti, nell'omotrapianto e nello xenotrapianto. Attualmente, è ampiamente utilizzato nella ricerca sperimentale del trapianto di fegato.

Durante gli studi pilota abbiamo somministrato per la prima volta l'anestesia intraperitoneale al sodio pentobarbitale e abbiamo scoperto che ciò ha po...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo riconoscere gli utili suggerimenti forniti dal Dr. Wen-tao Li e dal Dr. Ji-hua Wu del Secondo Ospedale Affiliato della Guangxi Medical University. Gli autori ringraziano i nostri compagni di squadra per i commenti e le discussioni utili. Gli autori vorrebbero anche ringraziare i revisori anonimi e gli editori di JoVE per i loro commenti. Un ringraziamento speciale dovrebbe andare ai genitori del dottor Yuan per il loro continuo sostegno e incoraggiamento. Il lavoro è stato sostenuto dalla Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di paraformaldeide al 4%Shanghai Macklin Biochemical Co., LtdP804536
forno di essiccazione ad ariaShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanina aminotransferasi (ALT)KitElabscience Biotechnology Co., LtdE-BC-K235-S
ammoniacaSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd10002118
Kit amilasiElabscience Biotechnology Co., LtdE-BC-K005-M
etanolo anidroSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd100092183
Animal macchina per anestesiaShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdKit R640
aspartato aminotransferasi (AST)Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
analizzatore biochimico automatico.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (quando necessario)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
CentrifugaBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
vetro di coperturaJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
Kit creatininaRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
macchina di disidratazioneUngheria 3DHISTECH Co., LtdDonatello Serie 2
macchina di inclusioneHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
Wuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Wuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
Shanghai huayong cera di paraffina co., LtdQ / YSQN40-91
acido cloridricoSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd10011018
pinze per lenti intraoculari (IOL)Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd
micro forbici (quando nessary)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
portaaghiShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
gomma neutraShanghai Huashen Healing Equipment Co., Ltd.—
microscopio ottico normaleNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
pinza oftalmicaSurgical Instrument FactoryJ3CO30
pinza oftalmicaSurgical Instrument FactoryJD1060piegatura
Forbici oftalmicheSurgical Instrument FactoryJ1E0
affettatrice patologicaShanghai Leica Instrument Co., LtdPipette RM2016
Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.
divaricatoriBeijing Jinuotai Technology Development Co., Ltd.Scanner JNT-KXQ
Ungheria 3DHISTECH Co., LtdPannoramic 250
vetriniWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
xileneSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7
Macchina congelata Soluzione colorante ematossilina-eosina Cera di paraffina ad alta efficienza Shanghai diritta Shanghai Shanghai 7010101008

Riferimenti

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933(2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662(2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818(2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Simulazione dei cambiamenti emodinamicidurata della fase anepaticadanno agli organi extraepaticianalisi istopatologicamarcatori biochimici siericisviluppo di modelli animalitempo di tolleranza all ischemiavalutazione del danno d organo

Articoli correlati