Summary
植物由来製品の抗真菌効果を定量化するために設計された修飾寒天ベースの方法について述べています。このプロトコルを通じて、抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性の寄与の両方を評価することができる。さらに、真菌に対する有効性は、単一の実験セットアップの主要な発達段階で測定することができる。
Abstract
記載されたプロトコルは、微生物の量とその発生段階を正確に決定できるプラグ転送技術に基づいています。指定された数の胞子が寒天プレートに広がる。この寒天プレートは、培養が必要ない胞子を除いて、真菌が期待される発達段階に到達できるように、定義された期間インキュベートされる。胞子、ヒファ、または菌糸体で覆われた寒天プラグは、次に取り出され、試験対象の抗真菌化合物を含む寒天培地に移管され、真菌から離れた場所または接触した状態で配置されます。この方法は、液体抽出物と固体サンプル(粉末)の両方を試験するのに適用可能です。特に、生理活性混合物中の揮発性物質と不揮発性物質の相対的な寄与を定量化し、特に胞子、初期のヒファ、および菌糸体に対するその効果を決定するために適しています。
この方法は、バイオコントロール製品、特に植物由来製品の抗真菌活性の特性評価に非常に関連しています。実際に、植物の処理のために、結果は、アプリケーションのモードの選択を導き、トリガーのしきい値を確立するために使用することができます。
Introduction
果物や野菜の世界的な損失は、生産1の最大50%に達することができ、20世紀半ばから合成殺菌剤の広範な雇用にもかかわらず、主に畑や収穫後の貯蔵中に生じた食の腐敗から生じる2、3。これらの物質の使用は、深刻な環境および健康上の危険を表すため、再考されています。その使用の有害な結果が生態系全体に現れ、潜在的な健康への影響の証拠が5、6を蓄積したので、収穫前および収穫後の治療7、8、9のための古い予防戦略に代わる新しい選択肢が開発されている。したがって、私たちが直面する課題は2倍です。新しい殺菌戦略は、まず、植物病原体に対する食物保護の有効性のレベルを維持し、それに付随して、農業慣行の環境フットプリントを劇的に削減することに貢献しなければならない。この野心的な目標を達成するために、植物で進化した自然防御に触発された戦略は、その抗菌特性8のために1000種以上の植物種が強調されているように提案されています。例えば、植物病原体と戦うために天然の殺菌剤を開発した植物は、新しいバイオコントロール製品の開発を探求する新しい資源である2.エッセンシャルオイルはこのタイプの旗艦分子です。例えば、オリガナム精油は、トマト植物を温室10およびSolidagoカナデンシスL.およびカシアエッセンシャルオイルの灰色のカビ損傷11,12から収穫後のイチゴを保存することが示されている。これらの例は、バイオコントロールおよび特に植物由来の製品が生物学的有効性と環境持続可能性を組み合わせた溶液を表していることを示している。
したがって、植物は作物保護産業にとって潜在的な関心の分子の重要な資源である。しかし、一般的に安全で非植物性で環境に優しいと認識されているにもかかわらず、バイオコントロール製品として使用される植物製品はほんの一握りです。ラボから現場への移調の難点が見られ、一度インビボ2,9に適用されると効力が低下するなどがある。したがって、現場の有効性をより良く予測するために、ラボテストの能力を向上させることが重要になります。この文脈では、植物由来の製品の抗真菌試験方法は、その抗真菌効果を評価し、使用するための最適な条件を定義するために必要です。具体的には、バイオコントロール製品は一般的に化学殺菌剤よりも効率が悪いので、適切な製剤を提案し、フィールドでの適用様式を特定し、病原体のどの発達段階がバイオ製品候補に対して脆弱かを定義するために、それらの作用様式をよりよく理解することが重要です。
抗菌活動や抗真菌活動に取り組む現在のアプローチには、寒天ディスク拡散、希釈、バイオサイン、フローサイトメトリーなどの拡散法が含まれる13.これらの技術のほとんど、より具体的には、標準的な抗真菌感受性試験(寒天ディスク拡散および希釈アッセイ)は、液体懸濁液中の細菌および真菌胞子に対する可溶性化合物の抗菌活性を評価するために十分に適応されている14.しかし、これらの方法は、一般的に乾燥植物粉末などの固体化合物を試験したり、寒天プレートに広がる胞子希釈または胞子を必要とするため、菌糸体の成長中に抗真菌活性を定量化するには適していません。13.食品中毒法では、抗真菌剤を含む寒天プレートを、7日間の古い真菌培養物から採取した直径5~7mmのディスクを、正確な菌糸体の量を考慮せずに接種する。インキュベーション後、抗真菌活性は放射状増殖阻害の割合として決定される17,18,19.このアプローチにより、菌体成長に対する抗真菌活性を評価することができます。対照的に、寒天希釈法は、抗真菌化合物を含む寒天プレートの表面に直接接種された胞子に対する抗真菌活性を決定するために行われる13,20,21.これら2つのアプローチは、抗真菌活性に対する相補的な結果を与える。しかし、これらは、胞子と菌糸体上の抗真菌化合物の相対的な有効性の正確な並べて比較を提供しない並列で使用される2つの独立した技術です17,20,22 開始真菌材料の量は、2つのアプローチで異なります。さらに、植物由来の産物の抗真菌活性は、しばしば、植物によって合成された抗真菌分子の組み合わせから生じる病原体に直面する。これらの分子は、タンパク質、ペプチドを包含する23,24、および広範な化学的多様性を有し、ポリフェノール、テルペン、アルカロイドなどの分子の異なるクラスに属する代謝産物25、グルコシノレート8、および有機硫黄化合物26.これらの分子の一部は、病原体の攻撃中に揮発性または揮発性になる27.これらの薬剤は、ほとんどの場合、精油として水蒸留を通じて回収しなければならない水溶性および高気圧化合物であり、その抗菌活性が十分に確立されている28.気相媒介感受性アッセイは、蒸発後の揮発性化合物の抗菌活性を測定し、蒸気相を介して移動する29.これらの方法は、微生物培養物から離れた抗真菌化合物の導入に基づく29,30,31,32,33.一般的に使用される気相寒天アッセイでは、エッセンシャルオイルを紙ディスクに堆積させ、寒天培地に広がる細菌または真菌胞体懸濁液から遠く離れたペトリ皿のカバーの中央に置かれます。成長阻害のゾーンの直径は、寒天ディスク拡散法と同じ方法で測定されます。20,24.その他のアプローチは、阻害された気相媒介性抗菌活性を計算したブロス希釈法に由来する精油の気相抗真菌感受性の定量的測定を提供するために開発された32、または寒天ディスク拡散アッセイに由来する31.これらの方法は、一般に気相活性研究に特異的であり、接触阻害アッセイには適さない。これは、複雑な生理活性混合物の抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性物質の相対的な寄与の決定を妨げる。
我々が開発した定量法は、乾燥植物粉末が乾燥した植物粉末の制御量の胞子及び成長した菌糸体を寒天培地の表面に付着させ、植物15 の感染時の植物病原体の空中成長ならびに相互接続された菌網16に及ぼす抗真菌効果を測定することを目的とする。このアプローチは、寒天希釈法と食品毒法に基づく改変実験セットアップであり、同じ実験セットアップにおいて、揮発性および不揮発性抗真菌性代謝産物の寄与を並べて定量化することもできる。本研究では、この方法は、3つの十分に特徴付けられる抗真菌製剤の活性に対してベンチマークされている。
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Protocol
1. インノクラ製剤
- 実験の前に、 トリコデルマspp の5μLを置く。SBT10-2018胞子は、4°Cで保存されたジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)で、コニディア形成42 を促進するために定期的な光暴露で30°Cで4日間インキュベートする(図1、パネルA)。
注: トリコデルマspp.SBT10-2018は木材から隔離されており、急速な成長と胞子回収の容易さのためにこの研究のモデルとして使用されています。この株は、我々の研究室によって保存されています。 - コニディアの回復 (図 1、パネル A)
- トリコデルマ菌糸体に0.05%トゥイーン-20の3 mLを置きます。
- 熊手を使用してコニジオフォアからコニディアを放出する。ヒファエが引き裂かれるのを防ぐために、菌糸体を押し下げないようにしてください。
- 溶液をマイクロピペットで迅速に回収し、寒天培地に吸収され、15 mLチューブに移さないようにします。
- ヘモサイトメーターを使用して胞子の総数を数え、3 x 106 の胞子/mLを含む溶液を準備する。
注: このステップは、ヒファエが抽出されるのを防ぐために慎重に行う必要があります。その後、胞毛の準備を顕微鏡でチェックします。最終的には、高度に空中およびふわふわした菌糸体を提示する株のために、40 μMのストレーナーフィルターを使用してろ過のステップが残った菌糸体の断片を除去するために加えることができる。
2. 真菌プレート調製 (図1、パネルB)
- PDA培地を含む直径9cmのペトリ皿にマイクロピペットを用いた3 x 106 の胞子/mLの100 μLを堆積し、925の胞子/5mm直径アガープラグに対応する4,800個の胞子/cm2 を得る。
- 無菌ヘラで直径2mmのガラスビーズを10g加え、前方および後方の動きをオペレータの腕に平行かつ垂直に行い、寒天の表面に胞子を均等に分配します。
- プレートを 90° 回転させて回転させる動きを繰り返します(セクション 2.2 のように)。プレートが完全に回転するまで、これらの手順を繰り返します。
- 初期のヒファエまたは菌糸体が必要な場合は、すぐにこのプレートを使用して、胞子を必要とする実験を行うか、30°Cで17時間または24時間インキュベートする実験を行ってください。
注:菌糸体のプラグ移動と菌糸体のディスク移動後に測定された抗真菌活性を比較するには、滅菌ピンセットを使用し、胞子の拡散後に無菌5mmセルロースディスクを寒天プレートの表面にランダムに配置します。
3. 抗真菌化合物製剤
- 植物由来製品製剤:ニンニク粉末製剤
- 新鮮なニンニクのクローブを皮をむき、メスの刃を使用して2〜3mm幅のスライスにクローブをカットします。
- 40°Cで2日間スライスを空気乾燥させます。
- ナイフミルを使用してスライスを3 x 15秒間粉砕し、細かい粉末を得ます。
- 使用前に50mLチューブで4°Cでニンニクパウダーを保管してください。
注:ニンニクはオートクレーブ(温度感受性抗真菌化合物の劣化を防ぐために)は、使用前に70%エタノールでグラインダー、メス、および空気乾燥機をきれいにします。
- エッセンシャルオイルの準備
- 0.5%、1%、2.5%、5%、20% の胸腺下品 精油溶液を0.5%Tween-80で調製します。
- PDA培地に追加する前に、よく混ぜてエマルジョンを形成します(セクション4.2を参照)。
- カルベンダジン製剤
- カルベンダジンを秤量して200mg/Lエタノール溶液を調製する(カルベンダジンは水に難溶性である)。
- PDA培地に添加する前に、溶液を室温で保管してください(セクション4.2を参照)。
注意:カルベンダジンムは健康と環境の危険を提示します。この製品を取り扱う際は、手袋とマスクを着用してください。換気されたスペースに保管してください。
4. 接触抑制アッセイ
- ガーリックパウダーを含む寒天プレートの調製
- PDA培地を準備し、オートクレーブします。
- 望ましいニンニクパウダーの量を無菌ヘラを使用して50 mLチューブに計量し、一般的に0.25mg/mLから16mg/mLまでの濃度を得る。
- 手首の内側の媒体の温度を確認した後、PDAの10 mLを追加します。感度の高い分子の分解を防ぐために、温度はできるだけ低くする必要があります。理想的には、この温度は45°Cでなければなりません。
- 粉末をPDA培地に均等に分配するためにチューブを逆さまにして慎重に均質化します。直径5cmのペトリ皿(図1、パネルC)に10mLを素早く注ぎます。
- ペトリ皿を室温に置いて、寒天が固まるまで待ちます。
- エッセンシャルオイルまたはカルベンダジンムを含む寒天プレートの調製
- PDAの10mLを50mLチューブに導入します。セクション4.1.3の温度を確認してください。
- PDAにチムス下地性エッセンシャルオイルの異なる溶液の100 μLを加えて、0.005%、0.01%、0.025%、0.05%、0.2%の溶液を得る(セクション3.2.1参照)。
- 200 mg/L溶液からカルベンダジンムの必要量を加え、0.0625-2 mg/L の範囲の溶液を得る(セクション3.3.1を参照)。
- 管を逆さまにして慎重に均質化し、直径5cmのペトリ皿(図1、パネルC)に10mLを素早く注ぎます。
- ペトリ皿を室温に置いて、寒天が固まるまで待ちます。
- 接触阻害アッセイ (図1)
- 直径5mmの無菌のステンレス鋼管を使用して、PDAまたはPDAのいずれかを含むペトリ皿の中央に、抗真菌化合物を含む円をプロットします。無菌爪楊枝(パネルC)を使用して寒天シリンダーを処分する。
- 直径5mmの無菌ステンレス鋼管を使用して、セクション2から真菌プレートにランダムに円をプロットします。プレートあたり15~20個の円(パネルB)の間をプロットします。
- 胞子、初期のヒファエ、または菌糸体で覆われた寒天シリンダーを滅菌爪楊枝で慎重に引き出し、PDAまたはPDA(パネルC)を含むペトリ皿の空きスペースにプラグを置きます。
- 胞子を含むプレートを30°Cで48時間、初期のヒファエを含むプレートに31時間、菌糸体で覆われたプレート(パネルC)に対しては24時間インキュベートします。
- 放射状成長の直径を測定し、式を用いて制御に対する真菌増殖阻害の割合を計算する(パネルD)
% 真菌増殖阻害 = (C - A/C)* 100
ここでCは、PDA培地における径成長の直径及びAは、抗真菌化合物を含むPDA培地における放射状成長の直径である。
注:無菌ピンセットを使用して、菌糸体のプラグ転送と菌糸体ディスク移動後に測定された抗真菌活性を比較するには、以前に堆積した5mm直径のディスクを、PDAまたはPDAに抗真菌化合物を含むペトリ皿の中央にある真菌プレートの表面に移し、寒天性プラグの場合とまったく同じように進みます。
5. 気相阻害アッセイ
- ガーリックパウダーを含む寒天プレートの調製
- セクション 3.1 に従って進めます。
- エッセンシャルオイルまたはカルベンダジンムを含む寒天プレートの調製
- セクション3.2と3.3に進みます。
- 真菌プレートの調製
- セクション 2 に進みます。
- 気相抗真菌阻害アッセイ(図1)
- PDA培地の10 mLを、10mL PDA培地または10mLのPDA培地を含むPDA培地を含む直径5cmのペトリ皿の蓋に、食器の底に注ぎます。室温(パネルC)で寒天が完全に固まるまで待ちます。
- 蓋の中央にPDAの円を得るために口径測定ツールとして50 mL遠心管を使用してください;無菌ヘラ(パネルC)で円の周りのPDAを取り除きます。
- 直径5mmのステンレス鋼管で蓋に入れたPDA媒体の中央に円をプロットします。無菌爪楊枝(パネルC)で寒天シリンダーを捨てます。
- セクション4.3.2(パネルB)のように、5 mmの直径の無菌のステンレス鋼管をランダムに真菌プレートに差し込みます。
- 滅菌爪楊枝を使用して、真菌プレートから胞子、初期のヒファエ、または菌糸体で覆われたプラグを慎重にアッセイプレート(パネルC)の蓋に移します。
- セクション4.3.4(パネルC)のように30°Cでインキュベートする。
- ラジアル成長の直径を測定し、セクション4.3.5(パネルD)の式を使用して真菌増殖阻害の割合を計算します。
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Representative Results
異なるタイプの抗真菌化合物の作用様式を判別する定量的方法の能力を評価するために、3つの有名な抗真菌剤の有効性を比較した。カルベンダジンは、植物39、40の真菌疾患の広い範囲を制御するために広く使用されている不揮発性の合成殺菌剤である。胸腺下品精油は、主にその抗菌および抗真菌活性について記載されており、天然食品保存剤41として使用されている。ニンニクパウダーは植物由来のバイオ製品のモデルとして選ばれました。これは、揮発性有機硫黄化合物の存在に大きく起因する抗菌活性を有する自然療法として伝統的に使用されてきたが、また、不揮発性サポニンおよびフェノール化合物26の存在に起因し、このモデルに関連する複雑さを与える。
この定量的方法は、異なる発育段階で菌類の制御された量を含む寒天栓の移動に依存して、胞子から菌糸体へ異なる発生段階では、食品毒法では、5日間から7日間古い菌糸体がセルロースディスク13から移される。アッセイでは、胞子、初期のヒファエ(17時間インキュベーション)および菌糸体(24時間インキュベーション)を開始真菌材料として使用した。ディスク転送の使用は、ディスク転送後に少なくとも部分的に寒天培地上に残り、その後 図2に示すように、生育阻害の不正確な測定につながるように、円錐または残留催眠として関係ない場合がある。セルロースディスク下に位置する寒天領域の転写後、24時間のインキュベーション(図2、パネルA、B、C)の後に異なる直径の真菌径が観察され、ディスク移動後の寒天上に残留真菌性ヒファエが存在することを強調した。残留ハイファの定量は、最大22%の直径変動をもたらす成長の測定によって確認された(図2、パネルD)。次に、抗真菌性化合物として チムス下剤 精油を用いて成長阻害に対する効果を評価し、寒天プラグ移動後に得られた阻害と比較した(図2、パネルE)。低 い胸腺 油濃度の寒天プラグ転移後よりも高いディスク移動後の増殖阻害は、阻害効果の過大評価をもたらし、真菌物質の不完全な移動による可能性があり、寒天プラグ移動に基づくアプローチを支持する。
トリコデルマspp. 3つの抗真菌化合物によって引き起こされたSBT10-2018-増殖阻害は、次に各真菌段階の接触相および気相阻害アッセイを用いて評価した(図3)。胞子は寒天プレートに慎重に広げ、4,800個の胞子/cm2を得た。彼らは5mmの無菌ステンレス鋼管を使用して寒天プラグ抽出を通じて抗真菌化合物を含む寒天プレートに直接移され、胞子から実験を開始することを可能にした。他の2つの発達段階では、胞子で覆われた寒天プレートを、まず30°Cで17時間または24時間インキュベートしてから、寒天プラグを移して、ヒファエ(17時間)と菌糸体形成(24時間)の発芽と早期発生を可能にした(図3、パネルA)。活性揮発性分子が全体的な抗真菌活性に寄与することを定量化するために、接触阻害アッセイが適応され、胞子、初期のヒファエ、および菌糸体をPDA培地に注ぎ込んだ抗真菌化合物から離れた位置に配置された。 トリコデルマ-ラジアル成長は48時間にわたって測定され、阻害の割合は対照条件と比較して決定された。最小阻害濃度(MIC)は、30°Cでのインキュベーションの48時間後に目に見える成長を妨げる抗真菌化合物の最低濃度として定義されています。
図3(パネルB)は、 トリコデルマ と抗真菌化合物が接触した際にそれぞれ0.25μg/mLカルベンダジンで50%、22%および30%の増殖阻害を有する初期のヒファおよび菌糸体ネットワークと比較して、カルベンダジンに対する胞子感受性が高いことを示している。それに付随して、胞子発芽では0.5μg/mLのMIC値が推定されているのに対し、早期の催眠伸長と菌糸体では0.75μg/mLへの増加が得られた。対照的に、カルベンダジンは、真菌がこの物質の低揮発性に従って殺菌剤から離れた場所に置かれたときに トリコデルマ に抗真菌効果を有さなかった。抗真菌性化合物として チムス下品(TEO) を用いて得られた結果(図3、パネルC)は、それぞれ0.01%のTEOで65%および約50%の増殖阻害を有する早期ヒファおよび菌糸体と比較して、TEOに対する胞子感受性が高いことを示した。得られたMIC値は、胞子発芽と早期催眠伸長(0.025%TEO)と菌糸体増殖(0.05%TEO)に対して類似していた。予想通り、 胸腺スブルガリス 精油は、真菌と油の距離に関係なく同一の抗真菌活性を示した。同様のMIC値(0.025%TEO)は、接触および気相アッセイに対する胞子発芽および早期催眠伸長で得られたが、より低い割合では、TEOと トリコデルマ 胞子が接触した場合に高い感度が観察された(接触の60%成長阻害と遠くでの成長阻害の45%)。驚くべきことに、菌糸体で得られたMIC値は、接触相および気相阻害アッセイ(0.05%対0.1%)で異なっていた。揮発性分子の一部が、よく発達した菌糸に対して活性ではないことを示唆している。最後に、 ニンニク粉末を抗真菌性化合物(図3、パネルD)として使用する場合、胞毛発芽(0.25mg/mLのガーリックパウダーで50%の成長阻害、0.5mg/mLのMIC値)および初期のヒファエエロンに対して高い効能が認められた。 菌糸体の成長(0.5 mg/mLの29%の成長阻害、0.75mg/mLのMIC値)よりも(0.25mg/mLの59%の成長阻害と0.5mg/mLのMIC値)接触相および気相アッセイを比較した場合、その結果は真菌の発生段階に関係なく、遠くにおける抗真菌活性の有意な減少を示している。MIC値は、胞子発芽の場合0.5mg/mLから1mg/mL、早期ヒファエ伸長では0.5mg/mLから2mg/mLに、菌糸成長の場合は0.75mg/mLから4mg/mLに移動しました(図3、パネルD、 図4)。 したがって、これらの結果は、ニンニク粉末が抗真菌特性を有する揮発性および不揮発性化合物の混合物を含んでいることを示唆している。
全体として、これらの結果は、植物由来の製品に含まれる揮発性および不揮発性物質の相対的な寄与が、実験条件が同等であるとして異なる真菌増殖段階で決定され得ことを示す。このアプローチは、抗真菌化合物の複雑な混合物に特に適しています。チムス下品性エッセンシャルオイルは、揮発性化合物の混合物であり、胞胞発芽と早期ヒファエ伸長のための距離および接触で同様の活性を示し、この気相と接触阻害アッセイの比較を支持し、寒天培地に注ぐことによって気相への移動が損なわれないことを強調する。この研究でモデルとして使用されるニンニク粉末は、全体的な抗真菌活性に有意な寄与を有し、アリウム27,28に由来する揮発性チオスルフィネートを支持して無視された不揮発性活性成分が含まれていることも強調した。
図1: 接触および気相アッセイ用プロトコルのシノプティックスキームは、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:セルロースディスクからの真菌伝達に関連する不正確さ A. A. Sporeで覆われた寒天プレートへのディスク転送と、抗真菌化合物を含む寒天プレート上のディスク転送を表すスキーム B. セルロースディスク下領域の寒天移動を表すスキーム、続いてインキュベーションおよび残留成長測定。 C. セルロース円盤下の領域の転写後の残存菌糸体の放射状成長の代表的な画像。 D. 残留菌糸体の放射状成長測定 E. セルロースディスクまたは寒天プラグから転化した菌糸体の成長に対する 胸腺スブルガリス エッセンシャルオイルの影響 (N =2、平均± SD) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:胞子、初期のヒファ、および菌糸体に対する気相および接触阻害アッセイを用いた抗真菌活動の比較A.トリコデルマ胞子、初期のヒファエ(17時間成長)、および菌糸体(24時間成長)の代表的な写真。トリコデルマの成長阻害カルベンダジン(B),チムス下皮精油(C)及びニンニクパウダー(D)(N=2、平均±SD)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:接触中の寒天プレート上のニンニク抗真菌活性の代表的な写真-(A)または気相(B)阻害アッセイ この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示されるアプローチは、最小限に処理された植物由来の製品の抗真菌特性の評価を可能にする。このプロトコルでは、寒天表面上の胞子の均質な分布は、2mmガラスビーズを使用して達成される。このステップでは、ビーズを適切に配布し、再現性のある結果を得るためのハンドリングスキルが必要であり、最終的には真菌の成長の異なる段階で抗真菌効果の比較を可能にします。5mmのガラスビーズや、広がりの間に均質化しながら過度の回転が可変の成長直径を引き起こす可能性があることがわかりました。そのため、実験前に胞毛分布を習得するためのトレーニングをお勧めします。さらに、植物粉末を試験する必要がある場合は、寒天培地への製品の均質な分散に注意を払う必要があります。プレートの底部に粉が落ち着かないようにするために、溶融した媒体の温度が45°Cに達したときに(室温が24°Cの場合)寒天培地に混合する必要があります。この温度は、沈み込みを避けるために、局所室温に応じて調整する必要があります。
ここで説明する方法は貴重な洞察を提供できますが、いくつかの欠点を考慮する必要があります。この方法は、調製すべき寒天プレートの数が答えなければならない質問に応じて大きくすることができるので、準備時間のかなりの量を犠牲にして、単一の実験セットアップで正確かつ並べて比較することができます。さらに、このアッセイは5 cmペトリ皿のために設計されている中規模のアッセイである。したがって、すべての局面を試験するために必要な活性物質の量が相当なものになり得る。つまり、希少物質がこのプロトコルの適切な試験候補ではない可能性があることを意味します。アッセイのスケールダウンは、より小さなペトリ皿を使用して、プラグのサイズを小さくすることを考慮することができます。これは、ここで説明するベンチマークプロトコルを使用して、寒天プラグ抽出に特別な注意を払ってテストすることができ、難しいかもしれません。放射状成長測定の精度は、その小さなスケールで低下する可能性があります。
現在の方法は、溶液中の化合物の抗真菌活性を測定するのに適しており、粉末13の研究にはあまり適用されません。当社が確立したアプローチは、液体化合物と固体化合物の両方に適合しており、最小限に処理された植物由来製品の抗真菌特性の評価が可能です。これにより、抽出物の試験に要する時間を短縮し、溶解性の低い活性物質に関連する落とし穴を低減します。一部の植物由来の製品は、高温43に敏感な活性分子を含むので、これはそのような化合物の活性の損失のリスクを制限する利点を提供する。このアプローチは、寒天拡散法と食品中毒法15、16、17、18、19から、同様の実験設定を用いて異なる真菌増殖段階で抗真菌活動を直接比較することを可能にする。寒天プラグの移動は、アッセイ内の微生物の量を正確に制御することができます。これは、ディスク転送よりも利点であり、胞子またはヒファエの不完全な伝達に関連する抗真菌効果の過大評価につながる。最後に、気相アッセイは一般に接触阻害アッセイ27、28、29、30、31には適用されませんが、提案する方法は、植物粉末または抽出物などの複雑な混合物に含まれる揮発性および不揮発性物質の相対的な寄与に対処し、最終的には異なる真菌増殖段階での抗真菌作用の評価を可能にする。
ここで説明するアプローチは、バイオコントロールのための植物由来製品の抗真菌特性を評価する方法の必要性をサポートするために特に関連している可能性があります。我々が提案する定量的方法により、オペレータは、複雑な生理活性混合物の抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性化合物のそれぞれの寄与を決定することができる。これは、治療のためのアプリケーションのモードの選択と液体抽出を実行する関連性を導くことができる貴重な情報を提供します。標的植物体から離れた場所で考慮される可能性のあるアプリケーション(例えば、バイオコントロール製品をパッケージに含めるなど)、またはバイオコントロール製品の有効性を最適化するために直接接触する必要がある(植物へのネビュライゼーションまたはバイオコントロール製品の溶液に果物を浸す)。また、胞子発芽から後段階の菌糸体増殖まで、異なる真菌増殖段階での抗真菌薬効を比較することができ、作物にバイオコントロール製品を適用するために必要な制御閾値を確立するための推奨事項の定義につながります。実際、異なる真菌段階で物質の有効性を定義することは、物質が予防的または治癒的な治療法として使用できるかどうかを分類し、バイオコントロール製品による植物治療のスケジュールを計画するのに役立つ可能性があります。これは、フィールドや収穫後に使用する場合の製品の有効性を活用するために不可欠です。
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Disclosures
何一つ
Acknowledgments
フランク・イェーツの貴重なアドバイスにとても感謝しています。この作品はSup'Biotechによって支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
