Summary
Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.
Abstract
Structurele studies met tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2 TS) van Salmonella typhimurium zijn uitgevoerd om het katalytische mechanisme, allosterisch gedrag en details van de enzymatische transformatie van substraat naar product in PLP-afhankelijke enzymen beter te begrijpen. In dit werk maakte een nieuw expressiesysteem om de geïsoleerde α- en geïsoleerde β-subeenheid te produceren, de zuivering van grote hoeveelheden zuivere subeenheden en α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden binnen 2 dagen mogelijk. De zuivering werd uitgevoerd door affiniteitschromatografie gevolgd door decolleté van de affiniteitstag, ammoniumsulfaatprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Om de rol van belangrijke residuen in het enzym β-site beter te begrijpen, werd site-directe mutagenese uitgevoerd in eerdere structurele studies. Een ander protocol werd gemaakt om het wilde type en mutant te zuiveren α2β2StTS complexen. Een eenvoudig, snel en efficiënt protocol met ammoniumsulfaatfractie en SEC maakte zuivering van α2β2StTS-complex in één dag mogelijk. Beide zuiveringsprotocollen die in dit werk worden beschreven, hebben aanzienlijke voordelen in vergelijking met eerdere protocollen om hetzelfde complex te zuiveren met BEHULP van PEG 8000 en spermine om de α2β2StTS-complex langs het zuiveringsprotocol te kristalliseren. Kristallisatie van het wilde type en sommige mutante vormen vindt plaats onder iets andere omstandigheden, waardoor de zuivering van sommige mutanten met PEG 8000 en spermine wordt aangetast. Om kristallen voor te bereiden die geschikt zijn voor röntgenkristallografische studies werden verschillende inspanningen geleverd om kristallisatie, kristalkwaliteit en cryoprotectie teoptimaliseren. De hier gepresenteerde methoden moeten algemeen toepasbaar zijn voor de zuivering van tryptofaansynthasesubeenheden en wilde α2β2StTS-complexen.
Introduction
Het tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2) is een allosterisch enzym, dat de laatste twee stappen in de biosynthese van het aminozuur L-tryptofaan in bacteriën, planten en schimmels1,2,3katalyseert. Bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) veroorzaakt een ernstige gastro-intestinale infectie bij mens en andere dieren. Aangezien mensen en hogere dieren geen TS hebben (EC 4.2.1.20), is deremmingvan S. typhimurium α 2 β2 TS-complex (α2β2StTS) onderzocht als een potentieel geneesmiddeldoel voor de behandeling van cryptosporidiose en tuberculose4, genitale en oculaire infecties5, en voor potentieel herbicidegebruik in de landbouw6. De α-subeenheid katalyseert het aldolytische decolleté van indool-3-glycerolfosfaat (IGP) tot glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en indool, door de vorming van een indolytine tautomeer intermediair en vervolgens koolstof-koolstofbindingssplitsing om GAP en indool3,6te produceren . De β-katalytische plaats bevat een pyridoxaal 5′-fosfaat (PLP) cofactormolecuul gebonden aan β-Lys87 via een Schiff-basis, dat functioneert als een elektronenzinking in de loop van de reacties op het enzym β-subeenheid3,7. De β-site katalyseert de vervanging van de L-Serine side-chain hydroxyl door indool om L-tryptofaan en een watermolecuul in een PLP-afhankelijke reactie te geven. Sint TS dient als een reeds lang bestaand model voor het onderzoek naar substraatangeulering en allosterische communicatie binnen multi-enzymcomplexen2,3. Bidirectionele allosterische communicatie tussen de α- en β-subeenheden van TS is noodzakelijk om de katalytische stappen te synchroniseren en indoolafgifte tijdens L-tryptofaansynthese te voorkomen3. Om deze inspanning uit te breiden, hebben we verschillende mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr en β-Ser377Ala) voorbereid door eenpuntsmutatie om te worden gebruikt bij verdere verkenningen van de relatie tussen enzymstructuur, mechanisme en functie op de katalytische locatie van de StTS β-subeenheid.
Gedetailleerd onderzoek naar het katalytische mechanisme van α2β2StTS is geïnitieerd door de onderzoeksgroep van Edith W. Miles. Vroege studies met inheemse Escherichia coli α2β2 TS-complex hebben zich gericht op de zuivering en karakterisering van het geïsoleerde α-subeenheid8,9, geïsoleerde β-subeenheid10,11 en de reconstitutie van het α2β2 TS-complex van de geïsoleerde subeenheden12. De zuivering werd uitgevoerd door ammoniumsulfaatprecipitatie, monsterdialyse, DEAE-Sephadexchromatografie, dialyse en een tweede chromatografische ronde op een DEAE-Sephadex kolom12. In een ander protocol werd de zuivering van hetzelfde complex verbeterd door het geklaarde cellysaat op een DEAE-Sephadex-kolom te laden, gevolgd door een chromatografische stap op een Sepharose 4B-kolom, ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse13. Beide zuiveringsprotocollen duren 4-5 dagen. Escherichia coli α2β2 TS complex gekristalliseerd, maar kristallen waren op dat moment niet geschikt voor röntgendiffractie.
In een nieuwe studie werden recombinante en wilde typevormen van S. typhimurium α2β2 TS-complex gezuiverd en gekristalliseerd14,15. Het recombinant α2β2StTS complex werd overexpressie in E. coli stam CB149 met de pEBA-10 expressievector. Initiële kristallisatie en röntgendiffractiegegevensverzameling en analyse van de α2β2StTS-complex werden gerapporteerd14. Lange en dunne naalden zoals α2β2StTS-kristallen hebben echter de structurele studies aangetast. In een poging om betere röntgendiffractiegegevens te verzamelen, werd een ander zuiveringsprotocol beschreven om het wilde type en de mutante vormen van de α2β2StTS-complex15te zuiveren. Zuivering werd uitgevoerd met een eerste neerslag met spermine en PEG 8.000 in het geklaarde cellysaat en een groot omvangrijk neerslag werd verwijderd door centrifugeren. De supernatansfractie met grote hoeveelheden α2β2StTS-complex werd 16-48 uur bij 4 °C bewaard totdat gele kristallen neersloegen. Kristallen werden gewassen en uitgebreid gedialyseerd tegen verschillende buffers. Eiwitcomplex werd opnieuw gekeerd in buffer met ammoniumsulfaat en gedialyseerd15. Hoewel eiwitkristallisatie afhankelijk is van eiwit- en precipitante concentraties in oplossing, is het moeilijk om zuivering te controleren, te voorspellen en te reproduceren voor andere mutante vormen van α2β2StTS-complex in oplossing. Dit protocol heeft als voordeel dat het geen chromatografische methoden gebruikt; de nadelen zijn echter de lange zuiveringstijd die nodig is om te kristalliseren, dialyseren en recrystalliseren, meestal 5-7 dagen. Om kristallen te verkrijgen die geschikt zijn voor het verzamelen van röntgengegevens, werden meer dan 600 kristallisatieomstandigheden geëvalueerd met behulp van een combinatie en variatie van eiwitconcentratie, temperatuur, precipitanten (PEG 4.000, 6.000 en 8.000) en additieven (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,cadaverine, putrescine, spermine of spermidine)15. Kristallen hadden een betere kristallijne vorm en groeiden sneller in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine. Kristallisatie was gunstiger bij 25 °C in plaats van bij 4, 30 of 42 °C en groeide binnen 3 dagen15uit tot maximale afmetingen. Verschillende α2β2StTS kristalstructuren werden gemeld op dat moment (1996-1999)16,17,18,19,20,21 en vele andere structuren zijn tot op heden gepubliceerd.
Hier is het belangrijkste doel om alternatieve protocollen te presenteren om tryptofaansynthase te zuiveren en eiwitkristallisatie te optimaliseren. Het huidige werk toont significante verbeteringen om het wilde type geïsoleerde α-subeenheid (αStTS), geïsoleerde β-subeenheid (βStTS) te zuiveren, gereconstitueerd α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden, en wilde type en mutante vormen van de α2β2StTS complex. De voordelen ten opzichte van eerdere protocollen zijn aanzienlijk omdat de zuiveringstijd aanzienlijk werd verkort en kristallisatie en cryoprotectie werden geoptimaliseerd. Mutante vormen van α2β2StTS complex ontworpen in dit werk hebben gekristalliseerd in de buurt van dezelfde voorwaarde gebruikt voor de wild type vorm. Echter, fijne kristallisatie optimalisatie was nodig om grote enkele kristallen van voldoende kwaliteit te verkrijgen voor structuurbepaling bij bijna atoomresolutie. Tot op heden zijn er 134 tryptofaan synthase kristalstructuren afgezet in de Protein Data Bank (PDB), respectievelijk 101, 31 en 2 kristalstructuren voor bacteriën, archaea en eukaryote. Mooi, 73 structuren behoren tot S. enterica serovar typhimurium en 5 kristalstructuren van de α2β2StTS complex hebben resolutielimieten hoger dan 1,50 Angstroms. Het is niet verwonderlijk dat 4 van de 5 werden voorbereid in onze onderzoeksgroep (PDB ID's: 5CGQ om 1,18 Å, 4HT3 om 1,30 Å, 4HPJ om 1,45 Å, 6DZ4 om 1,45 Å-resolutie). De verfijnde kristalstructuren van mutante vorm van α2β2StTS complex zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door essentiële aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de L-tryptofaansynthese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Snel protocol om de α- en β-subeenheid en de opnieuw verbonden α2β2StTS complex te zuiveren
- DNA-subcloning in pETSUMO-expressievector
- Verkrijg het translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium gekloond in de pEBA-10 expressievector22. Gebruik pEBA-10 vector als DNA-sjabloon.
OPMERKING: Als alternatief kunnen de onderstaande primers worden gebruikt om beide genen uit het salmonella enterica serovar typhimurium genoom te versterken. Alle moleculaire biologie stappen werden gevolgd zoals beschreven in Molecular Cloning: A Laboratory Manual23. - Gebruik polymerasekettingreactie (PCR) om de volledige polynucleotidesequentie van de α-subeenheid(αStTS) individueel te versterken met primers αStTS-FW-Bam en αStTS-Rev-Eco en de volledige reeks van β-subeenheid (βStTS) met primers βStTS-FW-Bam en βStTS-Rev-Hind. Gebruik een smelttemperatuur van ongeveer 55 °C en een polymeraseverlengingstijd van 2 min.
- Gebruik high-fidelity DNA polymerase (bijv. Phusion) en het protocol van de fabrikant om de DNA-sequenties te versterken. Voeg voor een 50 μL PCR-reactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM voorwaartse primer, 1 μL 10 μM reverse primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO toe.
- Gebruik voor het PCR-programma een warme start (180 seconden bij 98 °C), gevolgd door 30 versterkingscycli (30 seconden bij 98 °C, 30 seconden bij 55 °C en 120 seconden bij 72 °C) en een laatste verlenging (300 seconden bij 72 °C).
OPMERKING: De cursief sequenties komen overeen met respectievelijk de bamHI, EcoRI, BamHI en HindIII restrictie sites. De efficiëntie van enzymsplitsing dicht bij de termini van PCR-fragmenten werd verbeterd door extra basen toe te voegen (kleine letters).
αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
- Laad het PCR-product op 0,8% agarosegel in 1x TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA) op 6 V/cm, gel-extract de DNA-band van belang en gel zuiver het PCR-fragment met behulp van een silicaparelkit volgens de instructies van de fabrikant.
- Verteer ten minste 200 ng van elk DNA-fragment met geschikte restrictie-enzymen en omstandigheden die door de fabrikant gedurende 2 uur bij 37 °C worden aanbevolen.
- Voeg voor het opzetten van een 50 μL-beperkingsverteringsreactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reactiebuffer, 0,5 μL restrictie-enzym 1 en 0,5 μL restrictie-enzym 2 toe.
- Laad het verteringsproduct op 0,8% agarosegel op 1x TAE op 6 V/cm, gelextract en gel zuiver het verteerde fragment met behulp van een commerciële kit.
- Subklonen afzonderlijk elk fragment in de E. coli expressie gemodificeerde vector pET SUMO, eerder verteerd met geschikte enzymen en gel gezuiverd.
OPMERKING: Deze vector is een aangepaste versie van de commerciële pET SUMO. Deze vector is geoptimaliseerd voor beperking enzym klonen. De multikloonsite (MCS) van pET28b vector(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI en XhoI) is ingevoegd in de pET SUMO-kloonsite. Deze vector bevat een N-terminal 6x-Histidine tag in frame met het Small Ubiquitin-achtige Modifier eiwit (SUMO) en meerdere kloonsites. - Ligaat 100 ng gemodificeerde pET SUMO en 50 ng PCR-fragment met T4 DNA-ligase gedurende 2 uur bij 25 °C.
- Transformeer de geconstrueerde plasmide in competente cellen van E. coli stam DH10Bα cellen. Plaatcellen op LB-agarplaten die 35 μg/ml kanamycine bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
- Selecteer een enkele kolonie uit elke transformatie, bereid ultrazuiver plasmide-DNA voor en voer DNA-sequencing uit om te controleren of αStTS of βStTS in frame zijn gekloond met de N-terminal His6-SUMO-tag.
OPMERKING: Bereid glycerolvoorraden celkweek voor (draai celsuspensie in 16% eindconcentratie steriele glycerol) en bewaar ze op lange termijn bij -80 °C. - Transformeer de expressie plasmide SUMO-αStTS of SUMO-βStTS individueel in competente cellen van E. coli expressiestam Rosetta (DE3) pLysS met een T7 promotor-gebaseerd systeem. Plaat de recombinante cellen op Luria Bertani (LB) agarplaten die 35 μg/ml kanamycine en chlooramfenicol bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
- Kies na succesvolle kolonievorming één enkele kolonie (zonder satellietkolonies) en verspreid deze in 5 ml LB-medium met beide antibiotica. Kweekcellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
OPMERKING: Bereid glycerolvoorraden celkweek voor, bewaar ze op lange termijn bij -80 °C of gebruik ze onmiddellijk voor recombinante eiwitexpressie.
- Verkrijg het translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium gekloond in de pEBA-10 expressievector22. Gebruik pEBA-10 vector als DNA-sjabloon.
- Expressie van de subeenheden SUMO-αStTS en SUMO-βStTS
- Inentoogetische verse E. coli stam Rosetta (DE3) pLysS cellen met SUMO-αStTS of SUMO-βStTS bouwt of schraapt een deel van de bevroren glycerolvoorraad in een 50 ml cultuur van LB met 35 μg/ml kanamycine en chlooramfenicol. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
- Inenteer de volgende ochtend 5 ml van de nachtcelkweek in een verse en steriele 2x 1000 ml LB met 2% glycerol plus kanamycine en chlooramfenicol (2,8 L Fernbach-kolf). Kweek celkweek met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
OPMERKING: De expressie van SUMO-αStTS of SUMO-βStTS in LB bouillon levert 125-150 mg gelabeld eiwit per liter op. Overweeg het schaalprotocol omhoog of omlaag om aan specifieke eisen te voldoen. - Induceer recombinante eiwitexpressie wanneer de OD600 0,6-0,8 bereikt door toevoeging van isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) bij een eindconcentratie van 0,4 mM gevolgd door incubatie bij 30 °C 's nachts met schudden bij 200 tpm.
- Oogst de cellen door gedurende 20 minuten bij 4.000 x g bij 4 °C te centrifugeren. Verwijder het supernatant en hang de celkorrels met koude lysisbuffer 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, met 500 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol en 40 mM imidazol-Cl) opnieuw op tot een eindvolume van 60 ml.
OPMERKING: Cellen kunnen langdurig bij -80 °C worden opgeslagen of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering. Om cellen op te slaan, splitst u de celsuspensie in 2 x 50 ml wegwerpcentrifuge conische buizen en houdt u celkorrels op -80 °C tot de eiwitzuiveringsstap.
- Zuivering van de α- en β-subeenheden tryptofaansynthase
OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd bij 4 °C, tenzij anders vermeld. Om de zuiveringstijd te verkorten, equilibreert u Ni-NTA agarose nikkel-geladen affiniteitskolommen en grootte-uitsluitingskolom in buffer voorafgaand aan eiwitzuivering of tijdens recombinante eiwitexpressie.- Verstoor celkorrels door sonicatie met behulp van een digitale sonifier met 1/2" Horn-sonde (of een vergelijkbare apparatuur). Voer 20 cycli uit bij 80% amplitude duty cycle op ijswaterbad met 10 s pulse en 20 s rust of tot volledige celverstoring.
- Centrifugeer de cellysaat op 30.000 x g gedurende 30 min. Aspireer supernatant, zodat de pellet niet uit de buis loskomt. Filtreer het supernatant met een filtereenheid van 0,45 μm op ijs en laat het door een 15 ml Ni-NTA agarose nikkel-geladen affiniteitskolom stromen die vooraf is geëquilibreerd in lysisbuffer 1.
OPMERKING: Elke Ni-NTA agarose kolom zal worden gebruikt om SUMO-αStTS of SUMO-βStTS recombinant eiwit te zuiveren. Zuivering kan worden uitgevoerd in een 2x 5 ml Ni-NiTA kolom bevestigd aan een snel eiwit vloeibaar chromatografie systeem. Zuiver één eiwit tegelijk. - Was ni-NTA agarose kolom in 100 ml lysis buffer 1.
- Ga verder met een 80 ml eenstaps elutie met buffer E1 (25 mM Tris-Cl buffer, pH 7,8, met 200 mM NaCl, 5% glycerol en 400 mM imidazol-Cl).
OPMERKING: SUMO-protease verdraagt tot 300 mM imidazol en het membraan van centrifugale filterapparaten verdraagt tot 100 mM imidazol. We raden aan om een ammoniumsulfaatprecipitatie uit te voeren om grote hoeveelheden imidazol te verwijderen en de zuiveringstijd te verkorten in plaats daarvan het eiwitmonster te verdunnen en tijd te verspillen met eiwitconcentratie. - Beoordeel het beginvolume van de supernatansfractie. Voeg langzaam kleine hoeveelheden ammoniumsulfaat per keer toe, totdat een verzadiging van 60% (39,48 g/ 100 ml) bij 25 °C is bereikt. Roer de oplossing voorzichtig gedurende 30 minuten en vermijd bubbels. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 15 min.
- Aspireer en gooi de supernatansfractie voorzichtig weg. Resuspendeer de pelletfractie in 20 ml monsterbuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl en 5% glycerol).
- Voeg voor His-SUMO-tag decolleté met SUMO-protease het recombinante fragment van Ubl-specifiek protease 1 uit Saccharomyces cerevisiae toe in een verhouding van 1:1000 en incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer het vergistingsproduct gedurende 20 minuten bij 10.000 x g in 25 °C om eiwitaggregaten te verwijderen voordat het monster door een affiniteitschromatografiekolom wordt geladen.
- Verwijder sporen van His6-SUMO-tag die het 20 ml geresuspendeerde monster passeert op een 15 ml Ni-NTA-agarosekolom, eerder geëquilibreerd in lysisbuffer 1.
- Verzamel het doorvoermonster met de niet-gelabelde αStTS of βStTS.
- Was de Ni-NTA kolom in 20 ml buffer 1 om restjes niet-gelabelde αStTS of βStTS te verzamelen.
- Concentreer elke subeenheid afzonderlijk met een 15 ml 10 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheid door te draaien op 3.000 x g bij 4 °C. Breng het geconcentreerde eiwit over in een verse buis van 2,0 ml en microcentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) om aggregaten te verwijderen. Bepaal eiwitconcentratie24,bereid 1 ml aliquots bij 20-25 mg ml-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
OPMERKING: Voorgezuiverde eiwitmonsters kunnen op lange termijn bij -80 °C worden bewaard of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering op een kolom voor grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). - Neem een eiwit aliquot (20 mg) en microcentrifuge op 10.000 x g gedurende 10 minuten om aggregaten vóór SEC te verwijderen.
- Bemonsteringsmonster op een kolom voor grootte-uitsluitingschromatografie (bijv. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) bevestigd aan een snelle eiwitvloeistofchromatografie met een debiet van0,5ml min -1 , eerder geëquilibreerd in SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,0 mM).
OPMERKING: Om hogere hoeveelheden geïsoleerde αStTS of βStTS-subeenheid te zuiveren en het aantal SEC-rondes te verminderen, laadt u een monster van 5 ml bij 20-25 mg ml-1 op een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie bij een debiet van 1,5 ml min-1. - Beoordeel de kwaliteit van αStTS of βStTS in de piekfractie met behulp van respectievelijk een 12% of 15% natrium dodecyl sulfaatgel elektroforese (SDS-PAGE), gekleurd met Coomassie briljant blauwevlek 25.
- Concentraat eiwit met verse 15 ml 10 kDa cutoff centrifugaal filtereenheden, bepaal eiwitconcentratie24,bereid 0,5 ml aliquots bij 20-25 mg ml-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof, en bewaar ze bij -80 °C.
- Zuivering van het α2β2StTS complex vanuit de α- en β-subeenheden
OPMERKING: Equilibreer de kolom grootte-uitsluitingschromatografie (Sephadex S-200 HR of Superdex 200 pg) in SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxaal fosfaat).- Om het wildtype α2β2StTS-complex te zuiveren van de α- en β-subeenheden, ontdooit u concentraatmonsters van αStTS en βStTS-subeenheden bij 4 °C.
- Combineer aliquots (1,2 αStTS: 1,0 βStTS molaire verhouding) en geïncubeerd bij 4 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Overmaat aan αStTS is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het grootste deel van βStTS wordt opgenomen in het α2β2StTS-complex. - Verwijder eiwitaggregaten door microcentrifugatie (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
- Laad de opgehelderde supernatant in de kolom grootte-uitsluiting.
- Beoordeel de kwaliteit van αStTS of βStTS in de piekfractie met behulp van respectievelijk een 12% of 15% natrium dodecyl sulfaatgel elektroforese (SDS-PAGE), gekleurd met Coomassie briljant blauwevlek 25.
- Bepaal eiwitconcentratie24,bereid 250-1000 μL aliquots bij 15-20 mg ml-1,flash-freeze in vloeibare stikstof, en bewaar bij -80 °C.
2. Zuivering van het wilde type of de mutante vorm van de α2β2StTS-complex
- Site-gerichte mutagenese om mutante βStTS voor te bereiden
- Gebruik construct pEBA-10 expressievector22 als DNA-sjabloon tijdens twee stappen polymerasekettingreactie om specifieke puntmutaties in de β-ketenTS-polynucleotidesequentie te introduceren.
OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt om een eenpuntsmutatie in α- of β-subeenheid van Salmonella typhimurium tryptofaansynthase in te voeren. Voor aanvullende, nieuwe oligonucleotideprimers die de gewenste mutatie bevatten, moeten op de juiste wijze worden ontworpen. In dit werk worden mutaties βQ114A, βK167T βS377A vermeld. - Voer PCR-reacties uit met behulp van paren nucleotideprimers TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev en TS-FW-NcoI/S377A-Rev om respectievelijk fragmenten A1, B1 en C1 te genereren.
OPMERKING: Oligonucleotide TS-NcoI-FW en TS-SacI-Rev, respectievelijk, gloeien stroomopwaarts en stroomafwaarts van de αβ StTS polynucleotidesequentie gekloond in de pEBA-10 vector.- Gebruik high-fidelity DNA polymerase (bijv. Phusion) en het protocol van de fabrikant om de DNA-sequenties te versterken. Voeg voor een PCR-reactie van 50 μL 34 μL nucleasevrij water, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM voorwaartse primer, 1 μL 10 μM reverse primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO toe.
- Gebruik voor het PCR-programma een warme start (180 seconden bij 98 °C), gevolgd door 30 versterkingscycli (30 seconden bij 98 °C, 30 seconden bij 55 °C en 120 seconden bij 72 °C) en een laatste verlenging (300 seconden bij 72 °C).
OPMERKING: Alle moleculaire biologiestappen werden gevolgd zoals beschreven in Molecular Cloning: A Laboratory Manual23. Terwijl een kleine letters sequentie overeenkomt met een beperkingsplaats, komt een vetgedrukte en cursief sequentie overeen met een mutatie.
TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3"
Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3"
K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
- Voer PCR-reacties uit met behulp van paren nucleotideprimers TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF en TS-Rev-SacI/S377A-FF om fragmenten A2, B2 en C2 te genereren.
TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT KAT GGC TGA G-3'
Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3"
K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3"
S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3' - Gebruik polymerasekettingreactie om de partiële fragmenten individueel te versterken. Gebruik een smelttemperatuur van 55 °C en een polymeraseverlengingstijd van 2 min.
- Om de tweede ronde van PCR-reacties uit te voeren, laadt u het PCR-product hierboven op 0,8% agarosegel op 1x TAE op 6 V/ cm en gelextract en gel zuiveren de fragmenten van belang.
- Meng de fragmenten A1/A2, B1/B2 en C1/C2 afzonderlijk in equivalente hoeveelheden, verwarm het mengsel gedurende 10 minuten bij 96 °C en gloei bij 25 °C. Breid de recombinante strengen uit met een high-fidelity polymerase en deoxyribonucleotiden volgens het protocol van de fabrikant.
- Om een hoog kopieernummer van het volledige mutante DNA-fragment te genereren, voegt u oligoprimers TS-FW-NcoI en TS-Rev-SacI toe om een tweede PCR uit te voeren.
- Laad het PCR-product op 0,8% agarose in 1x TAE-buffer bij 6 V/cm, pak de DNA-band van belang, gel zuiver het PCR-fragment en ga door met de juiste beperkingsvertering gedurende 2 uur bij 37 °C volgens de juiste buffer en de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden.
- Verteer ten minste 200 ng van elk DNA-fragment met geschikte restrictie-enzymen en omstandigheden die door de fabrikant gedurende 2 uur bij 37 °C worden aanbevolen. Voeg voor het opzetten van een 50 μL-beperkingsverteringsreactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reactiebuffer, 0,5 μL restrictie-enzym 1 en 0,5 μL restrictie-enzym 2 toe. Laad het vergistingsproduct op 0,8% agarose in 1x TAE buffer op 6 V/cm en zuiver het verteerde PCR fragment.
- Digest 200 ng pEBA-10 construct met restrictie enzymen NcoI en SacI volgens de aanbeveling van de fabrikant. Laad het verteringsproduct op 0,8% agarosegel in 1x TAE-buffer op 6 V/cm, accijns de bandcorrespondent naar de vector en gel zuiver de verteerde vector.
- Ligate 100 ng vector met 50 ng PCR-fragment, eerder verteerd en gezuiverd, met T4 DNA-ligase gedurende 2 uur bij 25 °C. Transformeer de geconstrueerde plasmide in competente cellen E. coli stam DH10B cellen. Plaatcellen op LB-agarplaten die 50 μg/ml ampicilline bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
- Kies een enkele kolonie (zonder satellietkolonies) uit elke celtransformatie en verspreid deze in 5 ml LB-medium dat ampicilline bevat. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C. Bereid 10 μg ultrazuiver plasmide-DNA van elke ontworpen constructie. Bereid glycerolvoorraden celkweek voor (draai celsuspensie in 16% eindconcentratie steriele glycerol) en bewaar langdurig bij -80 °C.
- Voer DNA-sequencing uit om de volledige reeks te bevestigen die codeert voor de α- en β-subeenheden van tryptofaansynthase. Bevestig elke afzonderlijke mutatie en gooi elke plasmideconstructie weg die ongewenste willekeurige mutatie bevat. De oligonucleotide primers die in deze studie worden gebruikt, staan hieronder vermeld.
TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3"
TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3"
TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3"
TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3"
OPMERKING: Oligonucleotide primers TS-1F, TS-1R, TS-2F en TS-3F gloeien op de polynucleotidesequentie van de β-subeenheid (GenBank toetredingscode: CP051286.1). Primers TS-4F en TS-5F gloeien op de polynucleotidesequentie van de α-subeenheid (GenBank toetredingscode: CP053865.1). - Gebruik 200 ng van elke plasmideconstructie (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T en pEBA-10-βS377A) om competente cellen van E. coli expressiestam CB149 te transformeren, zonder de trp operon26. Kies na succesvolle kolonievorming één enkele kolonie en kweek de cellen in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml ampicilline. Kweek in de bacteriële incubator bij 37 °C 's nachts. Bereid glycerolvoorraden celkweek voor, bewaar langdurig bij -80 °C of gebruik onmiddellijk voor recombinante eiwitexpressie.
OPMERKING: Een enkele eenpuntsmutatie in α-of β-subeenheid van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase kan de enzymfunctie of lagere synthese van L-tryptofaan in E. coli stam CB149 aantasten. Overweeg het gebruik van E. coli stam BL21(DE)pLys-S of Rosetta (DE3)pLys-S als er geen expressie of lagere hoeveelheden recombinant α2β2StTS complex wordt gedetecteerd in een SDS-PAGE gel.
- Gebruik construct pEBA-10 expressievector22 als DNA-sjabloon tijdens twee stappen polymerasekettingreactie om specifieke puntmutaties in de β-ketenTS-polynucleotidesequentie te introduceren.
- Expressie van wild type en mutante vorm van α2β2StTS complex in E. coli
- Kweek E. coli expressiestam met de gewenste constructie in een vers en steriel 50 ml LB-medium met 50 μg/ml ampicilline. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
- Voeg 5 ml van de nachtcelkweek toe in een verse en steriele 2x 1000 ml LB met 2% glycerol plus ampicilline (2,8 L Fernbach-kolf). Kweek celkweek met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
- Induceer recombinante eiwitexpressie wanneer de OD600 0,6-0,8 bereikt door toevoeging van IPTG bij een eindconcentratie van 0,4 mM, gevolgd door incubatie bij 30 °C 's nachts met schudden bij 200 tpm.
- Oogst de cellen door gedurende 20 minuten bij 4.000 x g in 4 °C te centrifugeren. Verwijder het supernatant en hang de celkorrels met koude lysisbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, met 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA en 1 mM PMSF) opnieuw op tot een eindvolume van 50 ml buffer.
OPMERKING: Cellen kunnen langdurig bij -80 °C worden opgeslagen of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering. Om cellen op te slaan, splitst u de celsuspensie in 2 x 50 ml wegwerpcentrifuge conische buizen en houdt u celkorrels op -80 °C tot de eiwitzuiveringsstap. De expressie van mutante en wilde type vorm van α2β2StTS complex in LB bouillon levert 125-150 mg eiwit per liter. Overweeg het schaalprotocol omhoog of omlaag om aan specifieke eisen te voldoen.
- Zuivering van wild type of mutante vorm van α2β2StTS complex
OPMERKING: Het volgende protocol is bedoeld om het niet-gelabelde recombinante wilde type of de mutante vorm van het recombinant α2β2StTS complex binnen 1 dag, afhankelijk van vaardigheden en inspanningen. Om de zuiveringstijd te verkorten, moet u de uitsluitingskolom grootte in buffer eerdere eiwitzuivering/-expressie gelijksluiten. Zuivering van wild type of mutant α2β2StTS-complex wordt uitgevoerd door een zuivering in twee stappen bestaande uit ammoniumsulfaatfractie en een grootte-uitsluitingschromatografie. Dit protocol levert 60-100 mg puur complex op uit 1 L LB medium.- Verstoor celkorrels door sonicatie met behulp van een digitale sonifier met 1/2" Horn-sonde (of een vergelijkbare apparatuur). Voer 20 cycli uit bij 80% amplitude duty cycle op ijswaterbad met 10 s pulse en 20 s rust of tot volledige celverstoring.
- Centrifugeer het cellysaat gedurende 30 minuten bij 25 °C op 30.000 x g. Aspireer supernatant, zodat de pellet niet uit de buis loskomt. Filtreer de geklaarde supernatantfractie met een filter van 0,45 μm bij kamertemperatuur.
- Beoordeel het beginvolume van de verduidelijkte supernatansfractie. Voeg langzaam kleine hoeveelheden ammoniumsulfaat per keer toe, totdat een verzadiging van 20% is bereikt (11,51 g / 100 ml). Voer ammoniumsulfaatfractie uit bij 25 °C. Roer de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten en vermijd bubbels.
- Centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C. Breng de 20% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 20% pelletfractie in 20 ml monsterbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, met 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en 2 mM dithiothreitol) en bereid een monster voor om SDS-PAGE-gel uit te voeren. Gooi de 20% pelletfractie weg.
- Beoordeel het beginvolume van de 20% supernatansfractie. Voeg ammoniumsulfaat toe tot 30% verzadiging is bereikt (5,94 g / 100 ml), roer de oplossing, vermijd bellen en centrifugeer zoals voorheen. Breng de 30% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 30% pelletfractie voorzichtig in 20 ml monsterbuffer 2 en bereid een monster voor om SDS-PAGE gel uit te voeren. Gooi de 30% pelletfractie weg.
- Beoordeel het beginvolume van de 30% supernatansfractie. Voeg ammoniumsulfaat toe bij een verzadiging van 40% (6,14 g / 100 ml), roer de oplossing, vermijd bellen en centrifugeer zoals voorheen. Breng de 40% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 40% pelletfractie voorzichtig in 10 ml monsterbuffer 2 en bereid een monster voor om SDS-PAGE gel uit te voeren. Gooi de 40% supernatante fractie weg.
OPMERKING: Beoordeel de kwaliteit van het αβStTS-complex met behulp van monsters van de 30% en 40% supernatant- en pelletfracties in een 12% SDS-PAGE gel25. Als u controleert of een ander mutant αβStTS-complex zich in de 40% supernatante fractie bevindt, gaat u verder met een verzadiging van 60% ammoniumsulfaat (13,0 g / 100 ml). Voorgezuiverde eiwit aliquots van de voorgezuiverde α2β2 StTS complex kunnen langdurig worden opgeslagen bij -80 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering op een grootte-uitsluitingschromatografiekolom (SEC). - Microcentrifugeer het eiwitmonster op 10.000 x g,20 min, 4 °C en laad de supernatansfractie op een HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR kolom bevestigd aan een snelle eiwit vloeistofchromatografie bij een debiet van0,5ml min -1 , voorheen geëquilibreerd in SEC buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 0,1 mM pyridoxaal fosfaat).
OPMERKING: Om grote hoeveelheden complex te zuiveren, laadt u een monster van 5 ml bij 20-25 mg ml-1 op een HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolom met een debiet van 1,5 ml min-1. - Beoordeel monsters verzameld langs de ammoniumsulfaatfractie en piekfracties uit de SEC-kolom op een 12% SDS-PAGE gel bevlekt met Coomassiebriljantblauwe vlek 25.
- Concentreer het wilde type of mutant α2β2StTS-complex met een 15 ml 100 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheid door te draaien bij 3.000 x g bij 4 °C. Breng het geconcentreerde eiwit over in een verse buis van 2,0 ml en microcentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) om aggregaten te verwijderen.
- Bepaal eiwitconcentratie24,bereid 0,5 ml aliquots bij 20-25 mg ml-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
3. Geoptimaliseerde kristallisatie voor wild type en mutante vorm van de α2β2StTS complex
OPMERKING: De initiële kristallisatieconditie voor de α2β2StTS-complex werd eerder gemeld in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine22.
- Bereid voorraadoplossingen voor voorafgaand aan de kristallisatietesten om een betere kristallisatiereproduceerbaarheid te bereiken. Om structurele studies met TS uit te voeren, kristalliseert u eiwitten met Na+ of Cs+ ion op de metaalcoördinatieplaats van het bi-enzymcomplex.
- Bereid 5 ml stamoplossing van 200 ml spermine in water en houd 500 μL aliquots bij -20 °C.
- Bereid 50 ml voorraadoplossing van 30% (m/v) PEG 8000 in water en bewaar 25 ml aliquots in een 50 ml wegwerpcentrifuge conische kolven bij 25 °C.
- Bereid een voorraadoplossing van 25 ml van 1 M CsCl in water en bewaar deze op 25 °C.
- Bereid een voorraadoplossing van 25 ml van 1 M NaCl in water en houd deze op 25 °C.
- Bereid 3x 50 ml stamoplossing van 1 M bicine en titreer met CsOH of NaOH om gebufferde oplossingen te verkrijgen bij pH 7,6, 7,8 en 8,0. Houd 25 ml aliquots bij 4 °C.
- Ontdooi een monster van α2β2StTS complex (20-25 mg ml-1) op een ijsbad.
- Microcentrifugemonster bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C om eiwitaggregaten te verwijderen.
- Breng de ontruimde supernatantfractie over in een schone microcentrifugebuis.
- Geschatte eiwitconcentratie24 en verdunde eiwit aliquots (150-200 μL) bij 15 mg ml-1 met 50 mM bicine-CsOH of -NaOH, pH 7,8 met 50 mM CsCl of NaCl. Houd het eiwitmonster op 25 °C.
- Bereid de reservoiroplossingen van 500 μL voor 3x 24-put zitdruppelplaten in steriele microcentrifugebuizen met een label van 1,5 ml. De reservoiroplossing bevat 50 mM bicine-CsOH of -NaOH, 50 mM CsCl of NaCl en PEG 8000. Varieer de concentratie PEG 8000 (6-11%) op de plaatkolommen en de concentratie spermine (2-8 mM) op de plaatrijen. Verander de pH van de buffer (pH 7,6, 7,8 en 8,0) voor elke set.
- Sluit de buizen en vortex krachtig ten minste 10 sec. Centrifugeer buizen bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C om bellen te verwijderen. Doseer 500 μL gebufferde oplossing in elk gelabeld reservoir.
- Gebruik een P-10 micropipet en doseer 5 μL eiwitoplossing bij 15 mg ml-1 per zitdruppel goed. Vermijd bubbels. Voeg 5 μL van elke correspondentreservoiroplossing toe aan de eiwitdruppel. Vermijd bubbels tijdens het mengen en pipetteer niet op en neer om het mengsel te homogeniseren.
- Plak de plaat vast met een transparante plakband en bewaar de plaat op 25 °C. Kristallen verschijnen in 2-5 dagen en groeien binnen twee weken tot hun volle afmetingen.
4. Röntgendiffractiegegevensverzameling en α2β2StTS complexe structuuroplossing
OPMERKING: Bereid voorafgaand aan het verzamelen van röntgendiffractiegegevens vooraf een cryoprotectantoplossing voor elk kristal voor. Gebruik de specifieke reservoiroplossing om 3 aliquots te bereiden die toenemende concentraties dimethylsulfoxide bevatten in oplossing (10, 20 en 30% v/v) en specifieke ligand(en). Dimethylsulfoxide bleek een beter cryoprotectant te zijn dan glycerol, ethyleenglycol en PEG 200-300.
- Oogst een groot enkel kristal met behulp van een cryoloop onder de stereoscopische microscoop.
- Pipet 2 μL van elke cryoprotectantoplossing die de neerslagoplossing bevat plus hogere concentraties dimethylsulfoxide en ligand(en) op een nieuwe afdekschuif.
- Week c rystalachtereenvolgens in elke druppel en laat het kristal 30 s in de cryoprotectant-oplossing equilibreren.
- Flash-cooling het cryo-beschermde kristal met behulp van een gasvormige stikstofstroom bij -173 °C (100 K) of dompel onder in vloeibare stikstof voor langdurige opslag in pucks.
OPMERKING: Vul een schuim Dewar met vloeibare stikstof, koel een kristallen puck vooraf af, bewaar kristallen in de cryogene opslag Dewar en verzend kristallen naar de synchrotron met behulp van een droge verzender. - Ga verder met het verzamelen van röntgendiffractiegegevens bij -173 °C. Neem röntgendiffractiegegevens op met een belichtingstijd van 0,5-4,0 s en oscillaties van 0,5°. Draai kristal 180-360°.
- Verwerk de röntgendiffractiebeelden met iMosflm27 om een reflectiebestand in de juiste ruimtegroep te genereren. Over het algemeen behoren α2β2StTS kristallen tot de ruimtegroep C 121 (C2).
- Schaal meerdere observaties van reflecties samen met Scala28, geïmplementeerd in het CCP4-pakket29.
- Los de structuur van de hoge resolutie α2β2StTS complex op door moleculaire vervanging met MolRep30 en een geschikt zoekmodel. Inspecteer het model en de elektronendichtheidskaart in Coot31 na een succesvolle structuuroplossing.
OPMERKING: Er zijn veel TS-kristallenstructuren afgezet in de Protein Data Bank met verschillende ligand(en). Gebruik voor een betere moleculaire vervangingsstap en een kortere tijd die past bij de nieuwere kristalstructuur het beste zoekmodel met ligand (s) van belang. Ga verder met de verfijning van de kristalstructuur in CCP429,30 of Phenix31. - Maak handmatige aanpassingen aan het model met Behulp van Coot32, gevolgd door automatische verfijning met Refmac29,33 of phenix.refine31,34. Bouw en verfijn het uiteindelijke model door iteratieve rondes van modelbouw in Coot32 en geautomatiseerde verfijning uit te voeren.
- Ga verder met de afzetting van coördinaten- en structuurfactoren op de website van de Protein Data Bank.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zuivering van de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase
De α-subeenheid (αStTS) en de β-subeenheid (βStTS) van het Salmonella typhimurium tryptofaan synthase werden gesubclod in de gemodificeerde pET SUMO vector. Figuur 1A toont representatieve SDS-PAGE resultaten van twee sterke banden die overeenkomen met de His6-SUMO-αStTS (lane αON) en His6-SUMO-βStTS (lane βON) fusion protein. Het zuiveringsprotocol dat in dit werk wordt beschreven, maakte het mogelijk om beide subeenheden binnen 2 dagen afzonderlijk te zuiveren. De eerste dag werd gebruikt om elk eiwit te zuiveren door Ni-NTA affiniteitschromatografie, ammoniumsulfaatprecipitatie gevolgd door His-SUMO-tag decolleté, verwijdering van His-SUMO-tag sporen en eiwitconcentratie. Figuur 1B en 1C tonen representatieve SDS-PAGE resultaten van respectievelijk de α-subeenheid en de β-subeenheid zuivering. Op de tweede dag werden het concentraat α-subeenheid, β-subeenheid en het α2β2StTS-complex van de α- en β-subeenheden geladen op een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie. Figuur 1D toont een typisch elutieprofiel van αStTS, βStTS en α2β2StTS complexen op een S-200 HR grootte uitsluiting kolom. Figuur 1E toont een representatief SDS-PAGE resultaat van de verzamelde piekfracties. De zuiverste piekfracties werden gepoold, geconcentreerd en de α2β2StTS-complex werd gebruikt voor eiwitkristallisatiestudies.
Zuivering van het wilde type en mutant α2β2StTS complex
Een ander snel en efficiënt protocol om het wilde type en de mutante vorm van de α2β2S. typhimurium tryptofaan synthase complex te zuiveren wordt in dit werk beschreven. Figuur 2 toont een weergave van de pEBA-10-constructie die het wildtype translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) codeert voor de α- en β-subeenheden22. Het tweestaps PCR mutagenese protocol om mutante vormen van het α2β2StTS complex te genereren is afgebeeld in figuur 3.
De codeergebieden van mutant α2β2StTS-complex in pEBA10 werden bevestigd door DNA-sequencing en gebruikt om E. coli-stam CB149-cellen te transformeren26. Het wilde type en de mutante vorm van de α2β2StTS complex werden overexpressie en de recombinante eiwitten werden binnen 1-2 dagen met succes gezuiverd. Ammoniumsulfaatfractie bij kamertemperatuur verwijderde gemakkelijk de meeste verontreinigingseiwitten uit het heterologe expressiesysteem (figuur 4A, rijstroken 20P, 30P en 40S). Een representatief elutieprofiel met relatieve elutiepositie van α2β2StTS (143.06 kDa) complex op een HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR grootte uitsluiting chromatografie kolom is weergegeven in figuur 4B. De zuiverheid van de uitgesloten piekfracties werd SDS-PAGE geanalyseerd vóór pooling (figuur 4C).
Optimalisatie van wild type en mutant α2β2tryptofaan synthase complexe kristallisatie
Aliquots van wild type en mutant α2β2StTScomplex bij 15 mg ml-1 werden gebruikt om 24-goed zittende druppelplaten op te zetten. Doorgaans werden druppels bestaande uit 5 μL eiwitoplossing en het equivalente volume reservoiroplossing geëquilibreerd tegen 500 μL reservoiroplossing (figuur 5). Spermine is nodig om het wilde type en mutant α2β2StTS complex22te kristalliseren. Terwijl de uiteindelijke concentratie spermine om het wilde type te kristalliseren 2 mM is, bleek de concentratie spermine om het mutantencomplex in dit werk te kristalliseren iets hoger te zijn (4-8 mM).
Grote enkelvoudige kristallen werden verkregen door een fijne kristallisatieoptimalisatie, variërend peg 8000 (6-11%) en bicine buffer pH. Kristallen met verschillende morfologieën verschenen in 2-5 dagen en kristallen groeiden binnen twee weken tot volledige grootte (figuur 6). Voorafgaand aan het verzamelen van röntgendiffractiegegevens werden kristallen gedrenkt in cryoprotectantoplossing (reservoirbuffer met 30% dimethylsulfoxide). Het geoptimaliseerde proces resulteerde in kwaliteitskristallen die geschikt zijn voor röntgendiffractiemetingen bij bijna atoomresolutie.
Röntgen diffractie data analyse
Een kristalstructuur van het wilde type α2β2StTS-complex werd voorbereid met methoden die in dit artikel worden beschreven en röntgendiffractiegegevens werden verzameld bij bijna atoomresolutie. Het kristal werd gedrenkt in cryoprotectieve oplossing met F9-remmer (2- ({[4- (Trifluorthoxy)Phenyl]Sulfonyl}Amino)Ethyldihydrogenfosfaat) en L-tryptofaan.
Een volledige röntgendiffractiegegevensset werd verzameld op de SIBYLS synchrotron beamline 12.3.1 bij de Advanced Light Source (Berkeley-CA) door het kristal 360° in stappen van 0,5° te draaien. Röntgendiffractie-intensiteiten werden verwerkt en gegevensverzamelingsstatistieken worden samengevat in tabel 1. Symmetrieanalyse geeft aan dat het kristal tot de monokliene ruimtegroep C2 behoorde. De eenheidscelparameters zijn a = 182,55, b = 59,30, c = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. De berekende waarde van de Matthews-coëfficiënt (Vm = 2,57 Å3 Da-1) suggereert de aanwezigheid van één TS-heterodaanmolecuul (αβ StTS) in de asymmetrische eenheid van het kristal met een oplosmiddelgehalte van 52,08%35,36. Alle röntgengegevens werden verzameld bij lage temperaturen (100 K) om de diffractiekwaliteit te verbeteren en het stralingsbederf te verminderen. De α2β2StTS kristalstructuur in complex werd opgelost door de moleculaire substitutiemethode met behulp van het wild type αβ StTS model in complex met de inhibitor F9 op de α-site en cesiumion op de metaalcoördinatieplaats (PDB ID-code: 4HT3). Het definitieve coördinatenbestand en de structuurfactoren werden in het VOB gedeponeerd met toetredingscode 5CGQ (figuur 7A). De kristalstructuur van het wilde type α2β2StTS-complex met remmer F9 op het enzym α -site (figuur 7B), cesiumion op de metaalcoördinatieplaats(figuur 7C),de cofactor pyridoxal 5'-fosfaat covalent gebonden aan βLys87 (figuur 7D), en het product L-tryptofaan op de enzym- β-site (figuur 7E) werd opgelost. Model 5CGQ is de hoogste resolutie α2β2StTS kristalstructuur die tot nu toe in de PDB is afgezet.
Figuur 1: Zuivering van de α- en β-subeenheden en de α2β2StTS complex. a) Recombinante eiwitexpressie. 12% SDS-PAGE gel van het overnight expressieprofiel van SUMO-αStTS (αON) en SUMO-βStTS (βON) na IPTG inductie bij 30 °C (α/β0 voorafgaande IPTG inductie). (B, C) Ni-NTA affiniteitschromatografie gevolgd door ammoniumsulfaatprecipitatie (60% verzadiging), (S) geklaard ruw extract (FT1) Ni-NTA kolomdoorlaat door monster (W) kolomwasmonster (E) eluaatmonster (60S) en (60P) supernatant en neerslagfracties na snelle centrifugeren, respectievelijk (D) SUMO-proteaseverteringsproduct(FT2) Ni-NTA-kolomdoorlaatmonster met α β. (D) elutieprofiel van αStTS-subeenheid (28,67 kDa), βStTS-subeenheid (42,86 kDa) en α2β2StTS-complex (143,06 kDa) met een HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-grootte uitsluitingschromatografiekolom. Elke uitvoering werd afzonderlijk uitgevoerd. (E) SDS-PAGE gels van de uitgesloten piekfracties van elke afzonderlijke chromatografie. Terwijl 15% SDS-PAGE gels bereid waren om α2β2StTS complex en αStTS subunit te analyseren, werd een 12% SDS-PAGE gel bereid om de βStTS subunit te analyseren. Lane MW, moleculaire gewichtsmarkeringen in kDa. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Weergave van de constructie pEBA-10. (A) Weergave van het wild type translationeel koppelend gen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) De vector bevat een ampicilline resistentie (amp) gen, een replicatie oorsprong (ori), een lacIq gen om een lac promotor beter uit te schakelen in afwezigheid van IPTG inductor, en de LacI-onderdrukte promotor. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Algemene weergave van het tweestaps PCR mutagenese protocol. De pEBA-10 vector werd gebruikt als een DNA-sjabloon. De eerste ronde van PCR werd voorbereid met primers TS-FW-NcoI en MUT-REV (een omgekeerde primer met een mutatie) om het eerste fragment te genereren en primers TS-Rev-SacI en MUT-FW (een voorwaartse primer met een mutatie) om het tweede fragment te genereren). Fragmenten werden gel gezuiverd en equimolarly gecombineerd, warmte gedenatureerd en gegloeid. De recombinante strengen werden uitgebreid met polymerase en deoxyribonucleotiden. De tweede ronde van PCR werd voorbereid met primers TS-FW-NcoI en TS-Rev-SacI. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Zuivering van wild type en mutante vorm van α2β2StTS complex. (A) 12% SDS-PAGE gel van monsters verzameld langs de ammoniumsulfaatprecipitatie met behulp van 20, 30, 40 en 50% ammoniumsulfaatverzadiging bij kamertemperatuur: (CE) ruw extract (S) en (P) supernatant en neerslagfracties na hoge snelheid centrifugeren. (B) Elutieprofiel van α2β2StTS (143.06 kDa) complex met een HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR grootte uitsluiting chromatografie kolom. (C) 12% SDS-PAGE gel afbeelding van de uitgesloten piekfracties. Lane MW, moleculaire gewichtsmarkers in kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Kristallisatie optimalisatie voor wild type en mutante vorm van α2β2StTS complex. Kristallen werden gekweekt in 50 mM Bicine-CsOH buffer met 50 mM CsCl2. De concentratie van polyethyleenglycol 8000 (6-11%) en spermine (2-8 mM) was gevarieerd om enkele grote kristalvormen te verkrijgen om structurele studies uit te voeren door röntgeneiwitkristallografie. (A) Bicine-CsOH, pH 7,6. B) Bicine-CsOH, pH 7,8. (C) Bicine-CsOH, pH 8,0. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Fotomicrograaf van kristallen van het wilde type en mutante vorm van α2β2StTS complex. Kristallen verschillen in morfologie, maar ze behoren tot de ruimtegroep C2. De kristallen groeiden na twee weken in de laatste omstandigheden tot hun volle omvang. Kristallen van ongeveer 0,20 x 0,15 x 0,10 mm groot. (A-D) PLP holokristallen in complex met cesiumion op de metaalcoördinatieplaats van de wildtypevorm (kolom A), mutante vorm α2β2 βQ114A (kolom B), α2β2 βK167T (kolom C) en α2β2 βS377A (kolom D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Algemene visualisatie van kristalstructuur en validatie van elektronendichtheidskaarten verkregen na kristalstructuur verfijning. (A) kristalstructuur van het wilde type α2β2StTS-complex met remmer F9 op het enzym α -site (geel gekleurd), cesiumion op de metaalcoördinatieplaats (blauw gekleurd), het cofactor pyridoxale 5'-fosfaatcovalent gebonden aan βLys87 (groen gekleurd) en het product L-tryptofaan op de enzym- β-site (cyaankleurig) bij 1,18 Angstrom. Terwijl de α-subunit lichtblauw gekleurd is, is de β-subunit gekleurd in zalm. (B-E) Elektronendichtheidskaarten gevormd op 1,0 r.m.s. niveau rond (B) remmer F9 (C) cesiumion (D) pyridoxaal-5′-fosfaat, en (E) L-tryptofaan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Gegevensverzameling en -verwerking | |
| Röntgenbron / Straallijn | ALS-straallijn 12.3.1 |
| Golflengte (Å) | 10,000 |
| Resolutie (Å) | 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18) |
| Totaal aantal reflecties | 2151280 (252941) |
| Totaal aantal unieke reflecties | 231646 (32187) |
| Ruimtegroep voor indexeren, schalen en samenvoegen | C 1 2 1 |
| Celafmetingen | |
| a, b, c (Å) | 182.55, 59.30, 67.37 |
| α, β, γ (°) | 90.00, 94.82, 90.00 |
| Mozaïek | 0.61 |
| Matthews volume VM (Å3 Da-1) | 2.57 |
| Rmeas (%) | 8.6 (93.0) |
| 14.7 (3.0) | |
| CC1/2 (%) | 0.999 (0.778) |
| Volledigheid (%) | 98.6 (94.2) |
| Veelheid | 9.3 (7.9) |
| Verfijningsstatistieken | |
| Rwork/Rfree (%) | 14.04 / 16.05 |
| RMSD-obligatielengte (Å) | 0.0120 |
| RMSD-bindingshoek (°) | 14,059 |
| Ramachandran favoriet | 515 (96.44%) |
| Ramachandran toegestaan | 16 (3.00%) |
| Ramachandran niet toegestaan | 3 (0.56%) |
Tabel 1: Gegevensverzameling en -verwerking. Waarden tussen haakjes zijn voor de buitenste schil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben met succes mutante vorm α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, en α2β2 βS377A StTS complexen voor structuur-functie correlatie studies. Aanvankelijk hebben we geprobeerd de mutanten te zuiveren met behulp van een eerder zuiveringsprotocol22, dat α2β2StTS-complex kristallisatie met PEG 8000 en spermine vereist tijdens zuivering. Hoewel de kristallisatiesnelheid afhangt van de mutante vorm en van de concentratie van het complex in oplossing, is het moeilijk te voorspellen wanneer kristallen in een groot oplossingsvolume verschijnen. Kristallisatie kan worden bereikt na lange perioden (48-96 uur) of noodzakelijk is de toevoeging van extra hoeveelheden PEG 8000 na kristallisatie-initiatie15.
Helaas werden mutante vormen van α2β2StTS-complex die in dit werk werden gepresenteerd, niet met succes gezuiverd met behulp van dit protocol, omdat ze niet kristalliseerden tijdens de eerste stappen van het protocol, waardoor kristallografische studies werden aangetast. Daarom hebben we een eenvoudig en efficiënt zuiveringsprotocol gemaakt dat ammoniumsulfaatfractie en grootte-uitsluitingschromatografie omvat, die hoge opbrengsten van wildtype en mutante vorm van α2β2StTS-complex geven. Dit protocol is sneller (1-2 dagen) en reproduceerbaar in vergelijking met het vorige protocol (5-7 dagen)15,22, omdat er geen kristallisatievereisten en protocolproblemen zijn bij zuivering. Daarnaast hebben we nieuwe expressieconstructies en protocol gemaakt om grote hoeveelheden van de α-subeenheid, β-subeenheid en de reconstitutie α2β2StTS-complex uit de isolaten te zuiveren.
Toekomstige toepassing omvat de recombinatie van wilde type en mutant sub-eenheden om functionele en structurele studies uit te voeren. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, en α2β2 βS377A complex gekristalliseerd in omstandigheden die hogere concentraties spermine (4-8 mM) bevatten in vergelijking met de wildtypevorm (2 mM). Daarom is het de moeite waard om tijd te besteden aan het verbeteren van de kwaliteit van eiwitkristallen door de concentratie van precipitanten en bufferpH te variëren. Enkele grote kristalvormen groeiden willekeurig in bicine gebufferde oplossing (pH 7,6-8,0) met 6-11% PEG 8.000. De methoden die in dit werk worden beschreven, zullen worden gebruikt om kristalstructuren van het wilde type en mutante vormen van de α2β2 complex met verschillende liganden binnen de α- en β-actieve locaties voor te bereiden, waarbij verschillende tussenproducten en overgangstoestanden worden nagebootst die betrokken zijn bij de omzetting van indool en serine in tryptofaan. De kristalstructuren van deze mutanten zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door belangrijke residuen in de L-tryptofaansynthese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets openbaar te maken en verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse National Institute of Health (GM097569).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
References
- Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
- Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
- Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
- Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
- Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
- Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
- Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
- Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
- Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
- Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
- Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
- Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
- Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
- Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
- Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
- Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
- Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
- Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
- Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
- Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
- Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
- Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Lowry, O. H., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
- Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
- Vagin, A., Teplyakov, A.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
- Matthews, B. W.
- Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).
