Summary
כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.
Abstract
טכניקות מיקרו-אלקטרוקטרודה תאיות קונבנציונליות לכימות אלקטרופיזיולוגיה של קרדיומיוצית הן מורכבות ביותר, עתירות עבודה, ובדרך כלל מבוצעות בתפוקה נמוכה. התרחבות מהירה ומתמשכת של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC) מציגה סטנדרט חדש במחקר לב וכלי דם ושיטות חלופיות נחוצות כעת כדי להגדיל את התפוקה של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת תא אחד. VF2.1Cl הוא צבע רגיש למתח שנגזר לאחרונה המספק ערוץ יחיד מהיר, תגובה בעוצמה גבוהה לתנודות בפוטנציאל הממברנה. יש לו קינטיקה עדיפה על אלה של מחווני מתח קיימים אחרים ועושה נתונים פונקציונליים זמינים שוות ערך לזה של טכניקות מיקרו-ectrode מסורתיות. כאן, אנו מדגימים אפיון פוטנציאלי פעולה פשוטה ולא פולשנית ב cardiomyocytes אנושיים בקצב חיצוני באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית ובמחיר סביר מאוד.
Introduction
מידול אלקטרופיזיולוגי של קרדיומיוציטים ובניית פלטפורמות יעילות להקרנת תרופות לב חיוניות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למגוון הפרעות קצב. התרחבות מהירה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) יצרה חדירה מבטיחה למידול מחלות אנושיות ולחקירה פרמקולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בחולה מבודד (iPSC-CM). טכניקות "תקן זהב" לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תאים אלה באמצעות מהדק תיקון (מהדק זרם) יכולות לכמת את פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיה ומשך זמן, עם זאת, שיטה זו מורכבת ואיטית להפליא, ואינה מתאימה לרכישת נתוני תפוקה גבוהה1. iPSC-CMs מדווחים באופן קבוע יש פוטנציאל ממברנה דיאסטולית מוגברת וזרם דליפה מוגבר בהשוואה לקרדיומיוציטים ילידים למבוגרים2. הוא הציע כי גודל תא קטן יותר קיבוליות ממברנה מופחתת שנצפו iPSC-CMs עלול לייצר כמה שגיאה שיטתית בעת שימוש בטכניקת מלחציים הנוכחי, אולי להסביר את הסטיות האלה3. על מנת למקסם את התועלת של פלטפורמת iPSC-CM, שיטה נוספת היא בעלת ערך כדי להגדיל את התפוקה ולהבטיח דיוק נתונים בעת אפיון שינויי מתח transmembrane ברמת תא יחיד ב- iPSC-CMs.
צבעים רגישים למתח (VSD) כבר זמן רב שיטה מוצעת כדי לספק ניתוח מהיר יותר, לא פולשני שווה ערך של קינטיקה AP לב בהשוואה לאלה של טכניקות מסורתיות4. מחקר שנערך לאחרונה הדגים את ההתאמה של פוטומטריה רגישה למתח רציטרי כדי לכמת במדויק את AP הלב5. יתר על כן, היכולת להגדיל בקלות את הגישות פוטומטריה אופטית מעניק טכניקה זו בקנה מידה גדול מסכי cardiotoxicity קריטי בפיתוח תרופות טיפוליות (למשל, CiPA). פיתוח פרוטוקולי cardiotoxicity מתוקננים במחקר מרובה אתרים עיוור באמצעות מערך microelectrode וטכניקות אופטיות חישת מתח הדגים את הערך העיקרי של גישה זו6.
צבעים פוטנציומטריים רבים זמינים מסחרית, ופיתוח סינתטי מתמשך של בדיקות חדשות מראה פוטנציאל מרגש לייעול האפקטיביות שלהם על פני מגוון מבנים לב ועצביים. VSD האידיאלי יהיה קינטיקה מוגברת ורגישות, תוך הצגת עומס קיבולי מופחת, ליטוף פוטו וציטוטוקסיות. VF2.1Cl מסונתז לאחרונה (FluoVolt) מבטא רבים של תכונות מועילות אלה בעיקר בשל המבנה המולקולרי מבוסס חוט החדש שלה, משותף על ידי חברים אחרים של מתח Fluor החדש (VF) משפחה7. בניגוד VSDs אלקטרוכרומי נפוץ שבו בדיקות פשוטות מצומדות מולקולרית וחשמלית לקרום הפלזמה, צבע זה מורכב חוט סינתטי מוחדר באופן פסיבי, המשתרע על פני ממברנה אשר משייך תורם עשיר באלקטרונים עם פלואורופור פלואורסין שונה (FITC). פרטים מכניים מסופקים באיור 1. צבע זה מדגים רגישות מעולה לתנודות מתח הממברנה, ומציג שינוי של 27% בעוצמת הפליטה לכל 100 mV לעומת ~ 10% שנראה בבדיקות נפוצות אחרות במהירויותדומות 7. בנוסף, מערכות PeT מבוססות חוט אינן מתקשרות ישירות עם השדה החשמלי הסלולרי המייצר הפרעות חשמליות מינימליות ושינויים זניחים בעומס הקיבולי התאי.
איור 1: פרמטרים כימיים, ספקטרליים ומכניסטיים של צבע VF2.1Cl. (A)מבנה כימי של תכונות מולקולריות VF2.1Cl. לציין כוללים קבוצות אלקיל מרובות בתוך חוט מולקולרי פנילן וינילן אשר להקל על החדרה לתוך קרום הפלזמה. קבוצת חומצה גופרתית טעונה שלילית הצומדת בגשושית FITC מבטיחה ייצוב פלואורופור על פני השטח החוץ-תאיים ומסייעת ליד החדרה מאונכת ביחס לשדה החשמלי של דו-שכבתי השומנים. (B)סכמטי פשוט של VF2.1Cl מאונך מוטבע לתוך קרום הפלזמה של תא יעד. (C)ספקטרום ספיגה ופליטה של צבע VF2.1Cl. ספקטרה זהה לזו של בדיקות FITC ו- GFP סטנדרטיות. (ד)תיאור של מצב הפעולה המכניסטי של VF2.1Cl. בתנאי מנוחה (היפרפולרי), מתחים תאיים שליליים מניעים אלקטרונים חופשיים לכיוון הפלואורופור של הרוסטרל. שפע אלקטרונים מבטיח העברת אלקטרונים המושרה על ידי תמונה (PeT) מועדף כמסלול מחוץ למצב הנרגש לאחר העירור האופטי, למעשה מרווה פלואורסצנטיות. לעומת זאת, פוטנציאל ממברנה דה קוטבי משפיע על תנועת אלקטרונים כלפי מטה ומעדיף פלואורסצנטיות על עירור אופטי. התגובה הפלואורסצנטית המתקבלת קשורה באופן ליניארי למתח הממברנה וניתן להשתמש בה במדויק כדי לאסוף מידע זמני מפורט על קינטיקה אלקטרופיזיולוגית תאית. (E)נציג brightfield (עליון) ופלואורסצנטיות ב 470 ננומטר (נמוך יותר) תמונות של קרדיומיוציטים לפולין טעון עם VF2.1Cl. (F)Z מחסנית Z של קרדיומיוציטים טעון יחיד. החצים מציינים אזורים של לוקליזציה ברורה של VF2.1Cl לממברנה התאית. תמונות נרכשו עם מערכת קונפוקלית דיסק מסתובב המורכבת ראש קונפוקלי דיסק מסתובב X-lightv3 עם תבנית חור סיכה 50 מיקרומטר; תאורת LDI-7; מצלמת Prime95B ומטרת PlanApo Lambda 100x. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הבדיקה FITC הצומדת ל- VF2.1Cl מבטיחה שניתן יהיה להשתמש בה ביעילות בתצורות מסנן רגילות ו- GFP, והיא דורשת רק מערכת רכישה של ערוץ אחד, שתיהן תכונות נפוצות של פלטפורמות הדמיה פלואורסצנטיות. ניתוח של מונוליות IPSC-CM אנושי צפוף עם צבע זה דווח לאחרונה8,9,10,11. הפרוטוקול שלנו שונה ממחקרים אלה עקב החקירה שלנו של iPSC-CMs יחידים, מבודדים, ללא הפרעה על ידי ההשפעות החשמליות והפרקרינית של monolayers סינכרוני צפוף, והשימוש שלנו במערכת פוטומטריה במחיר סביר וניתן להתאמה אישית בניגוד לסידורי הדמיה קונפוקליים או רחבים מורכבים.
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לרכישה וניתוח מהירים של APs אופטי חזק מקרדיומיוציטים אנושיים מבודדים וקרדיומיוציטים מקומיים (ראה קובץ משלים). אנו משתמשים VF2.1Cl בשילוב עם המדינה הניתנת להתאמה אישית של פלטפורמת האמנות למדידות פוטומטריה של תא יחיד. פרוטוקולים ניסיוניים אלה אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי האוניברסיטאי גטינגן (מס '10/9/15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות סלולריות
הערה: IPSCs אנושיים המשמשים בפרוטוקול זה נגזרו מתורמים בריאים והובדלו בשכבות מונו-שכבתיות באמצעות אפנון מולקולות קטנות מוגדרות לחלוטין של טכניקות איתות וטיהור לקטט כפי שתואר בעבר12,13,14. iPSC-CMs נשמרו כל 2-3 ימים עם מדיום תרבות המתואר להלן.
- הכן מדיום תרבותי של בינוני בזאלי (RPMI 1640) ותוספת של 2% (B27). יש לאחסן ב-4 °C (75°F). יש להשתמש בטמפרטורת החדר (RT).
- הכן מדיום ציפוי של בינוני בזאלי (RPMI 1640), תוספת של 2% (B27) ומעכב רוק 1:2000. יש לאחסן ב-4 °C (75°F). השתמש ב- RT.
- מעיל מעוקר 10 מ"מ זכוכית עגולה #0 מכסה עם 150 μL של 1:60 גורם ללא פקטור מטריצת קרום מרתף חינם ודגרה ב 4 °C (4 °F) עבור 4 שעות.
הערה: אופטימיזציה של נפח כיסוי יש צורך להבטיח את הזכוכית כולה מכוסה תוך שמירה על מתח משטח נאות כדי למנוע שפיכה. 150 μL מומלץ עבור כיסויים עגולים 10 מ"מ. גודל אצווה, סוג כיסוי, כיסוי נפח וסוג צלחת תרבות יכול להתאים לצרכים של הנסיינים. - התחל ניתוק iPSC-CM עם ריאגנט דיסוציאציה של תאים מבוססי EDTA. ודא כי monolayer מנותק לחלוטין על ידי שטיפה בעדינות עם פיפטה 1,000 μL.
- מעבירים את המתלים הסלולריים לצינור 15 מ"ל ומוסיפים ציפוי כפול. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-100 x גרם.
- resuspend הכדור עם נפח הרצוי (נפח resuspension) של מדיום ציפוי. ספירת תאים באופן ידני או אלקטרוני.
- בחר צפיפות אופטימלית לכל כיסוי (15,000) אשר יאפשר ניתוח תאי מבודד מאוחר יותר.
- חשב את הנפח של מתלה סלולרי 'פעיל' (A) הדרוש כדי צלחת כל כיסויים בצפיפות הרצויה. החל את הנוסחה הבאה ונסוג לתוך צינור נפרד:
- חשב את עוצמת הנפח של מדיום ציפוי נוסף (B) הדרוש כדי להתאים לכל כיסוי בנפח הרצוי. החל את הנוסחה הבאה והוסף את הנפח המתקבל לצינור של השעיה פעילה:
- הסר את המטריצה מכיסויים והחל את 'עוצמת הכיסוי' של השעיית התא (A+B) על כל כיסוי. באופן קבוע resuspend בצינור כדי להבטיח אפילו הפצה סלולרית.
- דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 1 שעות. ממלאים בעדינות את הבאר בחישוב בינוני.
- לאחר 24 שעות, להחליף מדיה עם בינוני תרבות נורמלית ולשמור כל 2-3 ימים.
2. התקנה ניסיונית
- צייד מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות הפוך בהגדלה של פי 40, עדשת צמצם מספרי גבוה (N.A: > 0.75) כדי לערוך ניסויים.
- זוג נורית LED לבנה חמה במהירות ליציאת התאורה המשודרת של המיקרוסקופ. הכנס מסנן אדום פשוט של 660 ננומטר לנתיב האור ששודר.
הערה: אור זה יכול להיות מופעל לאורך ניסויי פוטומטריה כדי לצפות במדגם מבלי לזהם את האות הפלואורסצנטי הירוק. - הר ראש LED מיתוג מהיר 470 ננומטר להקלטת פוטומטריה. הכנס מסנן עירור 470/40 ביציאת האפיפלואורסצנטית של המיקרוסקופ כדי לנקות את האור שנוצר על-ידי נורית ה- LED.
הערה: לכימות אותות אופטימלי מומלץ מערכת תאורה עם בקרת משוב במהירות גבוהה של פלט אופטי. - הכנס קוביית מיקרוסקופ המכילה מפצל קרן מעבר באורך 495 ננומטר בקרוסלת יחידת המראה בתוך המיקרוסקופ.
- התאם זרוע זיהוי המכילה דיאפרגמת שדה מתכווננת ליציאת המיקרוסקופ C-הרכבה כדי לאפשר בחירת אזור עניין.
- בנפרד זוג גלאי photomultiplier (PMT) ומצלמת USB למיקרוסקופ. זה יהווה את הבסיס של מערכת זיהוי הפליטה.
- הכנס קוביית מסנן המכילה מפצל קרן מעבר ארוך של 565 ננומטר ומסנן פליטה של 535/50 ליציאת PMT. זה מפצל את אור הפליטה בין שני הגלאים.
הערה: מצלמה המחוברת ליציאה המשודרת של מערכת זיהוי הפליטות יכולה לזהות אור משודר מתחת לברייטפילד לאורך כל הניסויים. - צמד את PMT לאספקת חשמל ומגבר PMT. חבר את פלט מגבר PMT לפין קלט אנלוגי של מערכת רכישת נתונים.
- סנן נתונים אנלוגיים מה- PMT במהירות של 1 קילו-הרץ ומעלה.
- דיגיטציה של נתונים בתדר שהוא לפחות כפול מזה של התדירות הגבוהה ביותר הקיימת באות אנלוגי (2 kHz ומעלה) כדי למלא קריטריוני Nyquist ולמנוע כינוי.
3. טעינה סלולרית עם VF2.1Cl
הערה: כל השלבים הכרוכים בצבע זה חייבים להתבצע בתנאי תאורה חלשה.
- הכן את פתרון האמבטיה של טיירוד (ב- mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7.35 וחם עד 37 °C (7°F).
- הכן aliquot של פתרון טעינה בצינור microcentrifuge על ידי ערבוב 5 μL של 1,000x VF2.1Cl ו 50 μL של 20% פתרון פולוקסמר solubilizing.
- יש למרוח 5 מיקרו-אל של תמיסת הטעינה על 5 מ"ל של הפתרון של טיירוד מחומם (ריכוז צבע 0.1x) בצלחת פטרי 20 מ"מ.
הערה: ריכוז הצבע הסופי הוא פי 0.1. זה 1/10th שהוצע על ידי היצרן. זה חוסך במשאבים, מבטיח ציטוקסיות זניחה, וחשוב מכך, עדיין שומר אותות אופטיים ברורים מתאים טעונים עם יחסי אות לרעש גבוהים. - מוסיפים לצלחת פתק כיסוי IPSC-CM יחיד ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- להרכיב תא הדמיה תא חי מחומם. לעלות על במת המיקרוסקופ ולמלא עם 500 μL של הפתרון של טיירוד טרי.
- לשטוף את כיסוי עם פתרון טרי של טיירוד ב 37 °C (50 °F).
- יש למרוח בזהירות את כיסוי ה-iPSC-CM על תא האמבטיה שהתחמם מראש באמצעות מלקחיים עדינים.
הערה: ודאו שהתא ותכולתו תמיד מחוממים בטמפרטורות פיזיולוגיות. אם תרצה, התחילו עם זלוף מתמשך של הפתרון של טיירוד מחומם.
4. גירוי שדה חשמלי
הערה: הפעלה חיצונית של iPSC-CM היא אופציונלית אך שימושית לתקנון של דינמיקה תאית ופרמטרים ניסיוניים. זה מגביר את קלות הניתוח ומאפשר חקירה של השפעות תלויות תדירות.
- חברו תוספת גירוי עם שתי אלקטרודות פלטינה מרווחות זו מזו ב-5 מ"מ לתא ההקלטה.
- חבר ממריץ חיצוני לתוספת הגירוי. מוגדר לפולסים דו קוטביים של 5 ms ב 0.5 הרץ.
- לקבוע מתח גירוי אופטימלי על ידי הגדלת הגירוי מ 1 V ומעלה. גירוי סף מוגדר כמתח הנמוך ביותר שבו תאים מתחילים להתכווץ. החל מתחים בערך 25% מעל סף זה. הטווח הנורמלי הוא בין 1 V ו 30 V.
- תקן תדירות גירוי עם הממריץ החיצוני או הפעל אותו באמצעות תוכנת רכישה.
5. רכישה פוטנציאלית של פעולה אופטית
הערה: פרוטוקול זה משתמש בתוכנה מסחרית לרכישה וניתוח.
- דמיינו את המיאוציטים בתצוגת Brightfield באמצעות נתיב האור המשודר ומצלמת ה- USB.
- בחר תא מבודד וחתוך בחוזקה את הנתיב האופטי שלו עם הסרעפת של השדה המבטיחה שרק אור מתא העניין מנוטר.
- הפעל את מגבר PMT והגדר את אספקת PMT ל- 750 V.
- הפעל את פרוטוקול הגירוי (ראה שלב 4) יחד עם תוכנת הרכישה ובו זמנית הפעל את נורית העירור של 470 ננומטר. זה האחרון יכול להיעשות באמצעות לוח מרוחק או אוטומטי בעוצמה קבועה (אות TTL).
- התאם רווח והיסט של מגבר PMT כדי לוודא שהאות אינו רווי וממוטב לטווח הזיהוי של מערכת ההקלטה.
- הקלט 10 סריקות המבטיחות זיהוי פוטנציאל פעולה יציב.
- המשך להקליט והזז מיד את שלב המיקרוסקופ כדי לרכוש בקצרה אות רקע מאזור נטול תאים. כבה את נורית העירור.
הערה: ערך רקע זה(היסט F) ישמש לחשבון כל פלואורסצנטיות ברקע. - אם תרצה, מקומי לשוטט תרופות התייחסות כגון 1 μM nifedipine כדי לזהות תגובות הסלולר מניפולציה פרמקולוגית.
- באופן רציף, חזור על שלבים 5.2-5.7, בכל פעם בחירת תא חדש. החליפו כיסויים אם רוצים להבטיח מחזור ניסיוני גבוה בישיבה אחת.
הערה: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות מתוארים באיור 2.
6. ניתוח נתונים
- פתח הקלטה שמורה עם תוכנת הניתוח וממוצע 10 סריקות המכילות פוטנציאל פעולה מגורה מתא בודד.
- קח ממוצע של האות הבסיסי המייצגהיסט F והפחת אותו מהעקב הממוצע.
- חשב ∆F/F0 עם הנוסחה הבאה (כאשר F נמדד פלואורסצנטיות ו- F0 הוא פלואורסצנטיות דיאסטולית):
- זהה את קו הבסיס של המעקב (דיאסטולי) ואת תחום העניין (AP) ולמדוד את הפרמטרים הפוטנציאליים הרצויים של פעולת הלב. זה כולל אך אינו מוגבל לזמן הריקבון עבור 50% (APD50) ו 90% (APD90) repolarization.
- יצא את הנתונים מתא בודד זה לתוכנת גיליון אלקטרוני.
- חזור על שלבים 6.1 – 6.5 עבור כל ההקלטות. להעריך תוצאות עם בדיקות לא משוערות מתאימות או ניתוח של שונות.
איור 2: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות. (A)תרשים זרימה של פרוטוקול טעינה מלא של VF2.1Cl עבור iPSC-CMs וקרדיומיוציטים מקומיים. (B)סכמטי פשוט יותר של מפצל קרן (BS) ותצורות מסנן המשמשות בפרוטוקול זה לעריפה וזיהוי של פליטת VF2.1Cl בתגובה לשינויים במתח transmembrane. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3: פרופילי פוטנציאל פעולה אופטי (AP) של קרדיומיוציטים מקומיים מבודדים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם נגזרים קרדיומיוציטים (iPSC-CM). (A)AP אופטי מייצג של קרדיומיוצייט מורין יחיד (במרכז) עם ממוצע ± SEM של APD50 ו- APD90 (n = 7, מימין). (B)AP אופטי מייצג של iPSC אנושי יחיד נגזר cardiomyocyte (במרכז) עם ממוצע ± SEM של APD50 ו APD90 (n = 48, מימין). (C)מניפולציה פרמקולוגית של IPSC-CM AP (במרכז) עם 1 μM nifedipine. ממוצע ± SEM של APD90 שינוי לאחר יישום nifedipine (n = 5). **p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
יחס אות לרעש גבוה נצפה באופן קבוע בדגימות שלנו, למרות שדה הראייה המופחת בעת התמקדות בתא אחד. רעש נוסף נצפה ב- iPSC-CMs קטנים יותר, אך זה לא הפריע לניתוח לאחר ממוצע ההרכב. מורפולוגיה AP מוגדרת בבירור, נותן סקירה יסודית של תפקוד אלקטרופיזיולוגי הסלולר מכניקת קוטביות על פני מבנים cardiomyocyte. תכונות של הערה הן מהירות upstroke חדה המתוארת בעבר ומאפייני שלב 1 בולטים של קרדיומיוציטים מורין (APD50: 58.34±17.98 ms, APD90: 160.9±30.15 ms, n = 7; איור 3א) אשר נבדלים מורפולוגית מאותות אופטיים IPSC-CM אנושיים (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n = 48; איור 3B). ראינו שיעור גבוה יותר של הלבנת תמונות ורעילות תאית לאחר חקירה אופטית בקרדיומיוציטים מקומיים בהשוואה ל- iPSC-CMs אנושיים מתורבתים. פרוטוקולים להכנת וטעינת צבע בקרדיומיוציטים מקומיים כלולים בחומר המשלים.
IPSC-CM אנושי מגיבים למניפולציה פרמקולוגית עם nifedipine (1 μM). ידוע סוג L Ca2 + ערוץ (CaV1.2) אנטגוניסט, nifedipine צפוי להקטין את משך AP בתאים עם תפקוד פיזיולוגי. במהלך יישום תרופות רציף, נצפתה ירידה של 41.5% ב- APD90 (n = 5), דבר המצביע הן על הביטוי הפיזיולוגי של ערוצי CaV1.2 בתאים אלה והן על הפונקציונליות של הדמיה מבוססת VF2.1Cl כפלטפורמה למחקרי סינון תרופות לב פוטנציאליים בעלי תפוקה גבוהה (איור 3C).
חומר משלים: קרדיומיוצית מורין מקורית הכנה להדמיית מתח. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי כדי לרכוש בקלות פרופילי AP מפורטים מ- iPSC-CMs מבודדים המתאימים למידול אלקטרופיזיולוגי והקרנת תרופות לב. אנו מזהים APs רגילים וחזקים מה- iPSC-CMs שלנו עם זרעים דלילות, מה שמרמז הן על פונקציונליות המחוון והן על נאמנות מתודולוגית.
בשל הספקטרום הרחב של מתודולוגיות מסחריות לתכנות מחדש של iPSC וחוסר סטנדרטיזציה לפרוטוקולי בידול לב, מודלים מבוססי iPSC יכולים להראות שונות עצומה בתפקודם ובמורפולוגיה16. זה יכול גם לעכב את האפקטיביות של מחקרי cardiotoxicity. אנו מדווחים על תגובות חזקות בדרך כלל לחקירה ניסיונית מורחבת עם ציטוקסיות מינימלית המושרה על ידי מחוון בעוצמות אור עירור נמוכות. סטנדרטיזציה של דיסוציאציה בסיסית וזריעת כיסוי היא קריטית כדי להבטיח איכות עקבית של תכשירי iPSC-CM. כיסויים רופפים, שניתן להכניס ולהחליף בקלות בתוך פלטפורמת ההדמיה, שימושיים להפליא לרכישת נתונים מהירה ואפיון של קרדיומיוציטים בודדים. עם זאת, יש לציין כי אנו צופים ירידה קלה בכדאיות התא לאחר תקופות ממושכות (כלומר, יותר מ -4 שבועות) של תרבות דלילה על כיסויי זכוכית.
הבנייה המודולרית של מערכת פוטומטריה במהירות גבוהה המתוארת בשלב 2 היא בעלת חשיבות קריטית לפרוטוקול זה. הגדרות רבות המבוססות על אופטיקה זמינות מסחרית וניתן למטבן למגוון רחב של דרישות הקלטת אותות. אלה נעים בין הדמיה כמותית באמצעות מצלמות שטח גדולות ברזולוציה גבוהה ועד למדידות פוטומטריה של אות כולל מאזור מוגדר. באמצעות האחרון, אנו לכמת פלואורסצנטיות במהירות גבוהה מאזור מסכה יחיד באמצעות photomultiplier (PMT). בשילוב עם רכיבי תאורת מיתוג מהירים, הדבר מאפשר ניתוח יסודי של רכיבים פוטנציאליים לפעולה מהירה עם רזולוציה זמנית גבוהה במיוחד (אות אנלוגי עד 1 קילו-הרץ). שיעורי דגימה גבוהים נדרשים כדי להבטיח מדידות אמינות של פוטנציאל פעולה upstroke cardiomyocytes והוא יכול להיות קריטי במבנים נרגשים אחרים (כלומר נוירונים) עם קינטיקה עירור מהירה מאוד. יתר על כן, מערכת גמישה זו מועילה מכיוון 1) היא מאפשרת חקירה יסודית של אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד עם בחירת דיאפרגמת שדה, 2) דיגיטציה של האות האנלוגי אינה משולבת או מעובדת מראש ולכן נמצאת ישירות תחת בקרת ניסויים, 3) האופי המודולרי של מכשור הפוטומטריה מאפשר הגדרה מחדש פשוטה כדי לאפשר מדידה אופטית סימולטנית עם אינדיקטורים אחרים או מיקרו-ectrodes. תוספת של ערוץ photomultiplier שני, עם ערכות מסנן מתאימות כדי למנוע חפיפה ספקטרלית, תאפשר מדידה סימולטנית אמיתית של מחוון סידן תאי פלורסנט CAL-590 לצד VF2.1Cl. חשוב גם לציין כי מערכת רב תכליתית זו יכולה לשמש לחילופין להערכה עמוקה של טיפול בסידן תאי כפי שתואר בעבר17,18,19,20.
בעוד הרזולוציה הזמנית של המערכת שלנו מביאה יתרונות רבים, יש לציין כי פרמטרים הדורשים ניתוח של ההתפלגות המרחבית של אותות פלואורסצנטיות, כגון דפוסי עירור או מהירות ההולכה, אינם מתאימים לחקירה על ידי טכניקות הפוטומטריה בהן אנו משתמשים כאן והם בתחומי המיפוי האופטי. החומרה המתוארת כאן ניתן להמיר בקלות לתצורת מיפוי אופטי על ידי חילופי photomultiplier עבור מצלמה מומחה מתאים עם קצבי פריימים גבוהים וקיבולת באר גדולה. התצורה המתוארת שלנו יכולה להציע מידע זמני מפורט ביותר בשבריר (עד 1/10th)של המחיר המסחרי של מצלמות שטח גדולות מתקדמות עם יכולות שוות ערך. טכניקות סריקת קו קונפוקלי מפורטות גם הן באופן מרחבי יותר מהשיטה שלנו, אולם מגבלות ב- z מגבילות את רכישת הפלואורסצנטיות ממישורים רוחביים מרובים בבת אחת. זה לא אידיאלי עבור כתבים הקשורים קרום הדמיה המוחזקים על ידי iPSC-CMs עם מורפוגות הטרוגניות בדרך כלל. מדידות פוטומטריה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי נמנעות מבעיה זו על ידי גישה מיידית למשטח התאי כולו, שוב בעלות נמוכה בהרבה לנקודת נתונים.
אנו ממליצים בחום VF2.1Cl לביצוע בדיקות מתח עם תאים נרגשים. נכון לעכשיו, VSDs רבים זמינים הפועלים תחת שפע של מנגנונים שונים, כל אחד עם מגבלות מובנות משלהם. צבעי סטירל אלקטרוכרומיים נפוצים כמו di-8-ANEPPS או di-4-ANBDQBS המציגים תגובות מהירות למתח transmembrane עם זאת, הםעכבים על ידי רגישות נמוכה ועומס קיבולי גבוה21,22. מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs) משתמשים בהיתוך של חלבונים פלואורסצנטיים לתחומי חישת מתחמולקולרי 23 או אופסינים מיקרוביאליים24 ומספקים ניתוחים רגישים ביותר של דינמיקת מתח תאי, אך הם מונעים על ידי קינטיקה מופחתת ותגובות לא ליניאריות. רשימה של VSDs נפוצים והמאפיינים הדינאמיים הבסיסיים שלהם כלולים בטבלה 1. בדיקות PeT כמו VF2.1Cl מציעות פשרה טובה, המציגה קינטיקה מהירה ורגישות הגונה עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, VSD זה מוגבל כי, שלא כמו צבעי סטיירל יחסטרי21, זה לא יכול לשמש כדי לפתור את פוטנציאל הממברנה המוחלטת. חיסרון מובנה זה מדגיש את התוצאה המצערת של שמירה על דיוק נתונים בתפוקה גבוהה יותר בעת בדיקת אלקטרופיזיולוגיה תאית.
|
רגישות (% ∆F/F ל-100mV) |
מהירות (ms) | |
| צבעים על בסיס PeT | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| ברסט125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 | 47 | <1 |
| צבעי המיקינין | ||
| די-8-אנפס21 | 10 | <1 |
| די-4-אנפס27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEVIs | ||
| ArcLight30 | 32 | 12324 |
| קשת D95N31 | 40 | 4124 |
| בתולתים 32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2.333 | 13.3 | 2523 |
| קוואזר224 | 90 | 11 |
| סָרִיג | ||
| דיו/DPA34 | 56 | 2 |
טבלה 1: רשימה קצרה של VSDs נפוצים ומאפייני הפלואורסצנט העיקריים שלהם.
אנו מציינים כי 2,3-בוטאן-דיון מונוקסימה (BDM) משמשים לעתים קרובות במדידות מתח אופטי כדי להפחית את חפץ התנועה על ידי דיכוי התכווצות הלב35. עם זאת, דיווחים קודמים הראו כי שתי התרכובות מאריכות באופן משמעותי את משך AP ומשתטחות את השבת AP בלב שלם36,37. בנוסף, blebbistatin יש תכונות פלואורסצנטיות אשר חופפים עם הספקטרום של VF2.1Cl ולכן לא יכול להיות מתאים לשימוש עם צבע זה38.
הפרוטוקול הרב-תכליתי שלנו דורש התאמות מינימליות לחקירה אופטית במגוון מבנים דו-ממדיים ותלת-ממדיים. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של מכניקת קוטביות מחדש, אשר יכול לספק תובנות יקרות ערך על חריגות יוניות הסלולר. בידינו, פרוטוקול זה מספק אותות אופטיים ברורים עם יחסי אות לרעש טובים אפילו בתאים קטנים יותר. הפלטפורמה הפשוטה והיעילה שלנו יכולה להיות מיושמת עבור אימות לא פולשני של בטיחות תרופות לב ומחקרי סינון תפוקה גבוהה באמצעות iPSC-CMs ספציפיים למטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cairn מחקר בע"מ תמך בפרסום זה על ידי כיסוי עלויות הייצור של קובץ הווידאו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להכיר ב- Cairn Research Ltd. על תרומתם הכספית האדיבת אשר כיסתה את עלויות הייצור של פרסום זה. בנוסף, אנו מודים לגברת אינס מולר ולמרת סטפני קסטל על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם.
המחקר של המחברים נתמך על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK), דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ותחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2067/1- 390729940) ו-Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
