Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nasal borstning provtagning och bearbetning med digital höghastighets ciliär videomikroskopi - Anpassning för COVID-19-pandemin

Published: November 7, 2020 doi: 10.3791/61949
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 2, 1,7
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

Summary

För att garantera en framgångsrik och högkvalitativ ciliär funktionell analys för PCD-diagnos är en exakt och noggrann metod för provtagning och bearbetning av andningsepitel avgörande. För att fortsätta tillhandahålla PCD-diagnostiktjänster under COVID-19-pandemin har protokollet för ciliär videomikroskopi uppdaterats för att inkludera lämpliga infektionskontrollåtgärder.

Abstract

Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en genetisk rörlig ciliopati, vilket leder till signifikant otosinopulmonell sjukdom. PCD-diagnos missas ofta eller försenas på grund av utmaningar med olika diagnostiska metoder. Ciliär videomikroskopi, som använder Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), ett av de diagnostiska verktygen för PCD, anses vara den optimala metoden för att utföra ciliär funktionell analys (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) och beat pattern (CBP) analys. DHSV saknar dock standardiserad, publicerad driftsprocedur för bearbetning och analys av prover. Den använder också levande andningsepitel, ett betydande infektionskontrollproblem under COVID-19-pandemin. För att fortsätta tillhandahålla en diagnostisk tjänst under denna hälsokris har ciliärvideomikroskopiprotokollet anpassats för att inkludera adekvata infektionskontrollåtgärder.

Här beskriver vi ett reviderat protokoll för provtagning och laboratoriebehandling av cilierade andningsprover, som belyser anpassningar som gjorts för att följa COVID-19-infektionskontrollåtgärder. Representativa resultat av CFA från näsborstningsprover erhållna från 16 friska försökspersoner, bearbetade och analyserade enligt detta protokoll, beskrivs. Vi illustrerar också vikten av att erhålla och bearbeta epiteliala cilierade remsor av optimal kvalitet, eftersom prover som inte uppfyller kvalitetsurvalskriterierna nu möjliggör CFA, vilket potentiellt minskar den diagnostiska tillförlitligheten och effektiviteten hos denna teknik.

Introduction

Primär ciliär dyskinesi (PCD) är en ärftlig heterogen rörlig ciliopati, där respiratoriska cilier är stationära, långsamma eller dyskinetiska, vilket leder till nedsatt mukociliär clearance och kronisk oto-sino-lungsjukdom 1,2,3,4. De kliniska manifestationerna av PCD är kronisk våthosta och kronisk nästäppa som börjar i tidig spädbarn, återkommande eller kroniska övre och nedre luftvägsinfektioner som leder till bronkiektasi och återkommande eller kronisk otitis media och bihåleinflammation 5,6,7. Ungefär hälften av PCD-patienterna uppvisar organlateralitetsdefekter såsom situs inversus eller situs ambiguus. Vissa patienter uppvisar också infertilitetsproblem på grund av orörliga spermier hos män och orörliga cilier i äggledarna hos kvinnor 1,2,8. PCD är sällsynt, men prevalensen är svår att definiera och varierar från 1:10 000 till 1:20 000 9,10. Den verkliga förekomsten av PCD tros dock vara högre på grund av svårigheter att diagnostisera och brist på klinisk misstanke. Symtom på PCD efterliknar vanliga respiratoriska manifestationer av andra akuta eller kroniska andningsbesvär, och de diagnostiska utmaningarna med att bekräfta diagnosen är välkända, vilket leder till otillräcklig behandling och uppföljning 2,5,9,11.

Ciliär videomikroskopi, med Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), är ett av de diagnostiska verktygen för PCD 4,8,12,13. DHSV anses vara den optimala metoden för att utföra ciliär funktionell analys (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) och beat pattern (CBP) analys 2,14,15,16. DHSV använder levande andningsepitel, vanligtvis erhållet från näsborstning13.

Med tanke på det nuvarande COVID-19-utbrottet är bekräftelse av en PCD-diagnos nu ännu viktigare eftersom bevis tyder på att underliggande andningssjukdomar kan leda till sämre resultat efter COVID-19-infektion17,18. En säker och effektiv PCD-diagnostiktjänst under den nuvarande pandemin kommer också att göra det möjligt för bekräftade PCD-patienter att dra nytta av ytterligare skyddsåtgärder jämfört med den allmänna befolkningen19.

Överföring av COVID-19 sker främst genom droppspridning20. Hög potential för överföring från asymtomatiska (eller minimalt symptomatiska) patienter antyds av den höga virusbelastningen i näsprov20. Dessutom, om viruspartiklar blir aerosoliserade, stannar de i luften i minst 3 timmar21. Därför utsätts vårdpersonal för en hög reservoar av virusbelastning när de utför klinisk vård och provtagning för diagnostiska tekniker22. Dessutom utsätter manipulation av levande andningsprover teknikern för COVID-19-kontaminering. Medan rekommendationer om bästa praxis för andningsläkare och ÖNH-kirurger som tar hand om COVID-19-patienter genomförs23, saknas rekommendationer för att utföra DHSV under COVID-19-pandemin.

För att fortsätta tillhandahålla en PCD-diagnostisk tjänst, samtidigt som säkerheten för vårdpersonalen (som utför provtagning) och tekniker (som utför provbehandling) säkerställs, måste protokollet för ciliär videomikroskopi anpassas under COVID-19-pandemin. Tekniken för ciliär videomikroskopi är för närvarande begränsad till forskningstjänst och specialiserade diagnostiska centra, eftersom CFA kräver omfattande utbildning och erfarenhet. Dessutom saknas för närvarande standardisering och exakt driftsförfarande för bearbetning och analys av prover med DHSV 4,13.

Syftet med denna uppsats är att beskriva standardrutiner för DHSV, med särskild hänvisning till infektionskontrollåtgärder och säkerhet vid provtagning och bearbetning av levande näsepitel. Detta kommer att göra det möjligt för högkvalitativ PCD-diagnos och vård att fortsätta, trots det nuvarande COVID-19-utbrottet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkännande erhölls från Liège sjukhusfakultets etiska kommitté och universitetsavdelningen för hygien och hälsoskydd på arbetsplatsen.

1. Provtagning av luftvägsepitel

  1. Se till att försökspersonerna är fria från infektion i minst 4-6 veckor och fria från nasal och inhalerad medicinering före provtagning.
  2. Förbered kompletterat M199-preparat: Komplettera cellodlingsmedium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikalösning (5 ml streptomycin / penicillin (50 μg / ml)) och svampdödande lösning (5 ml amfotericin B (2,5 μg / ml)).
  3. Förbered 2 (en för varje näsborre) 15 ml koniska rör med lock och fyll var och en av dem med 3 ml kompletterad M199.
  4. Förbered en bronkial cytologiborste (tjocklek: 2 mm och längd: 11 mm). Klipp av trådens ände för att säkerställa att borsten är ca 15 cm lång (figur 1A,B). För att hålla borsten när du utför näsborstningen, använd en Weil-Blakesley näspincett (Figur 1B).
  5. COVID-19 anpassning: Undvik att bearbeta ett levande näsepitelprov med okänd status för COVID-19, testa patienten för COVID-19 48 till 72 timmar före näsborstningen för ciliär videomikroskopi. Detta COVID-19-test består av polymeraskedjereaktion från ett nasofaryngealt pinnprov24,25. Eftersom patientens status för COVID-19 är okänd vid denna tidpunkt måste läkare och personal skyddas tillräckligt23,26, inklusive FFP2-mask, handskar, ansiktssköld eller skyddsglasögon och långärmad vattentålig klänning. Vid otillgänglig, omöjlig eller tveksam PCR-testning, gjorde all bearbetning av näsborstning i L2 biosäkerhetslaboratorium. Vid positiv COVID-19-status, skjut upp PCD-diagnostestning och överväg alternativa metoder för att hantera patienten.
    FÖRSIKTIGHET: Denna nasofaryngeal pinnprovtagning för COVID-19-testning kan inducera sekundär ciliär dyskinesi genom att skada nasal respiratorisk ciliär epitel27,28. För att undvika detta, införa en tunn bomullspinne i näshålan upp till nasofarynx under styv endoskopisk kontroll, för att undvika att skada turbinaten eller septumet. Provet tas sedan från nasofarynx och tar bort bomullspinnen under kontroll av det styva endoskopet. Med lämplig utrustning utförs en 0 ° styv endoskopi enkelt hos vuxna och barn utan trauma.

2. Erhålla respiratoriska cilierade epitelprover

COVID-19-anpassning: Även om patientens COVID-19-status är negativ, på grund av falskt negativ frekvens, uppmanas patienten att hålla en kirurgisk mask på munnen under proceduren, och handskar, FFP2-mask och ansiktsskydd bärs av läkaren.

  1. Förberedelse för näsborstning
    1. Be patienten att snyta sig.
    2. Utför näsborstning under nasal endoskopi eller blindad. Om du använder en nasal endoskopi, undersök de 2 näsborrarna före näsborstningen (upprepa inte om det görs 48-72 tidigare för COVID-19 näspinne). Undersökning gör det möjligt att verifiera slemhinnans tillstånd (en hög grad av inflammation kan orsaka blödning när näsborstning utförs, ...), tillståndet av sämre turbinat (för att utesluta närvaron av telangiektasi till exempel) och om septum nasal är rak (figur 1C).
    3. Be patienten att ligga ner eller sitta bekvämt, huvudet vilar bakåt på stolen (eftersom näsborstningen orsakar en reflex att flytta huvudet tillbaka). En andra vårdare håller huvudet under näsborstningen, särskilt hos barn.
    4. Skaka borsten i den kompletterade M199 före näsborstning (fuktning av borsten minskar irritation från borstning).
      OBS: Borsten kan fuktas i den kompletterade M199; Om patienten är allergisk mot antibiotika (penicillin och streptomycin finns i det kompletterade cellodlingsmediet), fukta borsten i saltlösning.
  2. Nasal borstning
    1. Sätt försiktigt in näsborstningen utan lokal eller allmän anestesi13. Om du använder nasal endoskopi, placera endoskopet vid ingången till näsan för att visualisera det sämre nasala turbinatet och sätt sedan in cytologiborsten i näsan. Om du utför en "blindad" näsborstning, sätt in borsten i näsan efter näsgolvet (figur 1D).
      OBS: Vissa diagnostiska centra använder lokalbedövning med en tampong av nafazolin för att utföra näsborstning.
    2. Flytta borsten bakåt och framåt flera gånger över den bakre delen av det nedre nästurbinatet och dra sedan tillbaka. Operatören ska känna att borsten gnuggar epitelet, och patienten kan känna ensidigt vattnigt öga på sidan av borstningen.
      OBS: Om näsborstningen utförs för anteriort kommer inga cilierade celler att erhållas, eftersom den främre näshålan är fodrad med ett övergångs icke-cilierat epitel.
    3. Efter provtagning, placera omedelbart näsborstprover i odlingsmediet. Erhållna andningsepitelremsor lossnar genom omrörning av borsten i röret innehållande den kompletterade M199 och stäng sedan röret (figur 1E).
    4. COVID-19 anpassning: Lossa inte epitelremsorna genom att röra om borsten i den kompletterade M199 omedelbart efter provtagningen. Placera borsten i röret, klipp tråden så att den passar helt inuti röret och stäng röret omedelbart. Lägg provet i en lufttät dubbelpåse.

Figure 1
Figur 1: Näsborstningsteknik. (A) Hela bronkial cytologiborste (B) Klar att borsta: borständen av tråden skärs (cirka 15 cm lång) och hålls av en Weil-Blakesley näspincett (C) Endoskopisk bild av näshålan: septum (1) sämre turbinat (2) och mellanturbinat (3) (D) Näsborstning utförs på den bakre delen av det nedre turbinatet (2). Nasal septum (1) Mellersta turbinat (3). E) Andningsepitelremsorna lossnar genom att borsten skakas i det kompletterade M199-cellodlingsmediet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Respiratorisk cilierad epitelbehandling

  1. Analysera näsborstningsprover under mikroskop inom 9 timmar efter provtagning, eftersom både CBF och CBP är stabila inom denna tidsram (opublicerade data).
  2. Använd ett upprätt eller inverterat ljusmikroskop, med en x100 oljenedsänkningsfaskontrast eller en interferenskontrastlins. Placera helst mikroskopet på ett vibrationsdämpande bord eftersom ciliarslag kan utsättas för artefakter på grund av yttre vibrationer (t.ex. från laboratoriebänken)13.

COVID-19 anpassning: Operatören använder personlig skyddsutrustning för att utföra nasal bearbetning, inklusive FFP2-mask, handskar och långärmad vattentålig klänning.

  1. Förbered visualiseringskammaren.
    1. Suspendera de cilierade epitelremsorna i en laboratoriebyggd öppen visualiseringskammare, så att cilia kan slå fritt medan de analyseras under mikroskopet. Denna kammare skapas genom separation av en täckglid (22 mm x 40 mm) och en glasskiva med två intilliggande fyrkantiga täckglas (20 mm x 20 mm), åtskilda av ett avstånd på 15 mm och limmade på glasskivan12 (figur 2, figur 4A).

COVID-19 anpassning: Den laboratoriebyggda kammaren som beskrivs ovan är öppen och tillåter gas- och fuktutbyte mellan provet och miljön13. I samband med COVID-19-pandemin är det möjligt att använda en sluten visualiseringskammare med hjälp av en dubbelsidig fast distans, 0,25 mm djup (figur 3, figur 4B). Distansen sitter fast på glasskivan och sedan sitter en täckglid (22 mm x 40 mm) fast ovanpå distansen.

Figure 2
Figur 2: Montering av den labbbyggda öppna kammaren. (A) De 2 fyrkantiga täckglasen (20 mm x 20 mm) placeras på glasskivan. (B) De fyrkantiga täckglasen är åtskilda med ett avstånd på cirka 15 mm och limmade på glasskivan. (C) Kammaren fylls mellan de två intilliggande fyrkantiga täckglasen med ett litet prov (ca 60 μL) cilierat epitel i kompletterat M199. (D) Ett långt rektangulärt täckglas (22 mm x 40 mm) placeras på de två intilliggande fyrkantiga täckglasen och täcker kammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Montering av den slutna kammaren med hjälp av en dubbelsidig fast distans. (A) Glasskivan och den dubbelsidiga fasta distansen. (B) Skyddet avlägsnas på ena sidan av distansen och distansen sitter sedan fast på glasskivan. (C) Skyddet avlägsnas från den andra sidan av den dubbelsidiga fasta distansen och sedan fylls distansen med ett litet prov (ca 60 μL) cilierat epitel i kompletterad M199. (D) Ett långt rektangulärt täckglas (22 mm x 40 mm) sitter fast på distansen och stänger kammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Schematiskt diagram som visar de viktigaste visualiseringskamrarna som används för att utföra ciliär videomikroskopi med digital höghastighetsvideomikroskopi (DHSV). A) Öppen hängande droppteknik: det cilierade provet suspenderas i en droppe cellodlingsmedium i en öppen kammare som skapas genom att ett täckglas och en glasskiva separeras av två intilliggande täckglas. (B) Tekniken med sluten hängande droppe: det cilierade provet suspenderas i en droppe cellodlingsmedium i en sluten kammare skapad av en distans inklämd mellan en glassida och en täckglas. Distansen fastnar stadigt på både glasskivan och lockglidningen. Reproducerad och modifierad från Kempeneers et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Kontroll av temperatur
    1. Omge mikroskopet med bubbelplast (figur 5A,B).
    2. Fäst linsvärmaren runt objektivet med ett kardborreband (bild 5C)
    3. Slå på linsvärmaren 1 timme innan du utför kontrolltemperaturkontrollen.
    4. Slå på mikroskopet och kontrollera att mikroskopinställningen är klar, eftersom mängden ljus genom provet kan ändra temperaturen på bilden.
    5. Slå på den uppvärmda boxkontrollen (bild 5D).
    6. Kontrollera att referenssonden fungerar korrekt innan du startar. Håll referenssondspetsen mellan fingrarna; Det bör mäta kroppstemperaturen.
    7. Sätt fritt media i mitten av bilden, mellan de två intilliggande fyrkantiga täckglasen (20 mm x 20 mm) limmade på den.
    8. Placera referensprobspetsen i den kompletterade M199. Täck med ett rektangulärt täckglas (22 mm x 40 mm). Se till att sonden är helt omgiven av media (annars kan temperaturen sjunka).
    9. COVID-19 anpassning: För att utföra temperaturkontrollen i den slutna kammaren med en distans, skär ena sidan av distansen (detta hål måste ha samma storlek som referenssonden). Fäst distansen på glasskivan, placera fria medier i mitten av distansen. Placera spetsen på referenssonden i lösningen, genom distanshålet och fäst sedan ett rektangulärt täckglas (22 mm x 40 mm) på distansen.
    10. Placera bilden i plattan på den uppvärmda lådan. Stäng den uppvärmda lådan med locket.
    11. Tillsätt olja på oljedoppningsmålet.
    12. Placera den uppvärmda lådan på mikroskopsteget.
    13. Justera plattans och lockets temperatur (lockets temperatur bör vara 2 °C högre än plattans temperatur för att undvika kondens) så att den mäter 37 °C med referenssonden i mediet.
    14. Vänta 5 minuter (den tid som krävs för att höja provets temperatur till 37 °C).
    15. Justera objektivet och flytta det närmare bilden tills du vidrör täckglaset med linsens spets.
    16. Flytta målet för att se mitten av sonden i mikroskopet.
      OBS: Se till att sonden syns på datorskärmen (för att kontrollera att kamerasystemet fungerar innan du tittar på det cilierade provet). När du tittar på mitten av sonden är skärmen helt svart.
    17. Justera temperaturen på linsvärmaren (för att kompensera för temperaturförlusten när oljelinsen är i kontakt med täckglaset). Var noga med att mäta 37 °C med referenssonden i mediet när målet vidrör täcket.
      OBS: Arbeta helst i ett rum med kontrollerad temperatur, så att dessa inställda temperaturer inte ändras. Om temperaturen i rummet inte kontrolleras bör du utföra denna temperaturkontrollkontroll varje dag innan du utför ciliär videomikroskopi.
    18. Efter att ha kontrollerat temperaturen, ta bort bilden från den uppvärmda lådan.
    19. Rengör glaset och spetsen på referenssonden med alkohol och lägg undan.
    20. Rengör linsen med isopropanol och linsrengöringsservetter med cirkulära rörelser.

Figure 5
Figur 5: Utrustning som används i DHSV-laboratoriet. (A) Mikroskopet utrustat med en 100x olje-nedsänkningsfaskontrastlins, placeras på ett antivibrationsbord för att undvika att yttre vibrationer orsakar artefakter för ciliär funktionell analys (B) Mikroskopet är omgivet av bubbelplast för att förhindra värmeförlust från omgivande luft. (C) Målet med nedsänkning av olja skapar värmeförlust. Detta kan förhindras med hjälp av en linsvärmare (pilar). d) Provet värms upp med hjälp av en värmelåda. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Beredning av respiratoriska cilierade epitelprover

  1. Skaka röret försiktigt så att flimmerhåren kan spridas ut i hela röret (för att undvika att flimmerhåren fastnar på andra cilierade remsor, slem eller skräp, som hindrar dem från att slå fritt).
    OBS: Detta steg är viktigt för att få "optimala kanter" av cilierat epitel (figur 12).
  2. Dra upp cirka 50 μl cilierat epitel i kompletterat M199 i mitten av röret med en pipett.
  3. Lägg provet på den labbbyggda kammaren (mellan de två intilliggande fyrkantiga täckglasen (20 mm x 20 mm)) och täck med ett rektangulärt täckglas (22 mm x 40 mm). Var försiktig så att du inte lägger till bubblor.
  4. COVID-19 anpassning: Utför steg 4.1-4.3 i ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp. Procedur i det mikrobiologiska säkerhetsskåpet.
    1. Slå på det mikrobiologiska säkerhetsskåpet 10 minuter innan provet förbereds (för att säkerställa att miljön är steril).
    2. Före hantering, desinficera hela det mikrobiologiska säkerhetsskåpet med 70% etanol.
    3. Desinficera allt nödvändigt material med 70% etanol innan du placerar det i det mikrobiologiska säkerhetsskåpet.
    4. Öppna de 15 ml koniska rören som innehåller proverna endast en gång under det mikrobiologiska säkerhetsskåpet och lossa sedan epitelremsorna genom att agitera borsten (med Weil-Blakesley näspincett) i kompletterad M199.
    5. Fäst distansen på glasskivan och ta bort skyddet från den dubbelsidiga fasta distansen.
    6. Skaka röret försiktigt så att flimmerhåren kan spridas ut i hela röret.
    7. Dra upp ett litet prov av cilierat epitel i kompletterad M199 från mitten av röret med en pipett (ca 60 μl) och fyll distansen.
    8. Fäst det rektangulära täckglaset (22 mm x 40 mm) på distansen för att stänga kammaren.
    9. Desinficera rutschkanan innan du går ut ur det mikrobiologiska säkerhetsskåpet.
    10. Ta bort bilden från det mikrobiologiska säkerhetsskåpet.
    11. Byt handskar när du lämnar det mikrobiologiska säkerhetsskåpet.
    12. Vänta 10 minuter innan du stänger av det mikrobiologiska säkerhetsskåpet efter användning (för att se till att miljön i det mikrobiologiska säkerhetsskåpet är sterilt innan du stänger dörren).
  5. Placera bilden i plattan på den uppvärmda lådan. Stäng den uppvärmda lådan med locket.
  6. Tillsätt olja på oljedoppningsmålet.
  7. Placera den uppvärmda lådan på mikroskopets scen.
  8. Slå på den uppvärmda lådan och linsvärmaren.
    OBS: Linsvärmaren måste vara påslagen 1 timme före användning.
  9. Justera temperaturinställningarna för den uppvärmda lådan och linsvärmarens styrenheter enligt värden som erhållits i steg 3.4.
  10. Vänta 5 minuter (det tar tid att höja provets temperatur upp till 37 °C när du använder förutbestämda inställningar för både värmelådan och objektivvärmaren).
  11. Närma dig målet till bilden tills du vidrör täckglaset med linsens spets.

5. Visualisera respiratoriska cilierade kanter

  1. Fäst höghastighetsvideokameran på mikroskopet, anslut kameran till datorn och slå på kameran.
  2. Slå på datorn.
  3. Anslut den digitala höghastighetsvideomikroskopikameran till datorn (så att bilden som ses genom ögonlinserna projiceras på bildskärmen) via programvaran.
    1. Öppna programvaran och sedan öppnas huvudmenyn automatiskt (bild 6A).
      OBS: Programvaran är det program som används i laboratoriet för bildinsamling och bearbetning. Systemet gör att videosekvenser kan spelas in och spelas upp med reducerad bildhastighet eller bildruta för bildruta. Den kan laddas ner gratis.
    2. Öppna kameran (bild 6A).
    3. När filtret för kamerauppräkning visas väljer du OK (bild 6B).
    4. Välj Uppdatera lista; välj kamerans namn; välj Gränssnitt: Expert och välj sedan Öppna (bild 6C).
    5. På kamerans kontrolllinje högst upp i den dockade dialogmenyn väljer du Live (bild 6D).
    6. Välj Spela upp för att visa bilden och Stopp för att avsluta visningen (bild 6D).

Figure 6
Figur 6: Beskrivning av programvarans användning: visualisering av luftvägskanter på bildskärmen. (A) Huvudmenyn visas direkt när programvaran öppnas. (b) Stäng kamerans uppräkningsfilter. (C) Välj kamera och välj Gränssnitt: Expert. (D) Live-läget gör det möjligt att visualisera bilden som ses genom mikroskopet på monitorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Justera inställningen för kamerahämtning (i det övre högra hörnet) (bild 7).
    1. I Förvärvsinställningar väljer du Kamera och justerar sedan bildhastigheten: Hastighet (Hz): 500 (se nedan) (bild 7A).
    2. I Förvärvsinställningar väljer du Kamera och justerar sedan intresseområdet (ROI) (bild 7A).
      OBS: ROI beräknas med hjälp av en graderad skala som visas med x100-oljemålet och projiceras på monitorn för att definiera antalet pixlar som motsvarar 50 μm (eftersom du vill registrera cilierade kanter som mäter cirka 50 μm (se nedan)).
    3. I Förvärvsinställningar väljer du Spela in och justerar sedan videons varaktighet och det totala antalet inspelade bildrutor (en varaktighet på 2 sekunder motsvarar 1000 bilder om den valda bildfrekvensen är 5OO Hz) (bild 7B).
      OBS: Enligt vår erfarenhet är minst 2 sekunders videolängd nödvändig för att möjliggöra en fullständig analys av både CBF och CBP.
    4. Välj Arkiv och sedan Spara Camera Cfg för att spara den nya förvärvsinställningen (ange ett namn och vid behov en kommentar för den nya konfigurationen) (bild 7C,D).
    5. För att öppna den här nya kamerakonfigurationen , öppna File and Load Camera Cfg (bild 7C).

Figure 7
Figur 7: Beskrivning av programvarans användning: justering av kameraupptagningsinställningarna för videoinspelning av de slående cilierade kanterna. (A) På förvärvsinställningen Kamera justerar du intresseområdet (ROI) och bildfrekvensen för videoinspelning (Rate). (B) På förvärvsinställningen Spela in, justera videoinspelningens varaktighet (antal bilder som behövs för den valda inspelningstiden, enligt den bildhastighet som valts tidigare). (C) De nya kamerakonfigurationsinställningarna kan sparas med funktionen Spara kamera Cfg . Ladda kamera Cfg gör det möjligt att öppna de sparade konfigurationsinställningarna för vidare användning. (D) De nya kamerakonfigurationsinställningarna kan namnges och en kommentar kan läggas till vid behov. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Titta genom okulära linser och sök efter celler eller skräp i provet och fokusera sedan.
  2. Kontrollera att bilden är synlig på monitorn och förbättra bildkvaliteten genom att justera kondensorn (och DIC-prisman om du använder ett interferenskontrastobjektiv) och justera fokus om det behövs.
  3. Sök efter remsor av ciliated epitel.

6. Val av respiratoriska cilierade kanter

OBS: Det experimentella systemet gör det möjligt att slå cilier i tre distinkta plan: en sidledes profil, slå direkt mot observatören och direkt ovanför (figur 8).

Figure 8
Figur 8: DHSV-tekniken gör det möjligt att slå cilia i tre distinkta plan. a) i sidledsprofilen. (B) slå direkt mot observatören och. (C) från direkt ovan. Reproducerad från Kempeneers et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Registrera endast intakta ostörda cilierade epitelkanter som är minst 50 μm långa.
  2. För poster som görs i sidledsprofilen, bestäm kvaliteten på kanten enligt Thomas et al.29 poängsystem (figur 9). Använd endast normala kanter (figur 9A) eller kanter med mindre utskjutande delar (figur 9B) för ciliär funktionell analys. Uteslut isolerade celler (figur 9E).

Figure 9
Figur 9: Representativ bild av poängsystemet av Thomas et al29 för olika kvaliteter av cilierade epitelkanter. (A) Normal kant: definierad som en intakt likformig likformig epitelremsa > 50 μm lång (B) Cilierad kant med mindre utsprång: definierad som en kant >50 μm lång, med celler som skjuter ut ur epitelkantlinjen, men utan någon punkt på det apikala cellmembranet som skjuter ut ovanför flimmerhårens spetsar på de intilliggande cellerna (C) Cilierad kant med större utsprång: definierad som en kant >50 μm lång, med celler som skjuter ut ur epitelkantlinjen, med minst en punkt på det apikala cellmembranet som skjuter ut ovanför flimmerhårens spetsar på de intilliggande cellerna (D) Isolerad cilierad cell: definierad som den enda cilierade cellen på en epitelkant >50 μm lång (E) Enstaka celler: definieras som cilierade celler som inte har någon kontakt mellan sig eller någon annan celltyp. Skalstång: 5,5 μm. Reproducerad från Thomas et al.29Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Utför CFA med endast cilia fri från slem och skräp och slå i den profil som valts för den inspelade kanten. Välj endast cilierade kanter som tillåter minst 2 CBF- och CBP-utvärderingar (se nedan) längs kanten.
  2. Använd endast för CFA prover som ger minst 6 kanter som slår i sidledsprofilen och uppfyller ovanstående kriterier; Analysera maximalt 20 kanter i sidledsprofilen.
  3. Använd minst 1 extra kant av cilia som slår ovanför observatörsprofilen för att karakterisera CBP.

7. Inspelning av cilierad kant

  1. Spela in den slående ciliakanten med en kamerabildhastighet på 500 bilder per sekund och projicera på en högupplöst bildskärm. En minsta bildhastighet på 400 Hz krävs för att möjliggöra analys av både CBF och CBP13. Registrera en kant med en bildhastighet på 30 bilder per sekund för att utvärdera effektiviteten av partikelavstånd.
  2. Välj Live på kamerans kontrolllinje högst upp i den dockade dialogmenyn (bild 6D)
  3. Välj Spela upp för att visa bilden och Stoppa för att avsluta visningen (bild 6D)
  4. Om du vill spela in en kant trycker du på Spela in (bild 6D). För att visa inspelningen innan du sparar, gå till kamerans kontrolllinje högst upp i den dockade dialogrutan och välj Uppspelning. Välj Spela upp för att visa den inspelade videon och Stoppa för att avsluta visningen (bild 10A).
    OBS: Sluta visa den inspelade kanten innan du sparar.

Figure 10
Bild 10: Beskrivning av användningen av programvaran. (A) uppspelningsläge. Om du vill granska en inspelad videosekvens som slår cilierad kant väljer du uppspelningsläget. Välj Spela upp för att visa bilden och Stoppa för att avsluta visningen. Berömmelsegraden kan justeras för att förbättra analysen av ciliarfunktionen (B, C) Spara videoinspelningarna för att slå cilierade kanter (B) För att spara videon, välj Arkiv och sedan Spara förvärv. (C) Ange namnet på den inspelade videon och välj placeringen där videon spelas in. Se till att inspelningen sparas som en . RAW-fil (D) val av en inspelning av slående cilierade kanter som ska analyseras: Om du vill öppna en videoinspelning väljer du Arkiv, sedan Öppna och sedan Bilder. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Spara videon i databasen (bild 10B,C).
    1. Öppna Arkiv i det övre vänstra hörnet och spara sedan förvärv (bild 10B).
    2. I Spara förvärv anger du namnet på den inspelade videon och kontrollerar att inspelningen har sparats som ett RAW-filformat (bild 10C).
  2. När videon har sparats återgår du till live-läget (gå tillbaka till kamerans kontrolllinje högst upp i den dockade dialogrutan och välj live) (bild 6D).
  3. Upprepa proceduren för att registrera antalet kanter som uppfyller urvalskriterierna som krävs för CFA.
    OBS: Det är möjligt att spela in flera slående cilierade kanter som uppfyller urvalskriterierna från en bild, inom högst 20 minuter efter beredningen av bilden (för att undvika uttorkning). Efter 20 minuter, om det inte går att få tillräckligt med kanter som uppfyller urvalskriterierna, förbered en ny bild.
  4. Ta bort bilden från den uppvärmda lådan.
  5. Ta bort det rektangulära täckglaset och kasta det i den specifika behållaren för farligt medicinskt avfall.
  6. Rengör glaset (med de två fyrkantiga täckglasen limmade på den) med 70% etanol och absorberande papper. När bilden är ren kan den användas igen.
  7. COVID-19 anpassning: Placera rutschkanan med täckglaset och distansen i en lufttät påse, ta bort handskar och mask och placera dem i den lufttäta påsen. Placera den lufttäta påsen i den specifika behållaren för farligt medicinskt avfall.

8. Ciliär funktionell analys

  1. Preliminär förberedelse för att utföra den manuella CBF- och CBP-utvärderingen
    1. Öppna programvaran.
    2. Öppna Arkiv i det övre vänstra hörnet, sedan Öppna och sedan Bilder (bild 10D).
    3. Välj videon som ska analyseras.
    4. Gå till kamerans kontrolllinje högst upp i den dockade dialogrutan och välj Uppspelning (bild 10A). Välja Spela för att visa den inspelade videon och Sluta för att avsluta visningen.
  2. Manuell analys av ciliary beat frequency (CBF)
    1. Utför utvärderingen av CBF endast med sidledes kanter.
    2. Dela de cilierade kanterna i ungefär 5 intilliggande områden, var och en mäter ungefär 10 μm (figur 11).
    3. Identifiera och visualisera cilier eller grupper av cilier med reducerad bildhastighet, och högst 2 CBF-mätningar görs i varje område, vilket resulterar i högst 10 CBF-mätningar längs varje kant (figur 11).
    4. Registrera antalet bilder som krävs för att en grupp cilia ska slutföra 5 taktcykler.
    5. Konvertera till CBF med en enkel beräkning: (CBF = inspelningsbildhastighet (Hz) / (antal bilder för 5 slag) x 5) 13,16,30. Immotile cilia rapporteras ha en CBF på 0 Hz13.
      OBS: Justera bildfrekvensen när du spelar upp inspelade videor (bild 10A). Detta är särskilt användbart när cilia analyseras slå mycket långsamt. Att öka bildhastigheten hjälper till att definiera om cilia slår mycket långsamt eller är orörliga.
    6. För varje prov, beräkna medelvärdet av CBF som medelvärdet (SD) eller (95% CI) av alla CBF som registrerats i sidledsprofilen, inklusive statiska cilier.

Figure 11
Figur 11: Representativ bild av en optimal kvalitetskant och uppdelningen i 5 områden för att möjliggöra CFA-analys. En cilierad epitelkant av optimal kvalitet fragmenteras i 5 intilliggande områden som var och en mäter 10 μm. Högst 2 CBF-mätningar (och 2 CBP-utvärderingar) görs i varje område, vilket resulterar i högst 10 CBF-mätningar (och CBP-utvärderingar) längs varje kant. Skalstång = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Manuell CBP-analys (ciliary beat pattern)
    1. För att utvärdera markörerna för dyskinesi, använd endast sidledsprofilen; använda planen mot observatören och ovanifrån för att karakterisera typen av CBP13. Olika metoder och poäng för CBP-utvärdering finns. Nedan beskrivs metoden som används i laboratoriet med definitionen av markörerna för dyskinesi.
    2. Procentandelen av varje distinkt CBP i urvalet
      1. För varje cilia eller grupp av cilier som identifieras och används för en CBF-mätning (figur 11), utför en CBP-analys med reducerad bildhastighet: jämför den exakta vägen som cilierna tar under en full taktcykel med den normala CBP som observerats vid DHSV-analysen12,30.
      2. Tillskriv en distinkt CBP (normal, orörlig, styv, cirkulär, asynkron (okoordinerad ciliär slag) eller dyskinetisk13) till varje cilia eller grupp av cilier som analyseras.
      3. För varje prov, beräkna procentandelen av varje distinkt CBP i provet. Den CBP som tillskrivs urvalet är den dominerande CBP som observerats.
    3. Beräkna de 3 markörerna för dyskinesi.
      1. Beräkna immotilitetsindex (IMI): procentandelen orörliga cilier i provet (antal CBF = 0/totalt antal CBF-avläsningar i provet X 100). Uttryck IMI som medelvärde (SD) eller (95 % KI)1,16,31.
      2. Beräkna dyskinesipoängen (DKS). Dela varje cilierad kant i kvadranter, och antalet kvadranter med dyskinetiska (eller onormalt slående) cilia bestäms. Detta gör att en DKS mellan 0 och 4 kan beräknas (0: normal CBP i hela kanten; 1: onormal CBP i ≤ 25% av cilia; 2: onormal CBP i ≤ 50% av cilia; 3: onormalt beatmönster i ≤ 75% av cilia; och 4: onormal CBP i alla cilia). Medianvärdet för DKS (interkvartilintervall) beräknas för urvalet16,29.
      3. Beräkna procentandelen normal slag: definierad som procentandelen cilier med en normal CBP inom provet (antal normala CBP-avläsningar/totalt antal CBP-avläsningar för provet x100).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att illustrera teknikens effektivitet presenterar vi resultaten från CFA i en serie av 16 friska vuxna frivilliga (5 män, åldersintervall 22-54 år).

Näsborstningsprover från 14 (4 män, åldersintervall 24-54 år) av de totalt 16 volontärerna gav tillräckligt med lämpliga epitelkanter som uppfyllde urvalskriterierna som behövs för att utföra CFA. Från dessa 14 näsborstningsprover registrerades totalt 242 cilierade kanter och 212 kanter uppfyllde de definierade inklusionskriterierna och analyserades. Alla dessa kanter registrerades i sidledsprofilen (cilia som slog ovanifrån observatören registrerades och analyserades för varje volontär för att bedöma om en cirkulär CBP observerades13, men dessa kanter inkluderades inte för CFA). Totalt 807 CBF-mätningar och CBP-utvärdering erhölls från de cilier eller grupper av cilier som analyserades (tabell 1). De detaljerade resultaten av CFA för varje frisk försöksperson presenteras i tabell 1.

Medelvärdet för CBF (± standardavvikelse) för de 14 försökspersoner vars prover uppfyllde inklusionskriterierna var 14,79 (± 2,17) Hz. Detta överensstämmer med tidigare publicerade referensdata i laboratorier som utför DHSV vid en kontrollerad temperatur på 37 °C 16,29,30, medan CBF-mätningar i laboratorier som utför DHSV vid rumstemperatur är lägre15,32,33. Den genomsnittliga (± standardavvikelsen) procentuella andelen normala CBP för friska försökspersoner var 78,82 (± 14,73) %, och för var och en av dessa friska försökspersoner var det dominerande taktmönstret normalt. Inga cilier visade sig slå i ett cirkulärt taktmönster hos de friska försökspersonerna, som rapporterats tidigare16,34.

Medelvärdet för IMI (± standardavvikelse) var 2,27 (± 2,3) % och medianvärdet för DSK (interkvartilintervall) var 0 (0-1). Dessa värden liknade tidigare publikation om friska volutörer16,29. Det är intressant att notera att DSK och CBF liknade de värden som rapporterats av Thomas et al från analysen som erhållits vid val av endast normala kanter eller kanter med mindre projektion (figur 9), vilket återspeglar vikten av att analysera endast kanter som uppfyller inklusionskriterierna29. Om de använde kanter av låg kvalitet rapporterade de en lägre CBF och en högre DKS29. Detta illustrerar att användning av epitelkanter som inte uppfyller urvalskriterierna felaktigt kan leda till en PCD-diagnos.

För att användas som ett PCD-diagnostiskt verktyg bör CFA från näsborstningsprover därför utföras med hjälp av epitelremsor av optimal kvalitet (figur 12A), erhållna genom en optimal bearbetning av näsborstningsprover och ett optimalt kantval. Som rapporterats i protokollet bör endast intakta ostörda cilierade epitelkanter som är minst 50 μm långa användas, och CFA bör endast utföras med cilier som är fria från slem och skräp. I sidledsprofilen bör slagkanter som tillåter mindre än 2 utvärdering av CBF och CBP uteslutas.

Dessutom kan röda blodkroppar och slem blockera fri cilia-slag eller dölja cilia från observatören (figur 12B). Mängden slem kan begränsas genom att be patienten att blåsa näsan före näsborstning och undvika att utföra näsborstning vid akut näsinflammation (inflammation ökar mängden slem och risken för blödning vid näsborstning). Dessutom måste näsborstningen vara försiktig för att begränsa lätt blödning och därmed mängden röda blodkroppar. Men å andra sidan, om borsten inte trycker ordentligt mot det sämre nasala turbinatet, kanske näsborstningsprovet inte innehåller tillräckligt högkvalitativa cilierade epitelremsor (figur 12C, D).

Slutligen, om näsborstningen utförs på den främre delen av näshålan, kommer inga cilierade celler att erhållas, eftersom denna del av näsan är fodrad med ett övergångs icke-cilierat epitel (figur 12E). Därför är kvaliteten på näsborstningsprovet viktigt för att ge minst 6 kanter av ciliaslag i sidledsprofilen (och 1 kant av cilia som slår ovanifrån) som uppfyller inklusionskriterierna.

Av de 16 friska frivilliga uteslöts 2 näsborstningsprover för CFA. En försöksperson uteslöts eftersom provet inte kunde tillhandahålla det erforderliga antalet cilierade kanter som uppfyllde inklusionskriterierna, med huvudsakligen isolerade celler som hittades i provet (figur 12D). Det andra ämnet uteslöts eftersom alla epitelkanter som registrerats (n = 7) var icke-cilierade (figur 12E), vilket tyder på att näsborstningen var för främre och inte korrekt utförd på det sämre turbinatet. Denna slutsats drogs eftersom ämnet var en frisk frivillig. Upprepade näsborstningsprover som endast ger icke-cilierade epitelkanter hos en patient med misstanke om PCD kan leda till en diagnos av en minskad generation av multipla rörliga cilier (RGMC), en mukociliär clearancestörning orsakad av misslyckande i ciliogenes 3,35,36.

På grund av COVID-19-pandemin var diagnostikcentret vid universitetet i Liège tvungen att anpassa ciliarvideomikroskopiprotokollet. Före pandemin använde vi en öppen visualiseringskammare som möjliggjorde gas- och fuktutbyte mellan provet och miljön. Eftersom detta potentiellt kunde leda till kontaminering av operatören och/eller miljön bytte vi till en sluten visualiseringskammare och kammarens hermeticitet för gas och vätska testades. Figur 13 visar tätningstestet av den slutna visualiseringskammaren med hjälp av en dubbelsidig fast distans. Hermeticiteten testades genom att fylla kammaren med 60 μL Trypan-blått och luft och sedan sänka ner kammaren i vatten under 4 timmar. Eftersom vi inte observerade Trypan blå läckage eller luftbubblor i vattnet under 4 timmar, drog vi slutsatsen att kammaren var hermetiskt tillsluten för både vätska och gas. Användningen av denna slutna visualiseringskammare för att utföra ciliär videomikroskopi under pandemin har godkänts av avdelningen för hygien och hälsoskydd på arbetsplatsen vid universitetet i Liège.

Frisk volontär Nej. Av Edge inspelad Nej. Antal analyserade kanter Antal CBF-mätningar CBF (Hz)
(Medelvärde ± SD)		 Normal CBP (%)
(Medelvärde ± SD)		 IMI (%)
(Medelvärde ± SD)		 DSK Median
(Interkvartilintervall)
1 21 16 52 16.59 ± 3.83 82.7 0 0 (0-2)
2 11 7 34 18.4 ± 5.32 97.1 0 0 (0-1)
3 12 11 48 12.12 ± 1.87 91.7 0 0 (0-2)
4 20 20 60 15.18 ± 3.29 86.7 1.67 0 (0-1)
5 18 14 54 11.82 ± 3.97 87 3.7 0 (0-1)
6 15 11 51 16.23 ± 5.5 76.5 5.9 1 (1-2)
7 21 18 60 14.37 ± 4.12 68.3 3.3 1 (0-2)
8 19 18 51 14.12 ± 4.79 74.5 5.9 1 (0-2)
9 17 17 37 16,77 ± 4,74 89.2 0 0 (0-2)
10 15 15 69 16.49 ± 4.44 75.4 2.9 1 (1-2)
11 15 14 77 14.53 ± 2.42 81.8 0 0 (0-2)
12 16 11 48 15.27 ± 2.38 81.3 0 0 (0-2)
13 24 22 72 14.8 ± 4.07 86.1 4.17 0 (0-2)
14 18 18 94 10.4 ± 3.43 79.8 4.26 1 (0-1)
Total: 242 212 807 14.79 ± 2.17 82,72 ± 7,62 2.27 ± 2.3 0 (0-1)

Tabell 1: Representativa resultat av antalet kanter som registrerats och analyserats, antalet erhållna CBF-mätningar och värdena för CBF, procentandel av normal CBP, IMI, DSK hos 14 friska försökspersoner, enligt detta protokoll. CBF = ciliär slagfrekvens, CBP = ciliärt slagmönster, IMI = immotilitetsindex och DSK = dyskinesipoäng.

Figure 12
Figur 12: Figur som illustrerar komplexiteten i näsborstning. a) epitelremsa av optimal kvalitet: intakt enhetlig cilierad epitelremsa > 50 μm lång, vilket gör att mer än 2 cilier eller grupper av flimmerhår kan användas för utvärdering av CBF och CBP (dvs. flimmerhåren som slår fritt i sidledsprofilen, utan att fastna i slem eller skräp). (B) Bild som representerar en stor mängd celler och slem som fastnat ovanför en cilierad epitelremsa, vilket förhindrar att cilia slår fritt och döljer cilia från observatören. (C) Kvaliteten på den registrerade kanten är otillräcklig, eftersom det är en kant med större projektion29. d) Enstaka cilierade celler, som inte kan användas för ciliär funktionell analys. (E) Näsborstningen har utförts på den främre delen av näshålan, fodrad med ett övergångs icke-cilierat epitel. Därför erhölls inga cilierade celler. Skalstång = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 13
Figur 13: Tätningstest av distans med gas och Trypan Blue-lösning. Distansens hermeticitet testades genom att fylla kammaren med 60 μL trypanblått och luft och sedan nedsänka kammaren i vatten i 4 timmar. Eftersom vi inte observerade trypanblått läckage eller luftbubblor i vattnet under de 4 timmarna, drog vi slutsatsen att kammaren var hermetisk för både gas och vätska. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument syftar till att tillhandahålla ett standardförfarande för CFA med hjälp av näsborstningsprover, med justeringar gjorda för lämpliga infektionskontrollöverväganden under COVID-19-pandemin. PCD-diagnos är utmanande och kräver för närvarande en panel med olika diagnostiska tester, enligt internationell rekommendation, inklusive nasal kväveoxidmätning, CFA med DHSV, ciliär ultrastrukturell analys med transmissionselektronmikroskopi (TEM), märkning av ciliära proteiner med immunofluorescens och genetisk testning för PCD-orsakande gener 4,37. För närvarande kommer inget enda test att diagnostisera varje patient med PCD 4,37. Enligt riktlinjerna från European Respiratory Society kan endast ultrastrukturella defekter av TEM och biallelmutationer i PCD-orsakande gener bekräfta en PCD-diagnos. Tyvärr har dessa test en 15-30% frekvens av falska negativa resultat 4,37,38,39. DHSV har fördelen att ha en högre känslighet och specificitet för PCD-diagnos (0,95-1,00 respektive 0,91-0,96)31,38,40,41, men de senaste internationella rekommendationerna uppgav att DHSV för närvarande inte är tillräckligt standardiserat för att bekräfta en PCD-diagnos 4,37. Faktum är att det saknas exakt driftsprocedur för cilierad provberedning och bearbetning, brist på standardiserad CFA-metod och normativa funktionella analysdata för tolkning av ciliär funktion 4,8,13,16,34,38,40. Detta dokument föreslår ett protokoll som används i mitten för att erhålla och bearbeta respiratoriska cilierade epitelprover och för ciliär funktionell utvärdering. Eftersom det för närvarande inte finns någon internationell konsensus för ett DHSV-protokoll kan vissa steg i processen variera mellan centra. Variation i faktorer som temperatur under ciliär videomikroskopi, medium som används och kvaliteten på epitelkanter som analyseras kan alla påverka ciliär funktion13.

Variation i temperaturen som ställts in under DHSV-analys finns mellan centra, med vissa som förespråkar att DHSV utförs vid rumstemperatur13. Vi förespråkar att provanalys görs vid 37 °C. Detta ökar komplexiteten i uppsättningen, men en PCD-diagnos kan missas om CBP-analys utförs under 37 °C. Jackson et al. rapporterade en temperaturkänslig variant av PCD, som uppvisade ett normalt samordnat taktmönster när cilier observerades vid rumstemperatur, men ett onormalt hyperfrekvent och dyskinetiskt mönster vid 37 °C42. Vidare har det beskrivits väl att CBF varierar med temperaturen, med ett sigmoidalt förhållande43,44, så att CBF-referensdata skiljer sig beroende på temperaturen som används för att utföra DHSV.

Vidare saknas idag standardisering i den manuella och/eller datorstödda metoden för CBF- och CBP-utvärdering13. I detta dokument föreslår vi den manuella CBF- och CBP-utvärderingstekniken som används i vårt laboratorium.

Eftersom manuell bearbetning av DHSV-data innebär viss subjektivitet och är tidskrävande har en mängd olika program utvecklats för CBF- och CBP-bedömning, med hjälp av olika halvautomatiserade (som involverar valet av specifika regioner av intresse (ROI) att undersöka) eller helautomatiserade program 34,45,46 (analysera hela den tagna bilden). Alla program använder variationen i ljusintensitet i pixlarna i de inspelade videobilderna över tid för att beräkna CBF. De flesta program involverar dock manuell eller automatiserad uteslutning av specifika data för att minska buller: områden med stasis, områden där CBF eller ciliary beat amplitude (CBA) faller under de särskilda tröskelvärdena. En jämförelse mellan den manuella och automatiserade CBF-utvärderingen har endast publicerats för ett program45, och visade ingen signifikant skillnad (parat t-test, p=0,64). Nyligen genomförda resultat på 75 PCD-patienter visade ingen signifikant skillnad mellan CBF-utvärdering erhållen genom Fast Fourier-transformation (FFT) och kymografi47. Olika datorstödda programvaror för CBP-analys har utvecklats 48,49,50, mestadels med utvärdering av CBP i begränsad avkastning, men för närvarande är ingen kommersiellt tillgänglig 48.

Såvitt vi vet är detta det första publicerade standardförfarandet för CFA som använder DHSV. CFA med färska näsborstningsprover har vissa begränsningar; De flesta av dem kan övervinnas genom att utföra en omanalys av ciliär funktion efter odling av respiratoriska cilierade celler. För det första kan infektion, inflammation eller skada under provtagning leda till sekundära ciliära funktionella avvikelser. Odlingen av respiratoriska cilierade celler kan förbättra noggrannheten hos DHSV, särskilt för att utesluta falskt positiva resultat27. För det andra, eftersom PCD-patienter uppvisar kronisk luftvägsinflammation och infektion, kan det vara nödvändigt att odla cilierat epitel, eftersom det kan vara svårt att hitta ett 4-6 veckors mellanrum utan infektion för att utföra en näsborstningsprocedur. För det tredje kanske kvaliteten på näsborstningsprovet inte är tillräcklig för att ge det nödvändiga antalet högkvalitativa kanter, särskilt hos små barn. Odling av proverna kan hjälpa till att lösa problemet. Slutligen kan CFA vara svårt om provet innehåller många cellskräp eller en hög belastning av slem; Detta kan också lösas om CFA utförs efter cellodling. Dessutom är omfattande personalutbildning i erfarna centra avgörande, eftersom upptäckt av CBP-avvikelser fortfarande är starkt beroende av prövarens erfarenhet 4,13. Utveckling och validering av automatiserad CBP-utvärderingsprogramvara kommer potentiellt att förbättra denna användarberoende variabilitet och bredda användningen av DHSV för PCD-diagnostiska ändamål.

Resultaten visar också vikten av näsborstningsteknik för att möjliggöra effektiv CFA. Noggrann näsborstningsteknik ökar förmågan att få epiteliala cilierade remsor av optimal kvalitet. I synnerhet begränsar näsblåsning före proceduren slem, utför mild borstning minskar röda blodkroppar och korrekt placering av borsten ökar framgångsgraden för att erhålla cilierat epitel eftersom borstning av den främre delen av näshålan ger tillbaka icke-cilierat epitel.

På grund av COVID-19-pandemins hälsokris har infektionskontrollöverväganden lett oss till att anpassa många aspekter av ciliära videomikroskopiprotokoll. Före pandemin använde vi en öppen labbbyggd kammare. Fördelarna med denna kammare inkluderar dess lätthet och snabbhet att förbereda och använda, kostnad och förmågan att återanvända efter rengöring. Det finns dock några viktiga försiktighetsåtgärder. Mängden medium är viktigt: cilierade remsor måste vara välhydrerade för att slå ordentligt, men för mycket media kommer att spillas ut ur den öppna kammaren och blandas med oljan, vilket förhindrar en bra bild. Dessutom måste proverna observeras inom högst 20 minuter för att undvika uttorkning. Detta kan potentiellt övervinnas om ytterligare M199-medium tillsätts med en spruta direkt under täckglaset. I samband med COVID-19-pandemin är det största problemet med den öppna kammaren att den möjliggör gas- och fuktutbyte mellan preparatet och miljön13. Det finns en potentiell risk för laboratorie- och operatörskontaminering om provet är infekterat av COVID-19. Vi identifierade en sluten visualiseringskammare med hjälp av en distans och demonstrerade dess effektivitet. Vi har ändrat protokollet, från näsborstning till glidberedning och analys, för att ta hänsyn till stränga infektionskontrollåtgärder som syftar till att förhindra överföring av COVID-19. Dessa anpassningar har gjort det möjligt för oss att fortsätta tillhandahålla en PCD-diagnostiktjänst utan att använda ett nivå 2 biosäkert laboratorium. Med tanke på den osäkra längden på denna nuvarande hälsokris och vikten av att fortsätta att tillhandahålla viktiga PCD-diagnostiska tjänster som DHSV, gör de anpassningar som föreslås i detta dokument det möjligt att genomföra CFA utan att använda L2-biosäkerhetslaboratorieresurser, obligatoriska för andra viktiga aktiviteter under denna hälsokris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dessa författare har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier och alla teammedlemmar i PCD-diagnostikcentret i Paris-Est för deras tillgänglighet och hjärtliga välkomnande under besöket på deras PCD-diagnostikcenter och de många utbytena. Vi tackar också Robert Hirst och alla teammedlemmar på PCD-centret i Leicester för deras välkomnande och tid, råd och expertis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 165 primär ciliär dyskinesi ciliär videomikroskopi ciliär slagfrekvens ciliärt slagmönster ciliär funktionell analys näsborstning respiratoriskt cilierat epitel COVID-19
Nasal borstning provtagning och bearbetning med digital höghastighets ciliär videomikroskopi - Anpassning för COVID-19-pandemin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bricmont, N., Benchimol, L.,… More

Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A. L., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M. C., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter