Summary
O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.
Abstract
O método de clonagem golden gate permite a montagem rápida de múltiplos genes em qualquer arranjo definido pelo usuário. Ele utiliza enzimas de restrição tipo IIS que cortam fora de seus sites de reconhecimento e criam uma saliência curta. Este sistema de clonagem modular (MoClo) usa um fluxo de trabalho hierárquico no qual diferentes partes de DNA, como promotores, sequências de codificação (CDS) e terminadores, são primeiramente clonadas em um vetor de entrada. Vários vetores de entrada então se reúnem em unidades de transcrição. Várias unidades de transcrição então se conectam a um plasmídeo multi-gene. A estratégia de clonagem da Golden Gate é de tremenda vantagem porque permite um conjunto sem cicatrizes, direcional e modular em uma reação de um pote. O fluxo de trabalho hierárquico normalmente permite a clonagem fácil de uma grande variedade de construções multigênicas sem necessidade de sequenciamento além dos vetores de entrada. O uso de evasão de proteínas fluorescentes permite uma triagem visual fácil. Este trabalho fornece um protocolo detalhado passo a passo para a montagem de plasmídeos multi-genes usando o kit de clonagem modular de levedura (MoClo). Mostramos resultados ótimos e subótimos da montagem plasmida multigênica e fornecemos um guia para triagem para colônias. Esta estratégia de clonagem é altamente aplicável para a engenharia metabólica de levedura e outras situações em que a clonagem plasmida multi-gene é necessária.
Introduction
A biologia sintética visa projetar sistemas biológicos com novas funcionalidades úteis para indústrias farmacêuticas, agrícolas e químicas. Reunir um grande número de fragmentos de DNA de forma de alto rendimento é uma tecnologia fundamental em biologia sintética. Um processo tão complicado pode se dividir em múltiplos níveis com diminuição da complexidade, conceito emprestado das ciências básicas de engenharia1,2. Na biologia sintética, fragmentos de DNA geralmente se reúnem hierarquicamente com base na funcionalidade: (i) Nível de peça: "partes" refere-se a fragmentos de DNA com uma função específica, como um promotor, uma sequência de codificação, um exterminador, uma origem da replicação; (ii) Unidades de transcrição (TU) nível: um TU consiste de um promotor, uma sequência de codificação e um exterminador capaz de transcrever um único gene; (iii) Nível multi-gene: um plasmídeo multi-gene contém múltiplas TUs frequentemente compostas de toda uma via metabólica. Esta montagem hierárquica pioneira pela comunidade BioBrick é o conceito fundamental para a montagem de grandes conjuntos de DNAs em biologia sintética3.
Na últimadécada, 4,5,6,7,a técnica de clonagem golden gate facilitou significativamente o conjunto hierárquico de DNA2. Muitos outros métodos de clonagem em várias partes, como a clonagem gibson8,clonagem independente de ligadura (SLIC)9,clonagem baseada em excisão uracil (USUÁRIO)10,a reação de ciclismo ligase (LCR)11e a recombinação in vivo (Pedador de DNA)12,13, também foram desenvolvidos até agora. Mas a clonagem do Golden Gate é um método ideal de montagem de DNA porque é independente de sequências específicas de genes, permitindo montagem sem cicatrizes, direcionais e modulares em uma reação de um pote. A clonagem golden gate aproveita as enzimas de restrição tipo IIS que reconhecem uma sequência não palindômica para criar saliências escalonadas fora do local de reconhecimento2. Um ligase então se junta aos fragmentos de DNA ressarcidos para obter uma montagem em várias partes. A aplicação desta estratégia de clonagem ao sistema de clonagem modular (MoClo) permitiu a montagem de até 10 fragmentos de DNA com mais de 90% de transformadores rastreados contendo a construção corretamente montada4.
O sistema MoClo oferece enormes vantagens que aceleraram o ciclo de projeto-construção-teste da biologia sintética. Em primeiro lugar, as peças intercambiáveis permitem clonagem combinatória para testar um grande espaço de parâmetros rapidamente. Por exemplo, otimizar uma via metabólica geralmente requer ciclismo através de muitos promotores para cada gene para equilibrar o fluxo da via. O sistema MoClo pode facilmente lidar com tarefas de clonagem tão exigentes. Em segundo lugar, é preciso sequenciar a peça plasmid, mas tipicamente não o TU ou os plasmídeos multi-genes. Na maioria dos casos, a triagem por PCR colônia ou digestão de restrição é suficiente para verificação no nível TU e plasmídeo multi-gene. Isso porque a clonagem da peça plasmid é o único passo que requer PCR, que frequentemente introduz mutações. Em terceiro lugar, o sistema MoClo é ideal para construir vias metabólicas multigênicas complexas. Por fim, por causa das saliências universais, a parte plasmids pode ser reutilizada e compartilhada com toda a comunidade de bioengenharia. Atualmente, os kits MoClo estão disponíveis para plantas14,15,5,16,17, fungos6,18,19,20,21,22, bactérias7,23,24,25,26,27, e animais28,29. Uma plataforma MoClo multi-reinos também foi introduzida recentemente30.
Para Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 desenvolveram um versátil kit de ferramentas MoClo, um excelente recurso para a comunidade de biologia sintética de levedura. Este kit vem em um formato conveniente de 96 poços e define oito tipos de partes de DNA intercambiáveis com uma coleção diversificada de promotores bem caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, tags de peptídeos, marcadores de seleção, origem da replicação e ferramentas de edição de genomas. Este kit de ferramentas permite a montagem de até cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene. Essas características são valiosas para a engenharia metabólica de levedura, na qual vias parciais ou inteiras são super expressas para produzir produtos químicos direcionados. Utilizando este kit, os pesquisadores otimizaram a produção de geraniol, linalool31,penicilina32, ácido mucorico33, índigo34e betalain35 em levedura.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para orientar o uso do kit de ferramentas MoClo para gerar caminhos multi-genes para expressão episômica ou genômica. Através do uso extensivo deste kit, descobrimos que a medição precisa das concentrações de DNA é fundamental para garantir a distribuição equimolar de cada parte na reação da Golden Gate. Também recomendamos a liga ligase de DNA T4 sobre a liga ligase de DNA T7 porque o primeiro funciona melhor com um número maior de saliências36. Por fim, quaisquer locais de reconhecimento interno de BsmBI e BsaI devem ser removidos ou domesticados antes da montagem. Alternativamente, pode-se considerar sintetizar peças para remover vários sites internos e alcançar a otimização simultânea do codon. Demonstramos como usar este kit de ferramentas expressando um caminho de cinco genes para a produção de β-caroteno e licopeno em S. cerevisiae. Nós ainda mostramos como derrubar o lócus ADE2 usando as ferramentas de edição de genomas deste kit. Esses experimentos baseados em cores foram selecionados para fácil visualização. Também demonstramos como gerar proteínas de fusão e criar mutações de aminoácidos usando a clonagem golden gate.
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Protocol
NOTA: O protocolo hierárquico de clonagem oferecido neste kit de ferramentas pode ser dividido em três etapas principais: 1. Plasmids de peça de clonagem; 2. Unidades de transcrição de clonagem (TUs); 3. Clonagem de plasmídeos multiédis(Figura 1). Este protocolo começa a partir do projeto primer e termina com aplicações do plasmídeo multi-gene clonado.
1. Design primer para clonagem da peça plasmid (pYTK001):
- Projete os primers dianteiros e invertidos contendo nucleotídeos de flanqueamento TTT no final de 5', um local de reconhecimento BsmBI com um nucleotídeo adicional (CGTCTCN), uma saliência de 4 nucleotídeos (nt) complementar ao do vetor de entrada, um site de reconhecimento BsaI com um nucleotídeo adicional (GGTCTCN), e uma saliência parcial específica de 4 nt, além da sequência específica do modelo(Figura 2A). GoldenBraid 4.037 e GoldenMutagenesis38 são alguns dos softwares online que podem ser usados para design de primer específico golden gate.
- Se os sites de reconhecimento BsaI ou BsmBI estiverem presentes em qualquer parte, use uma etapa de domesticação para mutar esses locais antes do conjunto Golden Gate39. Para plasmídeos integrativos (ver passo 4), domestice qualquer site de reconhecimento NotI. Para domesticar uma peça com um local de reconhecimento indesejável, divida a peça em duas subpartas perto do local indesejável(Figura 2A):
- Projete o primer dianteiro da primeira subparte da mesma forma que na etapa 1.1. mas projete o primer reverso com o site BsmBI e uma saliência específica de 4 ntsóis apenas.
- Projete o segundo primer de sub-parte para a frente com o site BsmBI e a saliência específica de genes de 4 nt apenas que se sobrepõe ao primer reverso da primeira sub-parte. Projete o primer reverso da segunda subtramida da mesma forma que na etapa 1.1.
- Introduza a mutação desejada no inverso (para a etapa 1.2.1) ou no primer para frente (passo 1.2.2) na região específica do gene do primer.
NOTA: Alternativamente, uma peça livre de BsmBI e BsaI e otimizada por codon pode ser sintetizada comercialmente. Para sequências de codificação (CDS), uma mutação sinônimo pode ser facilmente incorporada no terceiro nucleotídeo de um códon de aminoácidos. Para promotores e exterminadores, no entanto, a verificação da atividade do promotor ou exterminador mutado usando um ensaio de repórter é recomendada39. Se houver um local de restrição indesejável no final da sequência, ele pode ser mutado usando um primer reverso mais longo. Se vários sites indesejáveis estiverem presentes, a mutagênese dirigida ao local permite a mutação de vários locais pode ser realizada40.
- Ocasionalmente, fundir duas proteínas como uma única parte com um linker no meio é desejável(Figura 2A). O linker ajuda a garantir a integridade estrutural das duas proteínas individuais41.
- O primer dianteiro para o primeiro gene é o mesmo da etapa 1.1. No primer inverso, inclua um site BsmBI, uma saliência específica de genes de 4 nt e uma sequência de linker. A saliência de 4-nt pode ser o linker ou os primeiros nucleotídeos do segundo gene.
- Para o segundo gene, projete a cartilha dianteira de tal forma que tenha um local de reconhecimento BsmBI e uma saliência de 4-nt complementar à do primer reverso do primeiro gene. Projete o primer reverso do segundo gene como na etapa 1.1.
- Para amplificar as partes por reação em cadeia de polimerase (PCR)42,use uma polimerase de DNA de alta fidelidade para amplificar as partes de um DNA genômico, um cDNA ou um plasmídeo. Verifique o produto PCR em um gel de 1% de agarose seguido de purificação de gel. O uso de DNA purificado é fortemente recomendado, se a purificação do gel for trabalhosa, use pelo menos uma coluna de spin para purificar o produto PCR.
2. Clonagem de peças no vetor de entrada (pYTK001) para criar plasmídeos de peça(Figura 2B)
- Para configurar o mix de reação Golden Gate, adicione 20 fmol de cada produto PCR e o vetor de entrada (pYTK001), 1 μL de tampão de ligase 10X T4, 0,5 μL de Esp3I (um isoschizomer altamente eficiente de BsmBI) e 0,5 μL de ligase T4. Adicione ddH2O para levar o volume total a 10 μL.
- Para configurar a reação de clonagem, execute o seguinte programa em um termociclador: 25-35 ciclos de 37 °C para 5 min (digestão) e 16 °C para 5 min (ligadura), seguido de digestão final a 50 °C para 10 min e inativação enzimápica a 80 °C por 10 min.
NOTA: 35 ciclos de digestão/ligação são recomendados ao clonar várias peças de DNA no vetor de entrada simultaneamente, por exemplo, durante a clonagem de genes de fusão ou domesticação de um gene. - Transforme toda a mistura de reação na cepa DH5α ou células equivalentes Escherichia coli quimicamente competentes por choque térmico. Transformando todo o produto clonado de 10 μL em células E. coli quimicamente competentes (2 X 105 cfu/mL, a CFU é calculada a partir da transformação de 5 ng pYTK001 em 100 μL das células competentes). Espalhe em uma placa de caldo de lise (LB) com 35 μg/mL de cloramfenicol (Cm). Incubar a 37 °C durante a noite.
- Depois de 16-18 h, retire a placa da incubadora e mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar a proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) desenvolver-se para uma cor verde mais intensa.
- Para uma triagem mais fácil, coloque a placa em um ultravioleta (UV) ou em um transilluminador de luz azul. O sfGFP contendo colônias irá fluorescer sob a luz UV.
- As colônias verdes são negativas porque contêm o pYTK001 sem cortes. As colônias brancas são provavelmente positivas. A clonagem é geralmente bem sucedida se houver ~30-100% de colônias brancas. Realizar uma triagem adicional de algumas colônias brancas por pcr colônia ou digestões de restrição (enzima sugerida: BsaI-HFv2).
- Purificar plasmídeos de algumas das colônias potencialmente corretas e confirmar as sequências por sequenciamento Sanger.
3. Montagem de plasmídeos em plasmídeos
NOTA: Um plasmídeo contém uma unidade de transcrição definida pelo usuário (TU) composta por um promotor, um CDS e um exterminador. Um plasmídeo permite a expressão de um único gene. Se os plasmídeos serão montados em um plasmídeo multi-gene, então o primeiro passo é determinar o número e a ordem de TUs no plasmídeo multi-gene. Estes determinarão quais conectores usar nos plasmídeos, uma vez que os conectores ligam TUs no plasmídeo multi-gene. O primeiro conector esquerdo do TU deve ser ConLS, e o conector direito do último TU deve ser ConRE. Eles se sobreporão com conls e ConRE' de plasmídeos multi-genes. O resto dos conectores devem estar na ordem numérica crescente. Por exemplo, se o plasmídeo multigênito contém quatro TUs, as combinações de conectores seriam ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 e ConL3-TU4-ConRE(Figura 1).
- Antes de montar unidades de transcrição, recomenda-se a montagem de um vetor intermediário com as seguintes seis partes: o conector esquerdo, o dropout sfGFP (pYTK047), o conector direito, um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação e a parte plasmid com um mRFP1, uma origem E. coli. e o gene resistente à ampicilina (pYTK083) (Figura 3).
- Purifique os seis plasmídeos acima. Registosas concentrações usando um espectrofotômetro UV-Vis ou um ensaio baseado em fluorescência e diluir cada plasmídeo com ddH2O para que 1 μL tenha 20 fmol de DNA. Calcule a concentração molar de DNA usando uma calculadora online.
NOTA: É muito importante medir as concentrações de DNA com precisão e encanar precisamente para que a montagem funcione, especialmente para montagens com plasmídeos de cinco a sete partes. Pequenos erros na concentração de DNA de cada plasmídeo podem causar uma diminuição significativa na eficiência da clonagem. - Adicione 1 μL de cada plasmídeo, 1 μL de tampão ligase T4 10X, 0,5 μL de BsaI-HFv2 (uma versão altamente eficiente de BsaI) e 0,5 μL de ligase T4. Coma o volume a 10 μL adicionando ddH2O.
- Para configurar a reação de clonagem, execute o seguinte programa no termociclador: 25-35 ciclos de 37 °C para 5 min (digestão) e 16 °C por 5 min (ligadura). Omitir as etapas finais de digestão e inativação de calor, pois os locais de BsaI precisam ser mantidos no vetor intermediário(Figura 3).
- Transforme toda a mistura de reação na cepa DH5α ou outras células competentes de E. coli. Espalhe em uma placa LB com carbenicilina de 50 μg/mL (Cb) ou ampicillina. Incubar a 37 °C durante a noite.
NOTA: Carbenicillin é um analógico estável da ampicilina. - Depois das 16h18, tire a placa da incubadora. A placa conterá colônias verdes pálidas e vermelhas pálidas(Figuras 6C e 6D). Mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar o mRFP1 e o sfGFP maduros. Use um UV ou um transilluminador de luz azul para identificar as colônias verdes, que contêm o vetor intermediário potencialmente correto.
- Listrar as colônias verdes em uma placa LB + Cb e incubar a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, saia novamente em uma placa LB + Cm e incubar a 37 °C durante a noite. As colônias que crescem em placas LB + Cm contêm plasmídeos desmontados porque os vetores de parte resistentes a CM são retidos.
- Escolha as colônias que não crescem na placa LB + Cm e realize digestões de restrição (enzimas sugeridas: BsaI-HFv2, Esp3I) para confirmar o plasmídeo corretamente montado. Alternativamente, use a COLÔNIA PCR para triagem.
- Purifique os seis plasmídeos acima. Registosas concentrações usando um espectrofotômetro UV-Vis ou um ensaio baseado em fluorescência e diluir cada plasmídeo com ddH2O para que 1 μL tenha 20 fmol de DNA. Calcule a concentração molar de DNA usando uma calculadora online.
- Uma vez que o vetor intermediário tenha sido montado com sucesso, o próximo passo é montar unidades de transcrição. Este é um conjunto de 4 peças com as seguintes partes: o vetor intermediário, um promotor, um CDS e um exterminador.
- Purificar os três plasmídeos de quatro partes. Regissuça suas concentrações e dilua cada um dos plasmídeos para que 1 μL tenha 20 fmol de DNA.
- Para configurar a mistura de reação, siga o Passo 3.1.2.
- Para configurar a reação de clonagem, siga o Passo 2.2.
- Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli e placa em LB + Cb. Incubar a 37 °C durante a noite.
- Depois de 16-18 h, retire a placa da incubadora. Serão exibidas colônias verdes brancas e pálidas(Figuras 6E e 6F). Mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar o sfGFP amadurecer. Use um UV ou um transilluminador de luz azul para identificar as colônias brancas não fluorescentes. Estes contêm as unidades de transcrição potencialmente corretas.
- Ria e cresce 8-10 colônias brancas e realiza uma colônia PCR. Purificar plasmídeos das colônias que testam positivo da colônia PCR. Realize a digestão de restrição (enzima sugerida: Esp3I) para confirmar ainda mais a montagem.
NOTA: As unidades de transcrição de sequenciamento normalmente não são necessárias porque a clonagem envolve apenas a digestão e a ligadura de restrição. Todas as sequências de interesse foram confirmadas no nível plasmídeo da peça.
4. A montagem de plasmídeos de em plasmídeos multi-genes:
NOTA: Plasmídeos multiédis permitem a expressão de mais de um gene. Dependendo da aplicação a jusante, plasmídeos multi-genes podem ser replicativos ou integrativos. Plasmídeos replicativos têm a origem da levedura da replicação; portanto, pode ser mantido com estada quando a célula de levedura se divide. Plasmídeos integrativos não têm a origem da levedura da replicação. Em vez disso, eles têm braços de 5' e 3' homologia permitindo a integração de múltiplos genes em loci específicos do genoma através da recombinação homólogo.
- Para plasmídeos multi-genes, monte um vetor intermediário primeiro.
- Para montar vetores intermediários replicativos(Figura 4A),monte as seguintes seis partes: o conector esquerdo (ConLS'-pYTK008), o desistência sfGFP (pYTK047), o conector direito (ConRE'-pYTK072), um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação, e a parte plasmid com mRFP1, uma origem E. coli de replicação, e o gene resistente à kanamicina (pYTK084).
- Para montagem, siga os passos de 3.1.1 para 3.1.3.
- Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli, e placa em LB mais 50 μg/mL kanamycin (Km). Incubar a 37 °C durante a noite.
- Para triagem baseada em cores vermelhas/verdes, siga o passo 3.1.5.
- Para a triagem de misassemblies, raia e crescer as colônias verdes em uma placa LB + Km. Em seguida, siga o passo 3.1.6.
- Para vetores multigógenos integrativos(Figura 4B),determine o lócus genômico de interesse primeiro, em seguida, projete aproximadamente 500 pares de base de braços de 5' e 3' de ecologia para integração a esse lócus.
- Clone os braços de elogia de 5' e 3' do DNA genômico de leveduras no vetor de entrada-pYTK001. Siga os passos 1 e 2.
- Monte os seguintes sete plasmídeos: o conector esquerdo (ConLS'-pYTK008), o dropout sfGFP (pYTK047), o conector direito (ConRE'-pYTK072), um marcador de seleção de leveduras, o braço de 3' homologia, a parte plasmid com mRFP1, E. coli origem da replicação, e o gene resistente à kanamicina (pYTK090), e o braço de 5' homologia.
- Para montagem e triagem, siga o passo 4.1.1.
- Para montar vetores intermediários replicativos(Figura 4A),monte as seguintes seis partes: o conector esquerdo (ConLS'-pYTK008), o desistência sfGFP (pYTK047), o conector direito (ConRE'-pYTK072), um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação, e a parte plasmid com mRFP1, uma origem E. coli de replicação, e o gene resistente à kanamicina (pYTK084).
- Montagem do plasmídeo multi-gene
- Purificar plasmídeos do vetor intermediário obtido na etapa 4.1 e os plasmídeos da etapa 3. Registosas de suas concentrações usando um espectrofotômetro UV-Vis ou um ensaio baseado em fluorescência. Diluir cada um em ddH2O para que 1 μL tenha 20 fmol DNA.
- Adicione 1 μL de vetor intermediário, 1 μL de cada unidade de transcrição, 1 μL de tampão de ligase T4 de 10x, 0,5 μL de Esp3I e 0,5 μL de liga ligase T4. Leve o volume para 10 μL de uso ddH2O.
- Para configurar a reação de clonagem, siga o passo 2.2.
- Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli, e placa em LB + Km. Incubar a 37 °C durante a noite.
- Realize a triagem verde/branco como na etapa 3.2.5.
- Purificar plasmídeos de algumas colônias brancas e realizar digestões de restrição. O uso da enzima NotI-HF é recomendado porque existem dois locais NotI na parte do marcador de seleção E. coli e Km, respectivamente(Figura 4B). Se o plasmídeo montado for muito grande, então outro local de restrição pode ser escolhido para confirmação posterior. Alternativamente, tela com COLÔNIA PCR antes de proceder à digestão de restrição.
5. Aplicando plasmídeos multi-genes para expressão genética cromossômica ou plasmida
- Integrando plasmídeos multi-genes no genoma da levedura para expressão genética cromossômica(Figura 5)
- Projete um RNA guia (gRNA) para o lócus desejado. O uso de vários recursos on-line, como Benchling, CRISPRdirect43e CHOPCHOP44,é recomendado para determinar a especificidade máxima no alvo.
- Clone o gRNA sintetizado de 20 nt no plasmídeo pCAS45 por clonagem Gibson. Linearize o plasmídeo pCAS por PCR usando um par de primer invertido que liga aos 3' da ribozyme HDV e aos 5' do tracrRNArespectivamente (Figura 5). Alternativamente, clone o gRNA no plasmídeo de desistência sgRNA (pYTK050) e monte o plasmídeo de gota em um plasmid com linkers. Em seguida, monte o Cas9 TU com o plasmídeo cas9 parte (pYTK036). Por último, monte o Cas9 TU e o sgRNA TU em um plasmídeo multi-gene replicativo.
- Linearize 5-15 μg de plasmídeo multi-gene integrativo com 1 μL de enzima NotI-HF durante a noite. Transforme 1 μg de pCAS-gRNA e o plasmídeo integrativo linearizado multi-gene em S. cerevisiae. Prepare células competentes usando um kit de transformação de leveduras comercialmente disponível ou seguindo o protocolo de Geitz e Schiestl, 200746.
NOTA: É desnecessário purificar o plasmídeo multi-gene linearizado após a digestão NotI. - Pelotar as células após a recuperação, descartar o sobrenante, lavar com um volume igual de água. Células de levedura de placa na placa de abandono do meio sintético completo (CSM) ou na placa de extrato de peptone dextrose (YPD) com antibióticos, dependendo do marcador seletivo de levedura. Incubar a 37 °C por dois dias para que as colônias se formem. Caso nenhuma colônia seja observada, incubar por mais um a dois dias a 30°C.
- Colônias de leveduras de tela para integração pela colônia PCR47.
- Para curar o pCAS, saia da colônia com a integração correta em uma placa YPD não seletiva. Cresça a 30 °C durante a noite. Raia uma colônia da placa YPD em uma placa YPD fresca. Novamente, cresça a 30 °C durante a noite. Streak uma colônia da segunda placa YPD para um YPD mais 100 μg/mL nourseothricin, o marcador de seleção de pCAS. A cura bem sucedida ocorre quando as células de levedura não crescem na placa seletiva.
NOTA: Se o plasmídeo pCAS não for curado em duas rodadas de YPD não-seletivo, volte a entrar em um YPD fresco por mais 1-2 rounds.
- Transformando plasmídeo multi-gene replicativo para expressão genética baseada em plasmídeo
- Transforme 100 ng-1 μg puro plasmídeo multi-gene em células competentes S. cerevisiae.
- Células de levedura de placa imediatamente após a transformação na placa de abandono CSM ou YPD mais placa de antibiótico, dependendo do marcador de seleção de leveduras utilizado. Incubar a 30°C por 2-3 dias para as colônias se formarem.
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Representative Results
Aqui estão os resultados de quatro pládidos multi-genes replicativos para produção de β-caroteno (amarelo) e licopeno (vermelho). Um plasmídeo multi-gene integrado para interromper o lócus ADE2 foi construído, das quais as colônias são vermelhas.
Clonagem de CDSs no vetor de entrada (pYTK001)
O ERG20 foi amplificado a partir do genoma da levedura e dos três genes carotenoides crtE, crtYB, crtI do plasmid pLM49448 no vetor de entrada pYTK001 como descrito. Os promotores de levedura pENO2, pTIP1, pPYK1 e pPDC1 e terminadores tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 foram clonados como plasmídeos. Uma mutação de ponto foi introduzida no CrtYB (G247A) para a produção de licopeno e uma construção de fusão BTS1-ERG20 foi criada para canalizar melhor o prenyl intermediário para carotenoides. As figuras 6A e 6B mostram uma placa representativa da clonagem bem sucedida de uma peça plasmid e fornecem um exemplo da triagem verde/branca com 90,35 ± 4,22% de colônias totais sendo potencialmente corretas (brancas).
Montagem de unidades de transcrição (cassete plasmids)
Antes de montar o plasmídeo, o design do plasmídeo multi-gene foi finalizado. Para as quatro TUs carotenoides, quatro vetores intermediários com conectores diferentes foram clonados primeiro após o passo 3.1. Os números 6C e 6D mostram uma placa representativa de uma montagem bem sucedida do vetor intermediário e fornecem um exemplo da triagem vermelho/verde, com 17,56 ± 3,32% do total de colônias sendo positivas (verde). Embora essa proporção seja relativamente baixa, a triagem é muito facilitada pela fluorescência verde.
Em seguida, os TUs para BTS1-ERG20, ERG20, CRTE, crtYB, crtYB(G247A)e crtI foram montados seguindo o passo 3.2 (Tabela 1). As figuras 6E e 6F mostram uma placa representativa de uma montagem bem sucedida das TUs e fornecem um exemplo de método de triagem verde/branco, com 65,02 ± 4,99% do total de colônias sendo positivas (brancas).
Montagem de plasmídeos multi-genes
Quatro plóides multi-genes replicativos e um integrativo foram montados. Para plasmídeos multi-genes replicativos, ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) e crtI foram montados em quatro combinações diferentes, criando quatro plasmídeos: dois para β-caroteno e dois para produção de licopeno(Tabela 2). A razão de colônias potencialmente corretas (verde) para a clonagem vetorial intermediária foi de 1,83 ± 0,15%(Figuras 7A e 7B). Embora esse número pareça baixo, a triagem foi facilitada pela detecção da fluorescência verde(Figura 7B). Uma vez clonado o plasmídeo intermediário, a taxa de sucesso da montagem de plasmídeos multiéssegrados (brancos) do intermediário foi de 93,77± 1,65%(Figuras 7C e 7D). As figuras 7E e 7F mostram uma montagem subótima de plasmídeos multi-genes, já que o número de colônias positivas (brancas) eram insignificantes. Depois de se transformarem em levedura, colônias que produzem β-caroteno (amarelo) e licopeno (vermelho) cresceram no terceiro dia. Quatro colônias de cada prato foram listradas em placas frescas e cultivadas por mais dois dias. As figuras 8A e 8B mostram que fundir o BTS1-ERG20 direciona mais geranylgeranyl-pirofosfato para a produção carotenoide, como visto por cores mais escuras do que usando o ERG20 sozinho. Após a extração49 e quantificação dos carotenoides por espectrofotometria UV-Vis com padrões autênticos, vê-se que a fusão de BTS1-ERG20 leva à produção de 0,729 μg/mg β-caroteno, que é ~35 vezes maior que 0,021 μg/mg β-caroteno produzido pela cepa apenas com ERG20. Da mesma forma, a produção de licopeno é ~16,5 vezes maior na cepa com BTS1-ERG20 (1.126 μg/mg) em comparação com eRG20 (0,068 μg/mg) sozinho(Figura 8C).
Plasmídeos multigósmos replicativos transformados em levedura com (A) FUSão BTS1-ERG20 TU e (B) ERG20 TU. Em cada placa, a levedura do lado esquerdo tem plasmídeos contendo crtE TU, crtYB TU e crtI TU para a produção de β-caroteno e levedura no lado direito tem plasmídeos contendo crtE TU, crtYB (G247A)TU, e CRTI TU para a produção de licopeno.
Para o plasmídeo integrativo, foram montados os braços de evasão do ConLS, sfGFP, ConRE', HIS3 (marcador de seleção de leveduras), braços de 5' e 3' de e 3' de escoologia após o passo 4.1.2. Os braços de 5' e 3' da ecologia estavam a 500 bp de distância, excluindo ~180 aminoácidos após a integração. Além disso, o braço de 5' homologia tinha seis códons de parada no final de 3'. O ADE2 mutado resultou em colônias vermelhas50. O ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 foram usados e seguiram a etapa 5.1 para integração genômica. Após 3-4 dias, colônias vermelhas foram observadas na placa YPD + 100 μg/mL nourseothricin, indicando que a ADE2 havia sido interrompida com sucesso (Figuras 8D e 8E).
Figura 1: Visão geral da montagem multigênica. A montagem ocorre em três níveis. In0 nível 1, o CDS, ou qualquer outra parte, é amplificado do genoma ou sintetizado, e então clonado no vetor de entrada pYTK001 usando a enzima BsmBI (ou Esp3I). ColE1: E. coli origem da replicação; CmR: Gene resistente ao clorofenicol. No nível 2, a unidade de transcrição (TU) contendo um promotor, um CDS e um exterminador é montada usando a enzima BsaI. No nível 3, até cinco unidades de transcrição são montadas em um plasmídeo multigósseico usando a enzima BsmBI (ou Esp3I). O plasmídeo multi-gene pode ser replicativo ou integrativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Projeto de primer e clonagem de parte plasmídeos. (A) Projeto primer para amplificar partes individuais, domesticar genes ou criar mutações pontuais e montar proteínas de fusão. Os primers incluem o reconhecimento BsmBI e os sites de corte e reconhecimento BsaI e a saliência do MoClo para montagem adequada. As saliências moClo estão representadas como 1, 2, 3, 4 e 5, 6, 7, 8. Primers internos para domesticação ou criação de proteína de fusão contém o BsmBI, mas não os locais de BsaI. As saliências para estes são sequências internas personalizadas (NNNN e N'N'N'N' em roxo). O terminal "ttt" está incluído para a digestão da enzima ideal. G.A. (B) Clonagem de peças amplificadas no vetor de entrada pYTK001 usando BsmBI (ou Esp3I). As saliências complementares levam à integração da peça e à remoção do site de reconhecimento da BsmBI. ColE1: E. coli origem da replicação; CmR: Gene resistente ao clorofenicol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Montagem da unidade de transcrição. Para montar os plasmídeos TU, recomenda-se a montagem de um vetor intermediário para facilitar a montagem de TU combinatória. Para montar o vetor intermediário, clone o Con LX (X: um dos cinco conectores esquerdos), o desistência do SGFP, o Con RY (Y: um dos cinco conectores certos), um ORI de levedura (origem da replicação) e uma parte do marcador de levedura no vetor de evasão mRFP1 usando a enzima BsaI. O plasmídeo intermediário é resistente à ampicilina. Os locais de reconhecimento BsaI são retidos para clonagem plasmida TU. Para clonar o plasmídeo TU, um promotor, um CDS e um exterminador são montados no vetor intermediário usando BsaI. O TU clonado terá locais BsmBI nas regiões ConLX e ConRY para o próximo passo de montagem multigênica. O TU clonado também é resistente à ampicilina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| nome | ConLX (conector esquerdo) | promotor | Cds | terminador | ConRY (conector direito) |
| BTS/ERG20 TU | É | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 TU | É | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE TU | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB TU | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A TU | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI TU | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | Re |
Tabela 1: Unidades de transcrição utilizadas neste estudo. Promotores e exterminadores foram amplificados de S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyl diphosphate synthase) e ERG20 (sinthetase pirofosfato farnesyl) foram amplificados a partir de S. cerevisiae. Os genes crtE (geranylgeranyl diphosphate synthase), crtYB (bifunctional lycopene cyclase/fitoene synthase) e crtI (fitoene desaturase) eram de Xanthophyllomyces dendrorhous.
Figura 4: Montagem plasmida multigênica. (A) Montagem plasmida replicativa. A montagem do vetor intermediário replicativo inclui a clonagem do Con LS', o desistência do SGFP, o Con RE', um ORI de levedura, um marcador de levedura e uma origem E. coli e marcador no vetor de evasão mRFP1 usando a enzima BsaI. Os sites conLS e ConRE introduzem sites de reconhecimento BsmBI ao vetor. Conjuntos potencialmente corretos podem ser selecionados procurando colônias verdes em uma placa seletiva com kanamicina. As TUs previamente montadas podem então ser clonadas no vetor intermediário usando a enzima BsmBI. Este plasmídeo contém um ORI de levedura permitindo que ele se replique em um hospedeiro de levedura. (B) Montagem plasmida integrativa. A montagem do vetor intermediário integrado inclui a clonagem do Con LS', o desistência do SGFP, o Braço de Ecologia de 5', um braço de ecologia de 3', um marcador de levedura e a origem E. coli e marcador no vetor de evasão de gota da RFP usando a enzima BsaI. Os conjuntos corretos devem aparecer verdes em uma placa seletiva com kanamicina. As unidades de transcrição feitas anteriormente podem ser clonadas no vetor intermediário replicativo usando a enzima BsmBI. Este vetor não possui um ORI de levedura e será integrado ao lócus alvo através de CRISPR e recombinação homologos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| nome | TU1 | TU2 | TU3 | UUU | produto |
| B/E-β-Carotene | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-caroteno |
| B/E-Licopeno | BTS1/ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | licopeno |
| E-β-Carotene | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-caroteno |
| E-Licopeno | ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | licopeno |
Tabela 2: Plasmids multi-genes utilizados neste estudo.
Figura 5: Integração CRISPR. (A) Clonagem crispr e plasmid auxiliar. O plasmídeo pCAS contém a endonuclease Cas9 e componentes (promotor de tRNA, exterminador SNR52, ribozyme HDV e tracrRNA) para a expressão ideal de um gRNA. Clone o plasmídeo pCAS+gRNA montando o gRNA sintético com o pCAS linearizado usando clonagem Gibson. (B) CRISPR auxiliou a integração genética. Passo 1: Cotransformação: pCAS +gRNA foi co-transformado em levedura com o plasmídeo integrativo contendo os genes(s) de interesse (GOI), um marcador seletivo de levedura, e região de 5' e 3' hologia visando o lócus genômico. Para uma integração ideal, linearize o plasmídeo integrativo com NotI. Passo 2: Integração no lócus alvo: Cultivar a levedura transformada em uma placa seletiva para o marcador de levedura, seja antibiótico ou auxotrófico. Realize genotipagem para confirmar a integração. Passo 3: Cure o plasmídeo pCAS + gRNA, espalhando levedura em uma placa não-seletiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Placas representativas da clonagem de nível da unidade de entrada e transcrição em E. coli. Placas representativas da clonagem bem sucedida de um gene no vetor de entrada pYTK001 sob(A) luz visível e(B) luz UV. Colônias positivas são brancas e colônias negativas são verdes. A proporção de colônias positivas em colônias gerais é de 90,35± 4,22 %. Montagem bem sucedida do vetor intermediário para montagem do nível da unidade de transcrição e seleção verde/vermelha sob(C)luz visível e(D)luz UV. Colônias positivas são verdes. A proporção de colônias positivas em colônias gerais é de 17,56 ± 3,32 %. Montagem bem sucedida da unidade de transcrição do vetor intermediário e da triagem verde/branca sob(E)luz visível e(F)luz UV. Colônias positivas são brancas e colônias negativas são verdes. A proporção de colônias positivas em colônias gerais é de: 65,02 ± 3,32 %. Os dados são de três réplicas biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Placas representativas da clonagem plasmida multi-gene em E. coli. Montagem do vetor intermediário para montagem de nível multigênica e seleção vermelha/verde sob(A)luz visível e(B) luz UV. Colônias positivas são colônias verdes e negativas são vermelhas. A proporção de colônias positivas em colônias gerais é de 1,83± 0,15%. Montagem bem sucedida de múltiplas TUs a partir do vetor intermediário e seleção verde/branco(C)sob luz visível e(D)luz UV. Colônias positivas são brancas. A proporção de colônias positivas em colônias gerais é de 93,77 ± 1,65%. Montagem subótimal de plasmídeos multi-genes sob(E)luz visível e(F) luz UV. O número de colônias positivas é insignificante. Os dados são de três réplicas biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Placas representativas de plasmídeos integrativos e replicativos na levedura. Plasmídeos multigósmos replicativos transformados em levedura com (A) FUSão BTS1-ERG20 TU e (B) ERG20 TU. Em cada placa, a levedura do lado esquerdo tem plasmídeos contendo crtE TU, crtYB TU e crtI TU para a produção de β-caroteno e levedura no lado direito tem plasmídeos contendo crtE TU, crtYB (G247A)TU, e CRTI TU para a produção de licopeno. (C) quantificando β-caroteno e licopeno a partir de extrato de levedura com quatro plasmídeos multi-genes usando um espectrômetro UV-vis. A absorvância máxima foi registrada em 450 nm e 470 nm para β-caroteno e licopeno, respectivamente. A quantificação absoluta foi realizada utilizando-se padrõesautênticos (Figura Suplementar S3). A fusão do BTS1-ERG20 leva à produção de ~35 vezes mais alto β-caroteno e ~16,5 vezes mais lycopeno em comparação apenas com ERG20. Placas representativas para a interrupção do lócus ADE2 pela integração de um plasmídeo integrativo multigógio com um gRNA e sem DNA auxiliar(D)e com gRNA e um plasmídeo integrativo multi-gene como DNA auxiliar(E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O kit de clonagem baseado em MoClo desenvolvido por Lee et al. fornece um excelente recurso para montagem rápida de uma a cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene, seja para replicação ou integração no genoma da levedura. O uso deste kit elimina o demorado gargalo de clonagem que existe frequentemente para expressar múltiplos genes na levedura.
Testamos cinco condições diferentes para os ciclos de digestão/ligamento da clonagem golden gate com ligase de DNA T4. Descobrimos que 30 ciclos de digestão a 37 °C por 5 min e ligadura a 16 °C por 5 min seguido de uma etapa final de digestão a 50 °C para 10 min e uma etapa de inativação de proteína a 80 °C para 10 min resultou em 99,5% colônias que estavam potencialmente corretas em uma montagem de 4 peças (Figura Suplementar S1 e Tabela S3). A ligadura a 16 °C garante a atividade de ligadura ótima e a saliência de ressarem. A digestão final a 50 °C impede que os produtos digeridos sejam re-ligadurados. Este ciclo foi seguido para todas as reações de montagem, a menos que especificado de outra forma.
Também encontramos alguns passos críticos que precisam de atenção especial para os melhores resultados. Recomendamos fortemente a montagem de vetores intermediários com a desistência do SFP ANTES de montar unidades de transcrição. Em teoria, todas as sete partes podem ser clonadas no vetor E. coli com o mRFP1, seguidas de triagem vermelha/branca. No entanto, na prática, o mRFP1 desenvolve cores muito lentamente e é desafiador distinguir entre colônias E. coli vermelhas pálidas e pálidas sob luz visível. À medida que o SFPF absorve na faixa UV52,o uso de um UV ou um transilluminator de luz azul facilita a triagem para colônias verdes brilhantes. Além disso, a clonagem de um vetor intermediário permite uma montagem mais fácil das várias combinações de promotores, CDS e terminator, permitindo uma criação de biblioteca combinatória mais fácil, uma vez que uma montagem com quatro partes geralmente resulta em colônias mais positivas do que uma montagem com mais peças. Figura suplementar S2 mostra uma diminuição progressiva na proporção de colônias potencialmente corretas de uma montagem de 6 peças para 8 peças.
As concentrações de todas as partes devem ser medidas meticulosamente para garantir a concentração equimolar de cada parte. Quantificar peças usando um espectrômetro UV-Vis geralmente é suficiente, mas métodos mais sensíveis, como ensaios baseados em fluorescência, podem dar melhores resultados. A falha em quantificar com precisão todas as peças muitas vezes resulta em uma baixa eficiência de montagem. Deve-se selecionar o Altamente eficiente Esp3I e BsaI-HFv2, respectivamente. Observamos que o T4 funciona bem tanto para as saliências no kit quanto para as saliências personalizadas são necessárias para fundir duas partes, o que é consistente com a literatura36,embora o artigo original recomendasse t7 ligase6. Aumentar o número de ciclos pode aumentar o número de colônias potencialmente corretas até certo ponto. Por exemplo, 25 ciclos de digestão e ligadura são suficientes para montar de três a quatro partes, mas 30-35 ciclos dão melhores resultados para mais peças.
A estratégia MolClo é vantajosa sobre os métodos alternativos de montagem em várias partes8,9,10,11,12 porque permite clonagem modular e altamente versátil. No entanto, a principal limitação é o passo de domesticação, uma vez que as partes às vezes têm vários sites BsmBI, BsaI ou NotI. Mudar todas as partes pode ser demorado. Neste caso, pode-se considerar sintetizar o CDS sem esses sites de restrição. No entanto, para promotores e exterminadores, mutar até mesmo um único nucleotídeo pode mudar sua funcionalidade. Portanto, recomenda-se a validação da atividade dessas partes usando um ensaio de repórter39. Outra limitação é que este kit só permite até cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene. Se mais unidades de transcrição forem desejadas, conectores adicionais poderão ser construídos selecionando um conjunto de saliências altamente compatíveis36.
O kit fornece 27 promotores, seis terminadores, sete marcadores de seleção de leveduras e duas origem de leveduras de réplicas. Peças personalizadas, como promotores e terminadores, nativos ou sintéticos, podem ser clonadas no vetor de entrada seguindo este protocolo. O kit moclo de levedura tem sido usado principalmente para superexpressar vias metabólicas multigênicas para produzir produtos químicos de alto valor na levedura. Este protocolo também pode ser usado quando diferentes interruptores para circuitos biológicos são desejados em leveduras. Há também um enorme potencial para aplicar este kit para a investigação de questões biológicas básicas sobre interações proteína-proteína, localização de proteínas e atividades enzimáticas. No geral, este protocolo é extremamente flexível e confiável e pode suportar qualquer clonagem exigente na biologia da levedura.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Research Foundation para a Universidade Estadual de Nova York (Prêmio #: 71272) e pelo Impact Award of University at Buffalo (Prêmio #: 000077).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
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