Summary
Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).
Abstract
Het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon is van cruciaal belang om de fundamentele kennis van virale RNA-synthese te bevorderen die zowel mechanistische ontdekking als testontwikkeling in virologie kan begeleiden. De RNA-sjabloon van niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met negatieve zin, zoals het respiratoire syncytiële virus (RSV), is niet alleen een RNA-molecuul, maar eerder een nucleoproteïne (N) ingekapseld ribonucleoproteïnecomplex. Ondanks het belang van het authentieke RNA-sjabloon, blijft het genereren en assembleren van een dergelijk ribonucleoproteïnecomplex verfijnd en vereist het diepgaande opheldering. De belangrijkste uitdaging is dat de overexpressed RSV N niet specifiek bindt aan cellulaire RNA's om willekeurige nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) te vormen. Hier hebben we een protocol opgesteld om RNA-vrije N (N0) eerst te verkrijgen door N samen met een chaperonnefofoproteïne (P) uit te drukken en vervolgens N0 met RNA-oligo's samen te stellen met de RSV-specifieke RNA-sequentie om virusspecifieke nucleocapsiden (NCs) te verkrijgen. Dit protocol laat zien hoe de moeilijkheid bij de voorbereiding van dit traditioneel uitdagende virale ribonucleoproteïnecomplex kan worden overwonnen.
Introduction
Niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met een negatief gevoel omvatten veel significante menselijke pathogenen, zoals rabiës, ebola en respiratoir syncytieel virus (RSV)1,2. RSV is de belangrijkste oorzaak van aandoeningen van de luchtwegen zoals bronchiolitis en longontsteking bij jonge kinderen en oudere volwassenen wereldwijd3. Momenteel zijn er geen effectieve vaccins of antivirale therapieën beschikbaar om RSV4te voorkomen of te behandelen. Als onderdeel van de levenscyclus dient het RSV-genoom als sjabloon voor replicatie door het RSV RNA-afhankelijke RNA-polymerase om een antigenoom te produceren, dat op zijn beurt fungeert als de sjabloon om een nageslachtgenoom te genereren. Zowel genoom als antigenoom RNA's worden volledig ingekapseld door het nucleoproteïne (N) om de nucleocapsiden (NCs) te vormen3. Omdat de NCs dienen als sjablonen voor zowel replicatie als transcriptie door de RSV-polymerase, is een goede NC-assemblage cruciaal voor de polymerase om toegang te krijgen tot de sjablonen voorRNA-synthese 5. Interessant is dat op basis van de structurele analyses van de NNS virale polymerases wordt verondersteld dat verschillende N-eiwitten zich tijdelijk distantiëren van de NCs om de toegang tot het polymerase mogelijk te maken en na de RNA-synthese6, 7,8,9,10,11,12toegang te geven tot RNA .
Momenteel is de RSV RNA-polymerisatietest vastgesteld met behulp van gezuiverde RSV-polymerase op korte naakte RNA-sjablonen13,14. De activiteiten van de RSV-polymerase bereiken echter niet optimaal, zoals waargenomen in de niet-processieve en abortieve producten die door de RSV-polymerase worden gegenereerd bij het gebruik van naakte RNA-sjablonen. Het ontbreken van NC met virusspecifiek RNA is een primaire barrière voor het verdere mechanistische begrip van de RSV RNA-synthese. Daarom wordt het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon een essentiële noodzaak om de fundamentele kennis van RSV RNA-synthese te bevorderen. De bekende structuren van de nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) van RSV en andere NNS RNA-virussen onthullen dat de RNA 's in de NCLPs ofwel willekeurige cellulaire RNA 's zijn ofwel gemiddelde virale genomische RNA 's15,16,17,18,19. Samen is de belangrijkste hindernis dat N niet specifiek aan cellulaire RNA's bindt om NCLPs te vormen wanneer N wordt overexpressed in de gastheercellen.
Om deze hindernis te overwinnen, hebben we eerst een protocol opgesteld om RNA-vrij (N0) te verkrijgen en N0 met authentiek viraal genomisch RNA in NCLPs20te assembleren. Het principe van dit protocol is het verkrijgen van een grote hoeveelheid recombinante RNA-vrije N (N0) door N samen met een chaperonne uit te drukken, het N-terminale domein van RSV-fosfoproteïne (PNTD). De gezuiverde N0P kan worden gestimuleerd en geassembleerd in NCLPs door RSV-specifieke RNA-oligo's toe te voegen, en tijdens het assemblageproces wordt de chaperonne PNTD verplaatst bij de toevoeging van RNA-oligo's.
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren en assembleren van RSV RNA-specifieke NCs. In dit protocol beschrijven we het moleculair klonen, eiwitpreparaat, in vitro assemblage en validatie van de complexe assemblage. We benadrukken de kloonstrategie om bi-cistronic constructies te genereren voor eiwitcoexpressie voor moleculair klonen. Voor eiwitbereiding beschrijven we de procedures van celkweek, eiwitextractie en de zuivering van het eiwitcomplex. Vervolgens bespreken we de methode voor in vitro assemblage van de RSV RNA-specifieke NC's. Ten slotte gebruiken we grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en negatieve vlekelektronenmicroscopie (EM) om de geassembleerde NCLPs te karakteriseren en te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Moleculair klonen
OPMERKING: Ligase Independent Cloning (LIC) werd gebruikt om een RSV bi-cistronic coexpressie constructie plasmide te maken. LIC is een methode ontwikkeld in het begin van de jaren 1990, die de 3'-5' Exo-activiteit van de T4 DNA-polymerase gebruikt om uitsteeksels te creëren met complementariteit tussen de vector en de DNA-insert21,22. De constructies zijn gemaakt met behulp van het 2BT-10 vector DNA, dat bestaat uit een 10x Zijn tag op de N-terminal van het Open Reading Frame (ORF) (Figuur 1).
- Voer linearisatie van LIC-vectoren uit met behulp van SSPI-vergisting.
- Combineer 10 μL SSPI 10X buffer, 4 μL SSPI enzym bij een concentratie van 5 U/μL, het equivalente volume van 5 μg vector miniprep DNA en steriele ddH2O tot 100 μL.
- Incubeer de digest gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Voer de digest uit op een 1,0% agarose gel voor de extractie van vector DNA.
- Gebruik een gelextractiekit om extractie en zuivering uit te voeren. Schors het uiteindelijke volume vector-DNA in 30 μL ddH2O en bewaar het bij -20 °C.
- Bereid de DNA-inserts voor op N1-391 en P1-126 met behulp van de N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer en P1-126 Reverse Primer (Tabel 1).
OPMERKING: Er is voldoende overlap met de lineaire vector om een smelttemperatuur tussen 55 °C en 60 °C te garanderen. Voor de omgekeerde primer is er om dezelfde reden voldoende overlap met de omgekeerde complementaire streng van de lineaire vector.- Voer pcr-versterking van de DNA-insert uit met behulp van de voorwaarden in tabel 2 en tabel 3.
- Haal de versterkte DNA-insert eruit. Voer de PCR-producten uit de vorige stap uit op een 1,0% agarosegel en extract en zuiver de banden vervolgens door gelextractie. Schors het uiteindelijke volume geëxtraheerd DNA in 15 μL ddH2O.
- T4 DNA-polymerasebehandeling van vector- en insert-DNA (tabel 4).
OPMERKING: De behandeling moet afzonderlijk worden uitgevoerd voor het vector-DNA en het insert-DNA.- Incubeer het mengsel gedurende 40 minuten op kamertemperatuur. Activeer vervolgens de polymerase gedurende 20 minuten bij 75 °C. Bewaar het reactiemengsel bij -20 °C.
- Gloei de LIC-vector en de insertvector.
- Stel een negatieve controle in met 2 μL LIC vector DNA en 2 μL steriele ddH2O.
- Combineer 2 μL insert DNA en 2 μL LIC vector DNA van de vorige T4 DNA polymerase reacties in een 0,2 ml buis.
- Voer de gloeireactie gedurende 10 minuten uit op kamertemperatuur.
- Doof de reactie met 1,3 μL EDTA bij een concentratie van 25 mM.
- Zet de reactie om in 100 μL E. coli Top10 competente cellen en plaats ze op een ampicilline selectieplaat23,24.
- Identificeer de positieve constructies.
- Bereid de plasmide miniprep oplossing. Dit kan door kolonieplukken en inenting in LB-media. Meestal zijn 3 kolonies voldoende.
- Incubeer het mengsel 's nachts bij 37 °C.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten op 4.560 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de pellets in 250 μL P1 buffer en bereid plasmide minipreps met behulp van een spin miniprep kit.
- Voer een spijsverteringsanalyse uit van het miniprepproduct met behulp van AseI of andere restrictie-enzymen.
- Laad monsters op 0,8% agarose gel en voer de verteerde plasmide uit. Analyseer de gel onder een UV-lamp.
- Gebruik een sequencingservice om de volgorde van het positieve product te valideren.
- Verkrijg de coexpressie DNA insert.
- Voer PCR uit om N1-391 en P1-126 te verkrijgen met behulp van de eerder geconstrueerde 2BT-10 N1-391 en 2BT-10 P1-126 als sjablonen.
- Voer de1e PCR uit om N1-391 te verkrijgen van de 2BT-10 N1-391 constructie met behulp van de PCR-omstandigheden in tabel 2 en tabel 3 met de N1-391 Forward primer en Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Voer de2e PCR uit om P1-126 te verkrijgen van de 2BT-10 P1-126 constructie met behulp van de Forward primer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́en de P1-126 Reverse primer (gebruik de PCR-omstandigheden in tabel 2 en tabel 3). - Voer ten slotte overlapping PCR uit op de gemengde producten van de vorige 2 PCR-reacties om N1-391 en P1-126samen te voegen. Gebruik de N1-391 Forward primer en P1-126 Reverse primer. Gebruik de PCR-voorwaarden in tabel 5 en tabel 6.
- Voeg de vector en de DNA-insert samen.
- Behandel het overlappende PCR-product met T4 DNA-polymerase volgens het protocol in stap 1.3.
- Gloei het LIC-vector- en PCR-product volgens het protocol in stap 1.4.
- Identificeer de positieve constructies volgens het protocol in stap 1.5.
2. Eiwitexpressie en -zuivering
OPMERKING: Gebruik E. coli voor de bi-cistronic constructie van de coexpressie van zowel N als P. Kweek de cellen bij 37 °C, maar voer de expressie 's nachts uit bij een lagere temperatuur (16 °C). Zuiver de eiwitcomplexen door een combinatie van kobaltkolom, ionenuitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2).
- Gebruik de E. coli BL21(DE3) stam voor eiwitproductie. Kweek 4 L celculturen bij 37 °C in LB (Luria Broth) medium tot OD600 0,6 bereikt.
- Verlaag de temperatuur tot 16 °C. Een uur later, induceer de expressie met 0,5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) 's nachts.
- Centrifugeer de cellen gedurende 25 minuten op 4.104 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celkorrels in 200 ml lysisbuffer A (50 ml natriumfosfaat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 ml imidazol, 10% glycerol en 0,2% NP40). Gebruik 50 ml lysisbuffer om de celkorrels van 1 L celkweek opnieuw te gebruiken.
- Lyse de cellen door sonicatie gedurende 15 minuten, 3 seconden aan en 3 seconden uit. Centrifugeer vervolgens cellen op 37.888 x g gedurende 40 minuten.
OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken door de cellen in te vriezen voordat ze soniceren in een vriezer van -80 °C. - Laad het supernatant in een kobaltzwaartekrachtkolom (diameter x lengte: 2,5 cm x 10 cm) met ~10 ml kralen voorgeballibreerd met 5-10 kolomvolumes (CV) lysisbuffer.
- Was de kolom met 5 CV buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glycerol en 5 mM imidazol) en 5 CV buffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glycerol en 5 mM imidazol).
- Elute het eiwit uit de kralen met behulp van 2 CV van buffer D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, en 250 mM imidazol).
- Verdun het geëlueerde eiwit 5x met QA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerol) voor de Q-kolom.
- Was de 5 ml Q-kolom met QA-buffer om de kolom te equilibreren en laad het verdunde monster vervolgens in de Q-kolom met behulp van de peristaltische pomp (bijv. Konijn).
- Laad de Q-kolom in de HPLC-machine samen met QA-buffer en QB-buffer (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glycerol). Stel het debiet in op 1 ml/min.
- Voer het programma "pompwas" uit om de machine te wassen met QB-buffer gevolgd door QA-buffer (1-2 CV's/elk). Stel de systeemstroom in op 3 ml/min.
- Stel de UV1 in op 280 nm en UV2 op 260 nm. Gebruik een 96 diep-goed plaat om de fracties te verzamelen.
- Elute-eiwitten met behulp van een stapsgewijze gradiënt van elutiemiddel (QB Buffer) die 3-4 CV van elke concentratie toepast, waardoor het percentage elke keer met 5% toeneemt vanaf 0% QB. N0P eiwitcomplex komt uit bij 15% QB Buffer.
- Zodra al het eiwit is geëuteerd, wast u de kolom met 100% QB Buffer (2 CV).
- Isoleer het eiwit door gelfiltratie Superdex 200 Verhoog de kolom 10/300 GL (diameter x lengte: 1,0 cm x 30 cm) en equilibreer met buffer E (20 mM HEPES pH 7,4 en 200 mM NaCl).
- Analyseer eiwithoudende breuken door SDS-PAGE.
3. In vitro assemblage van de virusspecifieke NC
OPMERKING: De in vitro assemblage van de RSV-specifieke NC (N:RNA) werd uitgevoerd door het voorbereide N0P-complex te incuberen met RNA-oligo's. Vervolgens werd SEC-chromatografie gebruikt om het assemblagecomplex te scheiden van het N0P en overtollig RNA (figuur 2).
- Meng en incubeer het gezuiverde N0P complex met RNA oligo met de moleculaire verhouding van 1:1.5 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, meestal is 1 ml van het eiwit N0P met een concentratie van 1 mg/ml voldoende voor de volgende stap. Stel het controlemonster in, dat slechts dezelfde hoeveelheid N0P-eiwit bevat.
- Vóór het equilibreren van de gelfiltratie Superdex 200 Verhoog de kolom 10/300 GL met de buffer E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten met 21.130 x g, verwijder eventuele neerslag en laad het supernatant in de SEC-kolom.
- Vergelijk de SEC-chromatografiebeelden van het N:RNA-assemblagemonster en het N0P-controlemonster, combineer de A260/A280-verhouding om te bepalen welke pieken de geassembleerde N-RNA, N0P en vrije RNA zijn.
- Verzamel de piekfracties, voer de SDS-PAGE gel uit of maak rasters.
- Verzamel voor het N-RNA-complex alle fracties van de N-RNA-piek, doe de RNA-extractie en voer de Ureum-PAGE-gel uit om de lengte van specifiek RNA te controleren, wat hetzelfde is als gemengd en geïncubeerd bij de eerste stap.
4. Negatieve vlekkenroosters maken
OPMERKING: Negatieve vlek elektronenmicroscopie (EM) is een methode waarbij de moleculen worden geadsorbeerd tot een koolstoffilm en vervolgens worden ingebed in een laag zware metaalatomen. Negatieve vlek EM produceert een hoog beeldcontrast, waardoor het gemakkelijk is om de deeltjes te zien en computationeel uit te lijnen. Een ander voordeel is dat de adsorptie van de deeltjes naar een koolstoffilm er meestal toe leidt dat de moleculen zich met weinig voorkeursoriëntaties aan het raster hechten. Wanneer de moleculen zich in een vergelijkbare oriëntatie bevinden, is het gemakkelijk om ze te scheiden in structureel verschillende klassen. Negatieve vlek EM is dus de geschikte techniek om monstervoorbereiding25,26 ( figuur3) te begeleiden.
- Magnetron of verwarm 5 ml ddH2O in een klein glazen bekerglas met behulp van een wolfraamkachel totdat het kookt.
- Weeg 37,5 mg uranyl formate en voeg toe aan 5 ml verwarmde ddH2O om een 0,75% uranyl formate kleuroplossing te maken. Roer onder een aluminiumfolie bedekt bekerglas om te beschermen tegen licht.
- Voeg 4 μL van 10 M NaOH toe aan de kleuringsoplossing en blijf 15 minuten roeren, beschermd tegen het licht.
- Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 mm in een reageerbuis.
- Gebruik gloeiontlading om de continue met koolstof bedekte EM-roosters hydrofiel te maken27.
OPMERKING: De roosters worden geplaatst in een kamer die is aangesloten op een voeding. Wanneer hoogspanning wordt toegepast, ioniseert het gas in de kamer en storten de negatief geladen ionen zich af op de koolstofnetten om ze hydrofiel te maken. - Knip en vouw een parafilmstrip. Pipet 2 druppels van 40 μL van de buffer aan de ene kant van de parafilm en pipet nog eens 2 druppels van 40 μL kleuroplossing naar de andere kant.
- Om de EM-koolstofroosters te maken, breng je 3 μL eiwitmonster aan gedurende 1 minuut.
- Vlek de roosters tegen een vloeipapier.
OPMERKING: De roosters worden 2x gewassen met buffer en 1x met de 0,75% uranyl formate kleuroplossing die na elke stap is gevlekt. - Houd het rasteroppervlak in de tweede druppel van 0,75% uranylformaat kleuroplossing gedurende 30 seconden.
- Vlek het rooster tegen een vloeipapier om overtollige vlekkenoplossing te verwijderen en het rooster aan de lucht te laten drogen.
- Sla de rasters op in het rastervak voordat u ze in beeld opslaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zuivering van RNA-vrij N0P eiwit
Met dit protocol kan een grootschalig oplosbaar heterodiameer RSV N0P complex worden verkregen. De volledige lengte van N- en N-terminaal deel van P-eiwitten werd samen met 10X His-Tag op het N-eiwit in E. coliuitgedrukt . N0P werd gezuiverd met behulp van een kobaltkolom, ionenuitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. N0P bevat zowel de volledige N- als N-terminal P, maar bevatte geen cellulair RNA op basis van de UV-absorptie A260/A280 ratio20 (figuur 4).
Assemblage van N-RNA en controle met negatieve vlek
Vervolgens hebben we aangetoond dat de gezuiverde N0P kan worden gestimuleerd en geassembleerd tot Nuceloplasmid-achtige deeltjes (NCLPs) door te incuberen met specifieke RNA-oligo's. De NCLPs werden geassembleerd door de N0P te incuberen met RNA oligo's met de verhouding van 1:1,5 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en vervolgens door de gelfiltratiekolom te lopen. Wanneer het N:RNA-complex zich vormt, toont het drie pieken: de1e piek is N: RNA, de2e piek is N0P en de 3e piek is overtollige vrije RNA. De hoogste fractie van de N:RNA-piek creëert de negatieve vlekrasters voor controle met EM20 (figuur 5).
Figuur 1. De illustratie van de plasmideconstructies. een. De constructie van de RSV N1-391; B. De constructie van de RSV P1-126; C. De bi-cistronic constructie voor de coexpressie van N1-391 en P1-126. Het eerste gen RSV N1-391, het tweede gen RSV P1-126, het antibioticaresistente gen (AmpR), en de promotors worden respectievelijk gemarkeerd in gele, cyaan- roze en oranje dozen. Samengevat worden de geninzetstukken van de RSV N1-391 en de RSV P1-126 afzonderlijk geconstrueerd en geassembleerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Het stroomschema van de zuivering van het eiwitcomplex N1-391P1-126. Het schetst de inenting en grootschalige groei van de E. coli celkweek en het oogsten van de cel door centrifugeren. Gevolgd door cellysis worden de eiwitmonsters gezuiverd door de affiniteitschromatografie (d.w.z. Co2+-kolom), ionenuitwisselingschromatografie (d.w.z. Q-kolom) en gelfiltratiegrootte-uitsluiting (SEC)-chromatografie. De eiwitmonsters worden verder geanalyseerd door de SDS-PAGE gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Voorbereiding van em-rasters met negatieve vlekken voor beeldvorming. A. Glow ontlaadt de roosters. B. De procedure voor negatieve kleurroosters wordt weergegeven. Het pincet wordt gebruikt om een raster op te pikken, gevolgd door het aanbrengen van het eiwitmonster gedurende 1 minuut. De roosters zijn bevlekt met vloeipapier. Het rooster wordt twee keer gewassen met buffer en twee keer met de 0,75% uranyl formate kleuroplossing. De roosters worden gedurende 30 seconden in de tweede kleuringsoplossingsdruppel gehouden. De roosters worden na elke wasbeurt gevlekt en na de laatste blotting aan de lucht gedroogd. C. De rasters worden opgeslagen in het rastervak voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Representatieve resultaten van de copurificatie van het N1-391P1-126 complex. een. Het SEC-profiel van N1-391P1-126. B. Het SEC profiel van de assemblage N1-391P1-126 met RNA. C. De SDS-PAGE gel toont het N-eiwit alleen voor het N-RNA-complex en de banden voor zowel N- als P-eiwitten van het N1-391P1-126-complex. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Representatieve beelden van N-RNA. A en B zijn representatieve negatieve vlek EM-beelden van N-RNA uit de N1-391-RNA piek in figuur 4. De N-RNA-complexen worden gekleurd volgens de procedure beschreven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Inleidingen | |||
| N1-391 Voorwaarts | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Achteruit | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Voorwaarts | TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Achteruit | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3" | ||
Tabel 1. Primer sequenties.
| PCR-versterking van DNA-insert | |
| 15 μL | 10x Pfu polymerase reactiebuffer |
| 3 μL | Voorwaartse primer (100 μM concentratie) |
| 3 μL | Omgekeerde primer (100 μM concentratie) |
| 15 μL | dNTP mix bij 2,5 mM concentratie |
| 6 μL | Plasmide DNA bevat het gen van N of P (100ng/μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymerase bij 2,5U/μL |
| Te vullen volume tot 150 μL | Steriele ddH2O |
Tabel 2. PCR-versterking van DNA-insertreagentia.
| PCR amplicatie van DNA insert | |||
| stap | Tijd | temperatuur | Cycli |
| Denaturatie | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| Denaturatie | 45 sec. | 95 ºC | 30 |
| Annealing | 30 seconden. | 62 ºC | |
| Uitbreiding* | 90 seconden. | 72 ºC | |
| extensie | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| houden | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Het mengsel van 150 μL kan worden uitgevoerd in drie afzonderlijke PCR-reacties (3 x 50 μL). | |||
| *Voor de Pfu DNA polymerase is 1 kb/min de aanbevolen snelheid voor de extensiefase. Hier zijn zowel de lengtes van het N1-391 gen als het P1-126 gen korter dan 1,5 Kb. | |||
| Zo werd 90 seconden gebruikt voor de extensiestap. | |||
Tabel 3. PCR versterking van DNA insert thermocycling programma.
| T4 DNA polymerase behandeling | |
| 10 x buffer | 2 μL |
| Vector/Insert DNA (0,1 pmol vector of 0,2 pmol insert) | 5 μL |
| dNTP* bij 25 mM | 2 μL |
| DTT op 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA polymerase (LIC gekwalificeerd) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steriele ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP werd gebruikt voor de vector en dCTP werd gebruikt voor het insert DNA. | |
Tabel 4. T4 DNA polymerase behandeling.
| Overlap PCR | |
| 15 μL | 10 X Pfu polymerase reactiebuffer |
| 3 μL | Voorwaartse primer (100 μM) |
| 3 μL | Omgekeerde primer (100 μM) |
| 15 μL | dNTP Mix (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA van1e ronde PCR die het gen N1-391 (100 ng/μL) bevatten |
| 3 μL | DNA van1e ronde PCR die het gen P1-126 (100 ng/μL) bevatten |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-polymerase (2,5 U/μL) |
| Te vullen volume tot 150 μL | Steriele ddH2O |
Tabel 5. Overlap PCR-reagentia.
| Overlap PCR | |||
| stap | Tijd | temperatuur | Cycli |
| Denaturatie | 4 min. | 95 °C | 1 |
| Denaturatie | 45 sec. | 95 °C | 30 |
| Annealing | 30 seconden. | 62 °C | |
| Uitbreiding* | 2 min. | 72 °C | |
| extensie | 10 min. | 72 °C | 1 |
| houden | ∞ | 4 °C | 1 |
| Het mengsel van 150 μL kan worden uitgevoerd in drie afzonderlijke PCR-reacties (3 x 50 μL). | |||
| *Voor de Pfu DNA polymerase is 1 kb/min de aanbevolen snelheid voor de extensiefase. Hier is de totale lengte van het gen N1-391 en P1-126 korter dan 2,0 Kb. Zo werden 2 minuten gebruikt voor de uitbreidingsstap. | |||
Tabel 6. Overlap PCR thermocycling programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bekende nucleocapsid-achtige deeltjesstructuren (NCLP) van de niet-gesegmenteerde RNA-virussen met negatieve zin (NNS) tonen aan dat de geassembleerde NCLPs de complexe N met host cellulaire RNA 's zijn wanneer ze overexpressie vertonen in bacteriële of eukaryotische expressiesystemen15,16,17,18,19. Eerdere studies hebben geprobeerd om de RNA-vrije N te krijgen met een verscheidenheid aan methoden, zoals de RNase A-spijsvertering, het wassen van zout hoog of het aanpassen van verschillende pH-buffers om de niet-specifieke cellulaire RNA's28,29te verwijderen . Geen van de bovenstaande methoden kan echter met succes worden gebruikt voor de assemblage van de virusspecifieke NCs. Om de RNA-vrije RSV N te verkrijgen, hebben we ook een combinatie van methoden geprobeerd, waaronder RNase A-vergisting, wassen met hoog zout (1,5 M NaCl), het aanpassen van de bufferpH van pH 5,0 tot pH 9,0, eiwitdenaturatie en renaturatie. Na vele mislukte proeven konden we met de bovenstaande methoden nog steeds geen RNA-vrije N krijgen. We zullen kort ingaan op de pogingen en mogelijke redenen.
Een methode om RNA-vrije N te verkrijgen, is het verteren van host cellulair RNA in geassembleerde NCLPs met RNase A. In VSV, de incubatie van de gezuiverde NCLP met RNase A bij een eindconcentratie van 1mg/ml bij 37 °C gedurende 1 uur volledig verwijderd RNA uit de NC28. Gezuiverde lege oligomere N werd vervolgens geïncubeerd met poly-A (250-nt of langer) in een molaire verhouding van 1:5 in aanwezigheid van RNase-remmers. Analyse van het RNA geïsoleerd van gereconstitueerde N:poly-A toonde aan dat het RNA ongeveer 90 nt lang was. Dit suggereerde dat het RNA buiten het nucleoproteïne gevoelig is voor aspecifieke spijsvertering door de besmette RNase A van de vorige stap. De strategie van RNase A-vergisting om RNA te verwijderen was niet succesvol bij toepassing op RSV. Dit kan om twee redenen zijn. Eerst zal verontreinigde RNase A het RSV-specifieke RNA verteren, dat vervolgens zal worden geïncubeerd en geassembleerd met N. Ten tweede is de efficiëntie van de RNase A-spijsvertering veel lager in RSV. Dit komt omdat de RNA's zich anders assembleren in verschillende NNS-virussen. De bekende kristalstructuren van N:RNA laten zien dat RNA zich buiten de NC bindt in VSV, maar binnen de NC in RSV30,31. De configuratie van RNA-binding naar binnen van de NC kan leiden tot een laag rendement voor RNase A om toegang te krijgen tot en te verteren.
Een andere methode om RNA-vrije N te krijgen, is door de afsnijdingen te maken die zowel het N-eindmotief (N-arm) als het C-terminale motief (C-arm) van N snijden. Deze afgeknotte RNA-vrije N kan echter niet worden gebruikt om met RNA in een stabiele NC te assembleren, omdat de N-arm van N in zijn naburige subeenheden wordt gevouwen door interactie met het C-terminaldomein (CTD) van de precedent N-subeenheid. De verlengde C-arm bevindt zich op de CTD van de volgende N-subeenheid31.
Een extra methode om RNA-vrije N te krijgen is het bereiden van mutant N. Het resultaat verkregen door Galloux et al. toonde bijvoorbeeld aan dat RSV RNA-vrij N0P-complex kon worden verkregen door coexpressie van een K170A/R185A dubbele N-mutant met het N-eindpunt van P in bacteriën32. Het heeft echter twee potentiële problemen voor verdere structurele kenmerken. Een probleem is de lage stabiliteit van dit mutantencomplex bij hoge concentraties. Het andere probleem is dat het mutantencomplex het RNA-bindingsvermogen verloor, dat niet kan worden gebruikt in de volgende stap van assemblage.
Ondanks de enorme uitdagingen hebben we het protocol opgesteld en geoptimaliseerd om virusspecifieke NCs te verkrijgen met behulp van de coexpressie van N met een chaperonne P. Onlangs is een andere succesvolle methode om een chimerische fusieconstructiecodering te maken voor P1-50-TEV-N1-405-8xHis voor MeV33,34. N0P kan worden verkregen na het TEV protease decolleté. De zuiverheid van N0P hangt af van de efficiëntie van TEV-kloven, die de chimerische fusie tussen N- en P-eiwit snijden.
In plaats van de chimerische fusiemethode te gebruiken, ontwierpen we een bi-cistronische coexpressieconstructie. In het bijzonder zijn de coexpressieconstructies van het N0P-complex ontworpen en ontworpen in twee open leesframes, bestaande uit de volledige lengte van N (1-391) met een 10x His-tag op N-terminal in de eerste ORF, en de N-terminal peptiden (1-126) van P in de tweede ORF20. Kortom, de algemene procedure van de N0P-zuivering is om zijn gelabelde N0P- en N-RNA te zuiveren van cellulaire lysismonsters met kobaltparels, het niet-specifieke RNA- en N:cellular RNA-complex met Q-kolom te verwijderen en een zuiver N0P-complex te krijgen met de SEC-kolom. In de SEC-stap kan de verhouding van A260/A280 worden bewaakt en dubbel gecontroleerd met RNA-extractie uit de N0P piekfracties.
Gezamenlijk zijn in dit protocol de meest kritische stappen de strategie om de constructie van de coexpressie van het N0P-complex te ontwerpen en een serieaffiniteit en ionenuitwisselingskolom te gebruiken om het RNA-vrije N0P-complex te scheiden van de andere N-cellulaire RNA-complexen. De efficiëntie van de coexpressiestrategie om N0P-complex te krijgen is relatief laag; ongeveer 50% N-eiwit is nog steeds N-cellulair RNA-complex. Het protocol kan ook worden toegepast voor het verkrijgen van RNA gratis N0P en assemblage met specifieke RNA met N om N: RNA complex van andere NNS virussen te krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De onderzoeksprogramma's in het Liang-laboratorium in Emory worden ondersteund door het Us National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) onder het toekenningsnummer R01GM130950 en het Research Start-Up Fund van emory University School of Medicine. De auteur erkent de leden van het Liang-laboratorium voor nuttige ondersteuning en kritische discussie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
