Summary
Для углубленного механистического анализа синтеза РНК респираторно-синцитиального вируса (RSV) мы сообщаем протокол использования шаперон-фосфопротеина (P) для коэкспрессии свободного от РНК нуклеопротеина (N0)для последующей сборки in vitro вирус-специфических нуклеокапсидов (НК).
Abstract
Использование аутентичного шаблона РНК имеет решающее значение для продвижения фундаментальных знаний о синтезе вирусной РНК, которые могут направлять как механистическое открытие, так и разработку анализов в вирусологии. РНК-шаблон несегментированных РНК-вирусов с отрицательным смыслом (NNS), таких как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), представляет собой не только молекулу РНК, а скорее инкапсидированный комплекс рибонуклеопротеинов нуклеопротеинов (N). Несмотря на важность аутентичного шаблона РНК, генерация и сборка такого рибонуклеопротеинового комплекса остаются сложными и требуют глубокого выяснения. Основная проблема заключается в том, что сверхэкспрессированный RSV N связывается не зреть с клеточными РНК с образованием случайных нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP). Здесь мы установили протокол для полученияN(N0)без РНК сначала путем совместной экспрессии N с шапероном фосфопротеином (P), затем сборки N0 с олигосами РНК с RSV-специфической последовательностью РНК для получения вирус-специфических нуклеокапсидов (НК). Этот протокол показывает, как преодолеть трудности в приготовлении этого традиционно сложного вирусного рибонуклеопротеинового комплекса.
Introduction
Несегментированные РНК-вирусы отрицательного смысла (NNS) включают в себя многие значимые патогены человека, такие как бешенство, Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV)1,2. РСВ является основной причиной респираторных заболеваний, таких как бронхиолит и пневмония у маленьких детей и пожилых людей во всем мире3. В настоящее время нет эффективных вакцин или противовирусных препаратов для профилактики или лечения RSV4. Как часть жизненного цикла, геном RSV служит шаблоном для репликации RSV-РНК-зависимой РНК-полимеразой для получения антигенома, который, в свою очередь, действует как шаблон для генерации генома потомства. Как геномные, так и антигеномные РНК полностью инкапсированы нуклеопротеином (N) с образованием нуклеокапсидов(НК) 3. Поскольку НК служат шаблонами как для репликации, так и для транскрипции полимеразой RSV, правильная сборка NC имеет решающее значение для полимеразы, чтобы получить доступ к шаблонам синтеза РНК5. Интересно, что на основе структурного анализа вирусных полимераз NNS предполагается, что несколько N-белков временно диссоциируют от НК, чтобы обеспечить доступ полимеразы и повторно привязываться к РНК после синтеза РНК6,7,8,9,10,11,12.
В настоящее время установлен анализ полимеризации РНК РСВ с использованием очищенной РСВ-полимеразы на коротких голых РНК-шаблонах13,14. Однако активность РСВ-полимеразы не достигает оптимального, как это наблюдается в необрабатывающих и абортивных продуктах, образующихся RSV-полимеразой при использовании голых шаблонов РНК. Отсутствие NC с вирус-специфической РНК является основным барьером для дальнейшего механистического понимания синтеза РНК RSV. Поэтому использование аутентичного шаблона РНК становится критической необходимостью для продвижения фундаментальных знаний о синтезе РНК RSV. Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) из RSV и других РНК-вирусов NNS показывают, что РНК в NCLP являются либо случайными клеточными РНК, либо средними вирусными геномными РНК15,16,17,18,19. В совокупности основное препятствие заключается в том, что N связывается не специфически с клеточными РНК, образуя NCLP, когда N чрезмерно экспрессируется в клетках-хозяевах.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы установили протокол для получения без РНК (N0)и сборки N0 с подлинной вирусной геномной РНК в NCLP20. Принцип этого протокола заключается в получении большого количества рекомбинантного РНК-свободного N(N0)путем совместной экспрессии N с шапероном, N-концевым доменом RSV фосфопротеина (PNTD). Очищенный N 0 P можетбытьстимулирован и собран в NCLP путем добавления RSV-специфических олигов РНК, и во время процесса сборки шаперон PNTD смещается при добавлении ОлигоС РНК.
Здесь мы подробно описываем протокол для генерации и сборки РНК-специфических для RSV НК. В этом протоколе мы описываем молекулярное клонирование, подготовку белка, сборку in vitro и валидацию сложной сборки. Выделена стратегия клонирования для создания бицистронных конструкций для коэкспрессии белка для молекулярного клонирования. Для приготовления белка мы описываем процедуры клеточной культуры, экстракции белка и очистки белкового комплекса. Затем мы обсудим метод сборки in vitro РНК-специфических НК RSV. Наконец, мы используем хроматографию исключения размеров (SEC) и электронную микроскопию с отрицательным пятном (EM) для характеристики и визуализации собранных NCLP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Молекулярное клонирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Независимое клонирование лигазы (LIC) использовалось для создания плазмиды бицистронной коэкспрессии RSV. LIC - это метод, разработанный в начале 1990-х годов, который использует активность 3'-5' Экзо ДНК-полимеразы Т4 для создания свесов с комплементарностью между вектором и днк-вставкой21,22. Конструкции были сделаны с использованием векторной ДНК 2BT-10, которая состоит из 10-кратной метки His на N-терминале open reading Frame (ORF)(рисунок 1).
- Выполнение линеаризации векторов LIC с использованием СБРАЖИвания SSPI.
- Комбинируют 10 мкл буфера SSPI 10X, 4 мкл фермента SSPI в концентрации 5 Ед/мкл, эквивалентный объему 5 мкг векторной минипрепной ДНК и стерильный ddHот 2O до 100 мкл.
- Инкубировать перевар в течение 3 часов при 37 °C.
- Запустите дайджест на 1,0% агарозном гелевом для экстракции векторной ДНК.
- Используйте набор для экстракции геля для экстракции и очистки. Приостановить конечный объем векторной ДНК в 30 мкл ddH2O и сохранить его при -20 °C.
- Подготовьте вставки ДНК для N1-391 и P1-126 с использованием N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer и P1-126 Reverse Primer(таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует достаточное перекрытие с линеаризованным вектором для обеспечения температуры плавления от 55 °C до 60 °C. Для обратной грунтовки имеется достаточное перекрытие с обратной комплементарной нитью линеаризированного вектора по той же причине.- Выполняют ПЦР-амплификацию ДНК-вставки с использованием условий, приведенных в таблице 2 и таблице 3.
- Извлеките амплифицированную днк-вставку. Запустите продукты ПЦР с предыдущего этапа на 1,0% агарозном гелевом, затем извлеките и очистите полосы путем экстракции геля. Приостановить конечный объем экстрагированной ДНК в 15 мкл ddH2O.
- Т4 ДНК-полимеразная обработка векторной и вставной ДНК(табл. 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение должно проводиться отдельно для векторной ДНК и вставленной ДНК.- Инкубировать смесь в течение 40 минут при комнатной температуре. Затем нагревают-инактивируют полимеразу при 75 °C в течение 20 минут. Хранить реакционную смесь при -20 °C.
- Отжиг вектора LIC и вектора вставки.
- Установите отрицательный контроль с 2 мкл векторной ДНК LIC и 2 мкл стерильного ddH2O.
- Объедините 2 мкл вставной ДНК и 2 мкл векторной ДНК LIC из предыдущих ДНК-полимеразных реакций Т4 в пробирке 0,2 мл.
- Выполните реакцию отжига при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Утвенить реакцию 1,3 мкл ЭДТА в концентрации 25 мМ.
- Преобразуйте реакцию в 100 мкл E. coli Top10 компетентных клеток и нарежьте их на ампициллиновую селекционную пластину23,24.
- Определите позитивные конструкции.
- Приготовьте раствор плазмидного минипрепа. Это может быть сделано путем сбора колоний и прививки в среде LB. Обычно достаточно 3 колоний.
- Инкубировать смесь в течение ночи при 37 °C.
- Центрифугировать смесь при 4,560 х г в течение 10 минут и выбросить супернатант.
- Повторно суспендировать гранулы в 250 мкл буфера P1 и приготовить плазмидные минипрепы с помощью комплекта для отжима минипрепа.
- Проведите анализ пищеварения продукта miniprep с использованием AseI или других ферментов рестрикции.
- Загрузите образцы на 0,8% агарозного геля и запустите переваренные плазмиды. Проанализируйте гель под УФ-лампой.
- Используйте службу виртуализации для проверки последовательности положительного продукта.
- Получите коэкспрессионную вставку ДНК.
- Выполняют ПЦР для полученияN1-391 и P1-126, используя в качестве шаблонов ранее построенные 2BT-10 N1-391 и 2BT-10 P1-126.
- Выполнение1-й ПЦР для полученияN1-391 из конструкции 2BT-10 N1-391 с использованием условий ПЦР в Таблице 2 и Таблице 3 с N1-391 Форвардной праймерой и Обратной грунтовкой 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Выполните2-ю ПЦР для получения P1-126 из конструкции 2BT-10 P1-126 с помощью Праймера: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 и P1-126 Обратная праймера (используйте условия ПЦР в таблице 2 и таблице 3). - Наконец, выполняют перекрывающуюся ПЦР на смешанных продуктах предыдущих 2 реакций ПЦР для слиянияN1-391 иР1-126. Используйте грунтовку N1-391 и обратную грунтовку P1-126. Используйте условия ПЦР в таблице 5 и таблице 6.
- Соединяйте вектор и вставку ДНК.
- Обработайте перекрывающиеся продукты ПЦР ДНК-полимеразой Т4 в соответствии с протоколом на этапе 1.3.
- Отжиг вектора КСЖ и продукта ПЦР в соответствии с протоколом на этапе 1.4.
- Определите положительные конструкции, следующие протоколу на шаге 1.5.
2. Экспрессия и очистка белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте E. coli для бицистронной конструкции коэкспрессии как N, так и P. Культивирует клетки при 37 °C, но проводит экспрессию при пониженной температуре (16 °C) в течение ночи. Очищают белковые комплексы с помощью комбинации кобальтовой колонки, ионного обмена и размерной исключаемой хроматографии(рисунок 2).
- Используйте штамм E. coli BL21(DE3) для производства белка. Выращивайте 4 L клеточных культур при 37 °C в среде LB (Luria Broth) до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6.
- Понизьте температуру до 16 °C. Через час индуцируют экспрессию с помощью 0,5 мМ изопропил 1-тио--D-галактопиранозида (IPTG) в течение ночи.
- Центрифугируют ячейки при 4,104 х г в течение 25 мин, а затем отбрасывают супернатант.
- Повторно суспендировать клеточные гранулы в 200 мл лизисного буфера А (50 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, 10% глицерина и 0,2% NP40). Используйте 50 мл лизисного буфера для повторного суспендирования клеточных гранул из 1 л клеточной культуры.
- Различите клетки ультразвуком в течение 15 минут, 3 секунды включено и 3 секунды выключено. Затем центрифужные ячейки при 37,888 х г в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания клеток перед ультразвуком в морозильной камере с температурой -80 °C. - Загрузите супернатант в кобальтовую гравитационную колонну (диаметр х длина: 2,5 см х 10 см) с ~10 мл бусин, предварительно уравновешенных 5-10 колонными объемами (CV) лизисного буфера.
- Промыть колонку 5 CV буфера B (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 1 М NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола) и 5 CV буфера C (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола).
- Элюдирует белок из шариков, используя 2 CV буфера D (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола).
- Разбавляют элюированный белок 5x буфером QA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 5% глицерина) для колонки Q.
- Промыть 5 мл колонны Q буфером QA, чтобы уравнять колонну, затем загрузить разбавленный образец в колонну Q с помощью перистальтического насоса (например, Rabbit).
- Загрузите колонку Q в машину ВЭЖХ вместе с буфером QA и буфером QB (50 мМ Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% глицерин). Установите скорость потока 1 мл/мин.
- Запустите программу «стирка насоса», чтобы постирать машину с буфером QB, за которым следует буфер QA (1-2 резюме / каждый). Установите расход системы на 3 мл/мин.
- Установите UV1 на 280 нм и UV2 на 260 нм. Используйте 96 пластин глубокой скважины для сбора фракций.
- Элюируют белки с помощью ступенчатого градиента элюирующего агента (QB Buffer), применяя 3-4 CV от каждой концентрации, увеличивая процент на 5% каждый раз, начиная с 0% QB. Белковый комплекс N0P выйдет на 15% QB Buffer.
- После того, как весь белок элюирован, промыть колонку 100% буфером QB (2 CV).
- Выделяют белок путем гелевой фильтрации Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки (диаметр х длина: 1,0 см х 30 см) и уравновешивать буфером E (20 мМ HEPES pH 7,4 и 200 мМ NaCl).
- Анализ белковосодержащих фракций с помощью SDS-PAGE.
3. Сборка in vitro вирус-специфического NC
ПРИМЕЧАНИЕ: Сборку in vitro РСВ-специфического NC (N:РНК) проводили путем инкубации подготовленного комплекса N0P с Олигосом РНК. Затем хроматография SEC была использована для отделения сборочного комплекса от N0P и избыточной РНК(рисунок 2).
- Смешайте и инкубируют очищенный комплекс N0P с Олиго РНК с молекулярным соотношением 1:1,5 при комнатной температуре в течение 1 часа, обычно для следующего этапа достаточно 1 мл белкаN0P с концентрацией 1 мг/мл. Настройте контрольный образец, который содержит только такое же количество белка N0P.
- Предварительно уравновешивают гель фильтрацию Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки с буфером E (20 мМ HEPES, рН 7,4, 200 мМ NaCl).
- Центрифугировать образец с 21 130 х г в течение 15 мин, удалить любые осадки и загрузить супернатант в колонну SEC.
- Сравните хроматографические изображения SEC образца сборки N:РНК и контрольного образца N0P, объедините соотношение A260/A280, чтобы определить, какие пики являются собранными N-РНК, N0P и свободной РНК.
- Соберите пиковые фракции, запустите гель SDS-PAGE или сделайте сетки.
- Для сборки комплекса N-РНК соберите все фракции пика N-РНК, сделайте экстракцию РНК и запустите гель Urea-PAGE, чтобы дважды проверить длину специфической РНК, которая такая же, как смешанная и инкубированная на первом этапе.
4. Изготовление отрицательных пятен сетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Электронная микроскопия отрицательных пятен (ЭМ) представляет собой метод, при котором молекулы адсорбируются в углеродную пленку, а затем встраиваются в слой атомов тяжелых металлов. Отрицательное пятно EM создает высокий контраст изображения, что позволяет легко видеть и вычислительно выравнивать частицы. Другим преимуществом является то, что адсорбция частиц к углеродной пленке обычно побуждает молекулы прилипать к сетке с несколькими предпочтительными ориентациями. Когда молекулы находятся в одинаковой ориентации, их легко разделить на структурно различные классы. Таким образом, отрицательное окрашивание ЭМ является подходящим методом для руководства пробоподготовкой25,26 (рисунок 3).
- Микроволновая печь или нагрейте 5 мл ddH2O в небольшом стеклянном стакане с помощью вольфрамового нагревателя до тех пор, пока он не закипит.
- Взвесите 37,5 мг уранилфоримата и добавьте к 5 мл нагретого ddH2O, чтобы получить 0,75% раствор для окрашивания уранилформата. Перемешайте под покрытым алюминиевой фольгой мукером для защиты от света.
- Добавьте 4 мкл 10 М NaOH в окрашивающий раствор и продолжайте перемешивать в течение 15 мин, защищенных от света.
- Процедить раствор через фильтр 0,22 мм в пробирку.
- Используйте тлеющий разряд, чтобы сделать непрерывные электромагнитные решетки с углеродным покрытием гидрофильными27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сети размещены внутри камеры, подключенной к источнику питания. При подаче высокого напряжения газ в камере ионизируется, а отрицательно заряженные ионы осаживаются на углеродных решетках, чтобы сделать их гидрофильными. - Вырежьте и сложите полоску парапленки. Пипетировать 2 капли по 40 мкл буфера с одной стороны парапленки, а пипетировать еще 2 капли по 40 мкл окрашивающего раствора на другую сторону.
- Чтобы сделать эм-углеродные решетки, нанесите 3 мкл образца белка на 1 минуту.
- Смажь сетки на промокающей бумаге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки промывают 2 раза буфером и 1 раз с 0,75% раствором для окрашивания уранилформата, промокающим после каждой ступени. - Подержите поверхность сетки во второй капле 0,75% раствора для окрашивания уранилформата в течение 30 секунд.
- Промокните сетку о промокающую бумагу, чтобы удалить лишний раствор пятен и дать сетке высохнуть на воздухе.
- Сохраните сетки в поле сетки перед созданием изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Очистка не-РНК-свободного N0P белка
С помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный комплекс RSV N0P. Полная длина N и N концевой части P-белков была совместно экспрессирована с 10X His-Tag на N-белке в E. coli. N0P очищали с помощью кобальтовой колонки, ионого обмена и хроматографии с исключением размеров. N0P содержит как полноразмерный N, так и N-терминал P, но не содержит клеточной РНК, основанной на УФ-абсорбции A260/ A280 ratio20 (рисунок 4).
Сборка N-РНК и проверка отрицательным пятном
Затем мы продемонстрировали, что очищенный N 0 P можетбытьстимулирован и собран в нуцелоплазмидоподобные частицы (NCLP) путем инкубации со специфическими олигосами РНК. НКЛП собирали путем инкубации N0P с олигосами РНК с соотношением 1:1,5 при комнатной температуре в течение 1 часа и затем проходили через гелевую фильтрационную колонну. Когда образуется комплекс N:РНК, он показывает три пика:1-й пик — N:РНК,2-й пик — N0P, а3-й пик — избыток свободной РНК. Самая высокая доля пика N:РНК создает отрицательные пятнистые сетки для проверки с помощью EM20 (рисунок 5).
Рисунок 1. Иллюстрация плазмидных конструкций. ля. Конструкция РСВ Н1-391; си. Конструкция РСВ1-126; C. Бицистронная конструкция для коэкспрессии N1-391 и P1-126. Первый ген RSV N1-391,второй ген RSV P1-126,ген устойчивости к антибиотикам (AmpR), и промоторы выделены в желтых, циановых, розовых и оранжевых коробках соответственно. Таким образом, генные вставки RSV N1-391 и RSV P1-126 построены отдельно и собраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Блок-схема очистки белкового комплексаN1-391P1-126. В нем описывается инокуляция и крупномасштабный рост клеточной культуры E. coli и сбор клетки путем центрифугирования. С последующим лизисом клеток образцы белка очищаются с помощью аффинной хроматографии (т. Е. Колонки Co2+), ионообменной хроматографии (т. Е. Колонки Q) и хроматографии исключения размера гелевой фильтрации (SEC). Образцы белка дополнительно анализируются гелем SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Подготовка отрицательных пятен ЭМ сетки для визуализации. О. Свечение разряжает сетки. си. Показана процедура отрицательного окрашивания сетками. Пинцет используется для поднятия сетки с последующим нанесением образца белка на 1 минуту. Сетки промокаются промокающей бумагой. Сетку дважды промывают буфером и дважды 0,75% раствором для окрашивания уранилформата. Сетки удерживают во втором окрашивающем растворе каплей в течение 30 секунд. Сетки промокают после каждой стирки и сушат на воздухе после окончательного промокания. C. Сетки хранятся в сетке для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Репрезентативные результаты коочификации комплекса N1-391P1-126. ля. Профиль СПК N1-391P1-126. си. Sec профиль сборки N1-391P1-126 с РНК. C. Гель SDS-PAGE показывает N-белок только для комплекса N-РНК и полосы для N- и P-белков комплекса N1-391P1-126. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Репрезентативные изображения N-РНК. A и B являются репрезентативными отрицательными пятнами ЭМ-изображений N-РНК от пикаN1-391-РНК на рисунке 4. Комплексы N-РНК окрашиваются с помощью процедуры, описанной на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Грунтовки | |||
| N1-391 Вперед | 5'-ТАКТТКААТЦКААТККААТГКАААТГГККТГАГАААГТАГ-3' | ||
| N1-391 Реверс | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Вперед | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Реверс | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTACTGGGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Таблица 1. Последовательности праймеров.
| ПЦР-амплификация ДНК-вставки | |
| 15 мкл | 10x PFU полимеразный реакционный буфер |
| 3 мкл | Форвардная грунтовка (концентрация 100 мкМ) |
| 3 мкл | Обратная грунтовка (концентрация 100 мкМ) |
| 15 мкл | смесь dNTP при концентрации 2,5 мМ |
| 6 мкл | Плазмидная ДНК содержит ген N или P (100 нг/мкл) |
| 7 мкл | Дмсо |
| 3 мкл | Полимераза PFU при 2,5U/мкл |
| Объем для заполнения до 150 мкл | Стерильный ddH2O |
Таблица 2. ПЦР-амплификация реагентов-вкладыш днк.
| ПЦР-ампликация ДНК-вставки | |||
| шаг | Время | температура | Циклов |
| денатурация | 4 мин. | 95 ºC | 1 |
| денатурация | 45 сек. | 95 ºC | 30 |
| отжиг | 30 сек. | 62 ºC | |
| Расширение* | 90 сек. | 72 ºC | |
| расширение | 10 мин. | 72 ºC | 1 |
| держать | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Смесь 150 мкл может быть запущена в трех отдельных реакциях ПЦР (3 x 50 мкл). | |||
| * Для ДНК-полимеразы Pfu рекомендуемая скорость составляет 1 кб/мин для фазы расширения. Здесь длина гена N1-391 или гена P1-126 короче 1,5 Кб. | |||
| Таким образом, для шага расширения было использовано 90 секунд. | |||
Таблица 3. ПЦР-амплификация программы термоциклирования ДНК-вкладышей.
| Обработка ДНК-полимеразой T4 | |
| 10 x Буфер | 2 мкл |
| Вектор / вставка ДНК (вектор 0,1 пмоль или вставка 0,2 пмоль) | 5 мкл |
| дНТП* при 25 мМ | 2 мкл |
| DTT на 100 мМ | 1 мкл |
| ДНК-полимераза T4 (сертифицирована LIC) | 0,4 мкл (1,25 ЕЕБЛ) |
| Стерильный ddH2O | 9.6 мкл |
| * dGTP использовался для вектора, а dCTP использовался для вставки ДНК. | |
Таблица 4. T4 ДНК-полимеразная обработка.
| Перекрытие ПЦР | |
| 15 мкл | 10 X PFU полимеразный реакционный буфер |
| 3 мкл | Грунтовка (100 мкМ) |
| 3 мкл | Обратная грунтовка (100 мкМ) |
| 15 мкл | дНТП Микс (2,5 мМ) |
| 3 мкл | ДНК из1-й круглой ПЦР, которая содержит ген N1-391 (100 нг/мкл) |
| 3 мкл | ДНК из1-й круглой ПЦР, которая содержит ген P1-126 (100 нг/мкл) |
| 7 мкл | Дмсо |
| 3 мкл | Полимераза PFU (2,5 ЕФ/мкл) |
| Объем для заполнения до 150 мкл | Стерильный ddH2O |
Таблица 5. Перекрывают реагенты ПЦР.
| Перекрытие ПЦР | |||
| шаг | Время | температура | Циклов |
| денатурация | 4 мин. | 95 °С | 1 |
| денатурация | 45 сек. | 95 °С | 30 |
| отжиг | 30 сек. | 62 °С | |
| Расширение* | 2 мин. | 72 °С | |
| расширение | 10 мин. | 72 °С | 1 |
| держать | ∞ | 4 °С | 1 |
| Смесь 150 мкл может быть запущена в трех отдельных реакциях ПЦР (3 x 50 мкл). | |||
| * Для ДНК-полимеразы Pfu рекомендуемая скорость составляет 1 кб/мин для фазы расширения. Здесь общая длина гена N1-391 и P1-126 короче 2,0 Кб. Таким образом, для шага расширения было использовано 2 минуты. | |||
Таблица 6. Перекрывая программу термоциклирования ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) несегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла (NNS) показывают, что собранные NCLP представляют собой комплекс N с клеточными РНК хозяина при сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических системах экспрессии15,16,17,18,19. Предыдущие исследования пытались получить N без РНК с помощью различных методов, таких как переваривание РНКазы А, промывка с высоким содержанием соли или корректировка различных буферов рН для удаления неспецифических клеточных РНК28,29. Однако ни один из вышеперечисленных методов не может быть успешно использован для сборки вирус-специфических НК. Чтобы получить RSV N без РНК, мы также попробовали комбинацию методов, включая переваривание РНКазы А, промывку с высоким содержанием соли (1,5 млн NaCl), регулировку буферного рН от рН 5,0 до рН 9,0, денатурацию белка и ренатурацию. После многих неудачных испытаний мы все еще не могли получить N без РНК с помощью вышеуказанных методов. Мы кратко обсудим попытки и возможные причины.
Одним из методов получения N без РНК является переваривание клеточной РНК хозяина в собранных НКПП с РНКазой А. При ВСВ инкубацию очищенного NCLP с РНКазой А в конечной концентрации 1мг/мл при 37 °С в течение 1 ч полностью удаляли РНК из NC28. Очищенный пустой олигомерный N затем инкубировали с поли-А (250-нт или более) в молярном соотношении 1:5 в присутствии ингибиторов РНКазы. Анализ РНК, выделенной из восстановленного N:poly-A, показал, что РНК была примерно 90 nt в длину. Это говорит о том, что РНК вне нуклеопротеина восприимчива к неспецифическому перевариванию загрязненной РНКазой А с предыдущей ступени. Стратегия переваривания РНКазы А для удаления РНК не была успешной при применении к РСВ. Это может быть связано с двумя причинами. Во-первых, загрязненная РНКаза А будет переваривать RSV-специфическую РНК, которая впоследствии будет инкубирована и собрана с N. Во-вторых, эффективность переваривания РНКазы А значительно ниже при РСВ. Это связано с тем, что РНК собираются по-разному в разных вирусах NNS. Известные кристаллические структуры N:РНК показывают, что РНК связывается вне NC в VSV, но внутри NC в RSV30,31. Конфигурация связывания РНК внутрь НК может привести к низкой эффективности доступа и переваривания РНКазы А.
Другой метод получения N без РНК состоит в том, чтобы сделать усечения, которые разрезают как N-концевой мотив (N-плечо), так и С-концевой мотив (С-плечо) N. Однако этот усеченный N без РНК не может быть использован для сборки с РНК в стабильный NC, потому что N-плечо N складывается в соседние субъединицы путем взаимодействия с C-концевым доменом (CTD) прецедентной N-субъединицы. Расширенный C-плечо расположен к CTD следующей N-подъединой31.
Дополнительным методом получения N без РНК является получение мутантного N. Например, результат, полученный Galloux et al., показал, что rsV РНК свободный N0P комплекс может быть получен путем коэкспрессии двойного N-мутанта K170A/R185A с N-концом P у бактерий32. Однако у него есть две потенциальные проблемы для дальнейших структурных характеристик. Одной из проблем является низкая стабильность этого мутантного комплекса при высоких концентрациях. Другая проблема заключается в том, что мутантный комплекс потерял способность связывания РНК, которая не может быть использована на следующем этапе сборки.
Несмотря на огромные проблемы, мы создали и оптимизировали протокол для получения вирус-специфических НК с использованием совместной экспрессии N с шапероном P. В последнее время еще одним успешным методом является создание химерной конструкции синтеза для P1-50-TEV-N1-405-8xHis для MeV33,34. N0P может быть получен после расщепления протеазы TEV. Чистота N0P зависит от эффективности расщепления TEV, которое сокращает химерное слияние между N и P белком.
Вместо того, чтобы использовать метод химерного синтеза, мы разработали бицистротронную конструкцию коэкспрессии. В частности, конструкции коэкспрессии комплекса N0P были спроектированы и спроектированы в двух открытых считывающих кадрах, включающих полную длину N (1-391) с 10-кратным His-меткой на N-терминале в первом ORF и N-концевые пептиды (1-126) из P во втором ORF20. Вкратце, общая процедура очистки N0P заключается в очистке помеченных His N0P и N-РНК образцов клеточного лизиса с кобальтовым шариками, удалении неспецифической РНК и N:клеточного комплекса РНК с колонкой Q и получении чистого комплекса N0P с колонкой SEC. На этапе SEC соотношение A260/A280 можно контролировать и дважды проверять с помощью извлечения РНК из пиковых фракций N0P.
В совокупности в этом протоколе наиболее важными шагами являются стратегия проектирования построения коэкспрессии комплекса N0P и использование последовательного сродства и ионообмонной колонны для отделения комплекса N0P, свободного от РНК, от других комплексов N-клеточной РНК. Эффективность стратегии коэкспрессии для получения комплекса N0P относительно низка; около 50% N-белка по-прежнему является комплексом N-клеточной РНК. Протокол также может быть применен для получения свободной от РНК N0P и сборки со специфической РНК с N для получения комплекса N:РНК других вирусов NNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследовательские программы в лаборатории Лян в Эмори поддерживаются Национальным институтом общих медицинских наук США (NIGMS), Национальными институтами здравоохранения (NIH) под номером R01GM130950 и Фондом исследовательских стартапов в Медицинской школе Университета Эмори. Автор благодарит членов лаборатории Лян за полезную поддержку и критическое обсуждение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
