Summary
我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联到内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该协议包括抗体的纯化，抗原的化学偶联，以及偶联物的纯化和有效偶联的验证。
Abstract
靶向抗原递送到 体内 交叉呈递树突状细胞（DC）可有效诱导T效应细胞反应，并在疫苗设计中显示出一种有价值的方法。抗原通过内吞作用受体（如 DEC-205）特异性抗体递送到 DC，这些受体可诱导摄取、加工和 MHC I 类和 II 类表现。
将所需抗原高效可靠地偶联到合适的抗体是DC靶向的关键步骤，除其他因素外，还取决于抗原的格式。全长蛋白质与纯化抗体的化学偶联是一种可能的策略。过去，我们已经成功地建立了模型抗原卵清蛋白（OVA）和DEC-205特异性IgG2a抗体（αDEC-205）的交联，用于小鼠 体内 DC靶向研究。该协议的第一步是通过亲和色谱法从NLDC（非淋巴树突状细胞）-145杂交瘤的上清液中纯化抗体。纯化的抗体通过磺基-SMCC（磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来亚胺基]环己烷-1-羧酸盐）激活以进行化学偶联，同时通过与TCEP-HCl（三（2-羧乙基）盐酸膦）孵育暴露于OVA蛋白的巩基。除去过量的TCEP-HCl和磺基-SMCC，并将抗原与活化的抗体混合过夜偶联。所得的αDEC-205/OVA偶联物被浓缩并从未结合的OVA中释放出来。通过蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证OVA与αDEC-205的成功偶联。
我们已经成功地使用化学交联的αDEC-205 / OVA在肝脏中诱导细胞毒性T细胞反应，并比较了不同的佐剂在 体内 靶向DEC-205+ DC后诱导体液和细胞免疫的潜力。除此之外，这种化学偶联的抗体/抗原偶联物为有效诱导疫苗对肿瘤抗原的反应提供了有价值的工具，并且已被证明在预防和治疗各种类型肿瘤方面优于经典免疫方法。
Introduction
树突状细胞（DC）是免疫系统的核心参与者。它们是一组专门用于抗原呈递的多样化细胞，其主要功能是桥接先天性和适应性免疫1，2。重要的是，DC不仅在有效和特异性的病原体导向反应中起重要作用，而且还参与抗肿瘤免疫1，3的许多方面。
由于它们在宿主免疫中的排他性作用，DC成为疫苗接种靶细胞4的焦点。一种方法是在体内将抗原靶向DC以诱导抗原特异性免疫反应，并且在过去几年中，大量研究致力于确定合适的受体和靶向策略1，4。一个例子是C型凝集素受体DEC-205，其可以通过DEC-205特异性抗体靶向诱导内吞作用。重要的是，DEC-205靶向与合适的佐剂组合已被证明可以有效地诱导长寿命和保护性的CD4+和CD8+ T细胞，以及抗体反应，也针对肿瘤抗原3，5，6，7，8，9。
有许多研究表明，靶向DC的偶联抗原优于游离的未偶联抗原3，5，10，11，12。这使得抗原与相应的DC靶向部分的共轭成为DC靶向方法的核心步骤。在通过抗体或抗体片段靶向DC的情况下，抗原可以是化学或遗传连接的，并且任何一种策略都提供了自己的（dis）优势1。一方面，在基因工程抗体 - 抗原构建体中，抗原剂量以及位置的控制在批次1之间提供卓越的可比性。然而，与此同时，化学偶联需要较少的准备工作，并提供更大的灵活性，特别是在尝试在实验和临床前模型中测试和比较不同的抗原和/或疫苗接种策略时。
在这里，我们提出了一种方案，用于将卵清蛋白（OVA）作为模型蛋白抗原与适合小鼠体内DC靶向的DEC-205特异性IgG2a抗体（αDEC-205）进行有效和可靠的化学偶联。首先，从NLDC-145杂交瘤细胞13中纯化αDEC-205。对于化学偶联，使用含有NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基）和马来酰亚胺基的异双功能交联剂4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC），允许含胺和巯基分子的共价共轭。具体而言，抗体的伯胺最初与磺基-SMCC反应，所得的马来酰亚胺活化的αDEC-205随后与通过TCEP-HCl（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）还原的含巯基OVA蛋白反应。最终产物是化学偶联的αDEC-205 / OVA（图1）。除了化学偶联本身之外，我们的方案还描述了从偶联物中去除过量的OVA，以及通过蛋白质印迹分析和特定的酶联免疫吸附测定来验证成功偶联。我们过去曾成功采用这种方法将OVA和其他蛋白质或免疫原性肽化学偶联至αDEC-205。我们证明了在体外与CD11c+细胞的有效结合以及体内细胞和体液免疫的有效诱导 。
当然，这种方法存在缺点，例如批次间可比性以及最终偶联物中抗原的精确剂量。然而，与基因工程构建体相比，化学偶联在选择抗体和蛋白质抗原方面提供了实验灵活性。因此，我们认为这种方法在评估临床前小鼠模型中不同抗原在DC靶向中的效率方面特别有价值，重要的是在特定的抗肿瘤免疫反应的背景下也是如此。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有描述的动物实验都得到了当地政府机构的批准（Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit;文件编号33.12-42502-04-10/0108），并根据国家和机构指南进行。
1. 从杂交瘤细胞系NLDC-145生产αDEC-205
- 对于抗体生产，在37°C的水浴中解冻冷冻保存的NLDC-145细胞产生αDEC-205。在37°C和5%CO下扩增细胞2.两个 75 厘米2 需要瓶子才能进行抗体生产。细胞培养程序应在安全柜中进行，以确保安全的工作条件并防止培养物污染。
- 将1mL解冻细胞（1 x 106 - 5 x 106个细胞/ mL）重悬于9mL补充有1%青霉素/链霉素（预温至37°C）的ISF-1培养基中，放入细胞培养瓶（25cm2）中。将烧瓶水平置于37°C，5%CO2的细胞培养箱中。
- 将细胞在37°C和5%CO2下培养，直到70%汇合。这通常应在24 - 48小时后实现。
- 一旦细胞汇合70%，使用移液器控制器将完整的NLDC-145细胞悬浮液（10mL）转移到15 mL锥形离心管中，移液器的体积范围为1-10 mL。通过在室温下以250×g离心10分钟来沉淀细胞。
- 在水浴中预热ISF-1培养基至37°C，并将沉淀重悬于12mL补充有1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基中。将重悬的细胞悬浮液转移到新鲜的细胞培养瓶（75cm2）中。
- 在37°C和5%CO2下在补充有1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基中培养和扩增细胞，直到70%汇合和99%活。这通常应在48 - 72小时后实现。
- 将细胞分成两个75 cm2 烧瓶。为此，首先用细胞悬浮液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，以从表面除去所有NLDC-145细胞。将6 mL的NLDC-145细胞悬浮液分别转移到两个新鲜的75 cm2 瓶中的一个中，并加入补充有1%青霉素/链霉素的预热ISF-1培养基，最高可达12mL。
注意：不要更新细胞培养基，因为NLDC-145细胞将调节培养基。将细胞与其培养基一起转移，并用新鲜培养基将培养物填充至所需体积。这对于NLDC-145细胞的生存能力和最大抗体产生至关重要。 - 在37°C和5%CO2下扩增细胞培养物，直到约70%汇合，通常在48-72小时后达到。
- 一旦细胞汇合70%，将10mL的膨胀NLDC-145细胞悬浮液从75 cm2 瓶中的每一个转移到一个PETG（聚对苯二甲酸乙二醇酯）滚筒瓶（1，050cm2）中。为此，用细胞悬浮液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，使用移液器控制器和10 mL移液器从表面除去所有细胞。
- 将140 mL补充有1%青霉素/链霉素（预热至37°C）的ISF-1培养基直接从培养基瓶中加入到每个含有滚筒瓶的NLDC-145中，填充它们至150 mL标记。
注意：请参阅步骤 1.1.6 中的注释。 - 将滚瓶在37°C，5%CO2和25 轮/分钟下培养三天。
- 向每个含有滚筒的NLDC-145中加入150毫升补充有1%青霉素/链霉素（预热至37°C）的ISF-1培养基，灌装至300毫升标记。
- 现在，在37°C，5%CO2和25 轮/分钟下培养含有300 mL培养物的滚瓶再培养三天。
- 将另外100毫升补充有1%青霉素/链霉素（预温至37°C）的ISF-1培养基加入每个含有滚筒的NLDC-145中，从而将其填充至400毫升标记。
- 现在，在37°C，5%CO2和25 轮/分钟下培养含有400 mL培养物的滚瓶再培养7天。
注意：在本周，培养物变得非常密集（密度高达95%）并且存活率降低（低至50%），从而实现最大的抗体释放。
- 为了从培养物上清液中纯化αDEC-205，将NLDC-145细胞悬浮液（来自两个辊瓶）直接倒入500 mL高压灭菌离心瓶中。
注意：应收集总体积为800 mL的培养物。- 在8，600×g和4°C下离心培养物30分钟以除去细胞和碎屑。
- 收集上清液，丢弃颗粒并将上清液汇集在无菌试剂瓶中。
注意：αDEC-205的纯化可以立即开始（步骤2）或上清液可以在4°C下短期储存。
2. 从NLDC-145细胞上清液中纯化αDEC-205抗体
注意：从NLDC-145细胞上清液中，使用蛋白质G Sepharose柱（可重复使用）纯化αDEC-205。色谱柱尺寸为 15 mm x 74 mm，每色谱柱填充 5 mL 蛋白 G 琼脂糖。
- 为了制备和洗涤蛋白质G琼脂糖柱，在蛋白G琼脂糖柱的上开口处放置一个气密的橡胶塞。用两个无菌插管（20 G x 1 1/2"，0.90 x 40 mm）刺穿橡胶塞。
- 将 10 mL 注射器连接到两个插管之一，并将一个柔性硅管（长约 100 cm，直径 2.5 - 3 mm）连接到第二个套管。
注意：注射器/橡胶塞结构可重复使用，并提供真空，导致大量培养物上清液连续流向蛋白G琼脂糖柱。为此，在以下步骤中，稍微拉回注射器的柱塞，以确保连续的流体流动。 - 用50 mL的0.1M冰醋酸（pH 2）洗涤色谱柱，以从任何先前的抗体纯化中除去潜在的残留抗体。将硅管的末端放入0.1M冰醋酸（pH 2）填充的试剂瓶中。作为诱导真空的结果，50 mL的0.1M冰醋酸（pH 2）滴落穿过蛋白G Sepharose柱。
注意：0.1 M冰醋酸（pH 2）应储存在试剂瓶中或新鲜填充在烧杯中。 - 用100-200 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤色谱柱。将硅管的末端放入PBS填充的试剂瓶或烧杯中。让 100-200 mL PBS 通过蛋白 G 琼脂糖柱滴动。
- 将 10 mL 注射器连接到两个插管之一，并将一个柔性硅管（长约 100 cm，直径 2.5 - 3 mm）连接到第二个套管。
- 为了从NLDC-145上清液中纯化抗体，将800mL的NLDC-145上清液（从步骤1.2.2获得）加载到色谱柱上。将硅管的末端放入NLDC-145上清液填充的试剂瓶中。让 800 mL NLDC-145 上清液通过色谱柱滴流。
- 用500 mL PBS洗涤色谱柱。将硅管的末端放入PBS填充的试剂瓶或烧杯中。让 500 mL PBS 在色谱柱中滴动。
- 对于洗脱，使用20个1.5mL管和移液器100μL的1.5M Tris-HCl（pH 8.8）到每个1.5mL管中。从色谱柱上取下橡胶塞，将1 mL 0.1 M甘氨酸（pH 3）移液到蛋白G Sepharose柱的上腔室，以从色谱柱中洗脱抗体。将流出物直接收集在制备的1.5 mL管之一中洗脱液。
- 对所有20个试管（1.5 mL）重复洗脱步骤（2.2.2.2）。。
- 使用分光光度计测定280nm处所有洗脱级分（OD280）的光密度，以鉴定含抗体的组分。
注意：使用第一个洗脱部分作为空白。 - 汇集 OD280 大于 0.5 的所有馏分（约 10 个馏分）。
- 将充满20%乙醇的蛋白质G Sepharose柱储存在4°C。
- 使用分子量截止值（MWCO）为12 - 14 kDa的透析管在4°C下对1000 mL PBS（在2000 mL烧杯中）透析混合洗脱过夜。
- 将透析管切成20厘米的碎片。透析管在500-800 mL的10 mM EDTA（pH 7.5）中煮沸，使用热板在烧杯中煮沸30分钟以除去污染物。弃去10 mM EDTA（pH 7.5）溶液，并将透析管在去离子水中煮沸10分钟。
注意：透析管可以直接使用，也可以储存在4°C的0.01%叠氮化钠（NaN3）/H2O溶液中，直到下次使用。 - 用适当的透析管闭合/单件式铰链夹合透析管的底部，并小心地将抗体洗脱液入透析管中。用第二个夹子关闭透析管的顶部。
- 将透析管的上部夹具固定在浮动支架上，将其与磁性搅拌棒一起放入PBS填充的烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上。
- 透析在4°C下搅拌过夜。
- 将透析管切成20厘米的碎片。透析管在500-800 mL的10 mM EDTA（pH 7.5）中煮沸，使用热板在烧杯中煮沸30分钟以除去污染物。弃去10 mM EDTA（pH 7.5）溶液，并将透析管在去离子水中煮沸10分钟。
- 为了增加αDEC-205的浓度，将完整的透析液加载到具有10 kDa MWCO的离心浓缩器中。打开管道的一个夹子，小心地将整个透析液从透析管中移出到离心浓缩器（10 kDa MWCO）中。
注：请勿用移液器吸头触摸浓缩器底部。- 在693×g（2，000rpm）和4°C下离心30分钟。
- 将离心浓缩器与10mLPBS中充入，并在693×g（2，000rpm）和4°C下离心，直到剩余的抗体溶液的最终体积为1-1.5mL。
注意：如有必要，请重复2.4.1的离心步骤。以调整到所需的量。 - 使用分光光度计，测定浓缩的αDEC-205溶液在280nm（OD280）处的光密度。使用 PBS 作为空白。
- 使用以下公式计算αDEC-205的浓度：
浓度 [毫克/毫升] = OD280/1.4。 - 使用0.22μm注射器过滤装置过滤αDEC-205溶液。
注意：从NLDC-145杂交瘤细胞上清液中纯化αDEC-205也可以通过FPLC（快速蛋白质液相色谱法）实现。纯化的αDEC-205可以在4°C或-18°C下储存以长期储存。
3. OVA与αDEC-205的化学偶联
注意：最佳化学偶联需要0.5mg OVA蛋白与2.5mg αDEC-205（1：5）的比例。然而，该比例可能因其他蛋白质和抗体而异，需要针对替代偶联物进行优化。通过与30mM TCEP-HCl孵育来还原OVA蛋白的二硫键，其暴露在步骤3.2中需要将巯基暴露于化学偶联到αDEC-205和240μlTCEP-HCl。两个步骤，TCEP诱导的OVA减少（步骤3.1.）和αDEC-205的磺基-SMCC活化（步骤3.2.），最好同时进行。
- 新鲜制备125 mM TCEP-HCl溶液（pH 7.0）。称出所需量的TCEP-HCl，并将TCEP-HCl溶解在0.9 M Tris碱（pH 8.8）中。使用pH指示条测试125 mM TCEP-HCl溶液的pH值（应为中性），并用Tris碱（pH 8.8）调节pH值。
- 将200μL OVA蛋白溶液（含有0.5mg OVA）移入1.5mL无菌管中。使用移液管将240μl125mM TCEP-HCl和560μL无菌超纯水加入OVA蛋白中，最终浓度为0.5mg / mL OVA蛋白和30mM TCEP-HCl（OVA / TCEP-HCl）。
注意：将2.5mg EndoGrade OVA（冻干）溶解在1mL PBS中，产生2.5mg / mL OVA溶液。 - 将得到的OVA/TCEP-HCl在室温下孵育1.5小时。
注意：请勿延长此孵育步骤。
- 将200μL OVA蛋白溶液（含有0.5mg OVA）移入1.5mL无菌管中。使用移液管将240μl125mM TCEP-HCl和560μL无菌超纯水加入OVA蛋白中，最终浓度为0.5mg / mL OVA蛋白和30mM TCEP-HCl（OVA / TCEP-HCl）。
- 为了激活αDEC-205进行缀合，将2mg磺基-SMCC溶解在100μL超纯水中。
注：Sulfo-SMCC易受水解影响。因此，应迅速处理大量未溶解的磺酸-SMCC，或使用可用的2mg等分试样。- 在PBS中稀释αDEC-205，使2.5mg包含在900μL中。
- 将2.5mg的αDEC-205（900μL体积;从步骤3.2.1获得）和100μL磺基-SMCC（从步骤3.2中获得）混合在1.5mL管中，得到总体积为1mL。
- 将αDEC-205 / sulfo-SMCC溶液在37°C和550rpm的加热块中孵育30分钟。
- 在这些孵育之后，使用脱盐柱（MWCO 7 kDa;5 mL柱体积）立即从溶液中除去过量的磺基-SMCC和TCEP-HCl。
- 拧开色谱柱 （MWCO 7 kDa） 底部封口，松开瓶盖，将色谱柱放入 15 mL 锥形管中。
- 在室温下以1，000×g离心2分钟以除去液体。
- 将色谱柱放入新管中，取下盖子。将抗体/磺基-SMCC和OVA/TCEP-HCl分别缓慢上样到一个色谱柱的致密树脂床的中心。
- 在室温下以1，000×g离心2分钟。
- 使用后丢弃列。含有抗体和OVA的溶液在管中，这些溶液为偶联而准备。
- 通过移液立即混合两种溶液以偶联αDEC-205和OVA。
- 将所得的αDEC-205和OVA混合物在4°C下孵育过夜。
- 偶联后，从溶液中除去多余的未结合OVA，并使用离心蛋白浓缩器（MWCO 150 kDa）浓缩偶联的αDEC-205 / OVA。
- 通过在色谱柱上移液12mL PBS并在室温下以2，000×g离心2分钟来预冲洗离心蛋白质浓缩器（MWCO 150 kDa）。
注意：如有必要，重复离心步骤（3.4.1.），直到约5mL的体积通过色谱柱。 - 在将αDEC-205 / OVA上样到离心蛋白浓缩器之前，保存20μL未浓缩的αDEC-205 / OVA样品以进行蛋白质印迹分析。将此等分试样储存在4°C直至分析。
- 通过移液将αDEC-205 / OVA加载到离心蛋白质浓缩器上。
注：避免与离心浓缩器上腔室的床层接触。 - 用PBS填充浓缩器至15 mL，并在室温下以2，000×g离心浓缩器5分钟。
- 保存流出（流出I）样品以进行蛋白质印迹分析，并丢弃剩余的流出物。
- 用PBS填充浓缩器至10 mL，并在室温下以2，000×g离心浓缩器至少8分钟。
- 保存样品用于第二次流出（流出II）以进行蛋白质印迹分析，并丢弃剩余的流出物。
- 一旦达到所需的富集（应将约1.5mL的αDEC-205 / OVA溶液留在上腔室中），轻轻地吸出浓缩样品。
注意：如果上腔室中残留过多的液体，可以重复离心，但应尽可能短地保持离心。
- 通过在色谱柱上移液12mL PBS并在室温下以2，000×g离心2分钟来预冲洗离心蛋白质浓缩器（MWCO 150 kDa）。
- 使用微量分光光度计测定所得αDEC-205/OVA的蛋白质浓度。使用 PBS 作为空白。
- 使用 0.22 μm 注射器过滤装置过滤 αDEC-205/OVA。
注意：对于以后的分析和 体内 实验，αDEC-205 / OVA可以储存在4°C或-18°C。
4. 通过蛋白质印迹验证化学偶联
注：为了验证成功的化学偶联，进行蛋白质印迹分析，检测OVA（4.2）或αDEC-205（4.10）。OVA （4.2.） 或 αDEC-205 （4.10.） 的检测应并行进行。轨道平台振荡器最好用于蛋白质印迹膜的所有孵育步骤，以允许相应溶液的均匀分布。
- 为SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠凝胶电泳）制备标准的10%SDS（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳） 凝胶。
- 为SDS-PAGE准备样品以检测偶联和非共轭OVA并进行凝胶电泳。
- 稀释不同量的偶联αDEC-205/OVA（例如，200、100和50ng）、纯OVA（例如，80、70、60、50、40和30 ng）、一等分试样一等试样（例如，100和50 ng）、步骤3.4.2中的未浓缩αDEC-205/OVA偶联物样品。（例如，125 ng）和等分试样流经I和II（步骤3.4.5.和3.4.7.，分别;可选）在4 x非还原性SDS样品缓冲液中。
注意：加载不同浓度的偶联物和蛋白质，以确保在同一印迹上可以检测到游离OVA和偶联物。 - 在加热块中，样品在65°C下变性10分钟和550rpm。
- 稀释不同量的偶联αDEC-205/OVA（例如，200、100和50ng）、纯OVA（例如，80、70、60、50、40和30 ng）、一等分试样一等试样（例如，100和50 ng）、步骤3.4.2中的未浓缩αDEC-205/OVA偶联物样品。（例如，125 ng）和等分试样流经I和II（步骤3.4.5.和3.4.7.，分别;可选）在4 x非还原性SDS样品缓冲液中。
- 将样品和蛋白质标准品上样到SDS凝胶中并运行SDS-PAGE。
- 将蛋白质从SDS凝胶到甲醇活化PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（75分钟，125mA）进行标准印迹。
- 转印后，将膜放入适当的培养皿中，并通过将25mL4%代餐奶昔粉/ TBS-T（Tris缓冲盐水/ 0.1%吐温20）封闭缓冲液移入含有膜的培养皿中来阻断膜。
- 将膜在室温下在封闭溶液中孵育60分钟或在4°C下过夜。
- 丢弃封闭溶液，通过将15mL一抗溶液移液到培养皿中的膜中，在2%代餐奶昔粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1：3，000）中用兔αOVA一抗染色膜。
- 在室温下孵育膜45分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
- 丢弃抗体溶液并在培养皿中洗涤膜（使用平台振荡器）。
- 向膜中加入25 mL TBS-T，孵育5分钟。丢弃解决方案。
- 向膜中加入25 mL TBS-T/0.5 M NaCl，孵育5分钟。丢弃解决方案。
- 向膜中加入25 mL TBS-T / 0.5%Triton X-100，孵育5分钟。丢弃解决方案。
- 向膜中加入25 mL TBS-T，孵育5分钟。丢弃解决方案。
- 将15mL二抗溶液移液到培养皿中的膜上，在2%代餐奶昔粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1：2，000）中用山羊αrabbit-IgG-HRPO（马萝卜过氧化物酶）二抗染色膜。
- 在室温下孵育膜45分钟或在4°C（在平台振荡器上）过夜。
- 再次按照步骤4.7.1.- 4.7.4中所述洗涤膜。使用平台振动器。对于该膜，接下来继续执行步骤4.16。（以下步骤 4.10.- 4.15。（αDEC-205的检测）可以与步骤4.2.- 4.9并行执行）。
- 准备用于检测SDS-PAGE的αDEC-205的样品并运行凝胶电泳。
- 稀释不同量的αDEC-205/OVA（例如，200、100和50 ng）、未共轭的αDEC-205（例如，250，125，62.5 ng）、纯OVA（例如，80和70ng）、步骤3.4.2中的未浓缩αDEC-205/OVA样品。（例如，125 ng）和等分试样流经I和II（步骤3.4.5.和3.4.7.，分别;可选）在4 x非还原性SDS样品缓冲液中。
- 在加热块中，样品在65°C下变性10分钟和550rpm。
- 将样品和蛋白质标准品上样到SDS凝胶中并进行凝胶电泳。
- 将蛋白质从SDS凝胶到甲醇活化PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（75分钟，125mA）进行标准印迹。
- 转印后，将膜放入适当的培养皿中，通过将25mL的10%封闭缓冲液（奶粉/ TBS-T）移液到含有膜的培养皿中来阻断膜。
注意：阻断溶液在 αDEC-205 和 OVA 检测之间有所不同（步骤 4.5）。- 将膜在室温下在封闭溶液中孵育60分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
- 弃去封闭溶液，通过将15mL抗体溶液移液至培养皿中的膜，在5%奶粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1：5，000）中用山羊αrat-IgG（H + L）-HRPO抗体染色膜。
注意：αDEC-205检测和OVA检测之间的抗体缓冲液不同（步骤4.6./ 4.8.）。- 在室温下孵育膜45分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
- 按照步骤4.7.1.- 4.7.4中所述在培养皿中彻底清洗膜。（使用平台摇床）。
- 使用适当的检测试剂来产生HRP信号，并使用X射线胶片或通过成像系统在黑暗的房间中检测化学发光。
5. 通过酶联免疫吸附法验证化学偶联
- 执行 ELISA 以进一步验证成功导致 αDEC-205/OVA 的化学偶联。
- 在包衣缓冲液中用100μL/孔3 ng/μL兔αOVA抗体包衣适当的96孔ELISA板（0.1M碳酸氢钠（NaHCO3）pH9.6稀释在H2O中）。
- 将板在4°C孵育过夜。
- 涂覆后，用PBS洗涤板三次，例如，使用ELISA垫圈。
- 通过在板的每个孔中移液200μL封闭缓冲液（PBS中的10%FCS）来阻断板，并在室温下孵育板30分钟。
- 在封闭缓冲液中以1：2（PBS中的10%食品接触物质）连续稀释αDEC-205 / OVA（从步骤3.6获得），以获得从6μg/ mL到93.8ng / mL αDEC-205 / OVA的稀释度，并将这些减少量的αDEC-205 / OVA中的100μL /孔加入孔中。
- 在室温下孵育板1小时。
- 用PBS清洗板三次，例如，使用ELISA清洗机。
- 向板的每个孔中加入100μL山羊αrat-IgG + IgM（H + L）-HRPO抗体（在封闭缓冲液中稀释至1：2，000（PBS中为10%FCS））。
- 在室温下孵育1小时。
- 使用PBS洗涤板三次，例如使用ELISA垫圈。
- 向孔中加入50μLHRPO底物。当观察到清晰的颜色反应时，通过每孔加入150μl停止溶液（1M H2SO4）来停止反应。
- 5分钟后，使用ELISA读数器读取450nm处的吸收。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用该协议将αDEC-205与OVA蛋白的化学偶联通常允许有效地生成αDEC-205 / OVA用于体内DC靶向方法。有不同的策略来验证技术本身并测试所产生共轭物的功能。蛋白质印迹分析和ELISA用于验证成功的偶联，同时检测可能留下的游离OVA（图2）。体外结合研究（图3）和体内免疫（图4）证实了偶联物与DEC-205的结合和DC的靶向。
平行的蛋白质印迹分析用于检测共轭OVA（图2A）和共轭αDEC-205（图2B）。具体而言，在印迹中抗体分子量水平上的OVA阳性信号证实了OVA与抗体的关联（图2A）。此外，在蛋白质印迹分析中对OVA进行染色可以检测出在步骤3.6中产生的αDEC-205 / OVA旁边可能仍然存在的过量游离OVA，而所示的印迹则不是这种情况（图2A）。如果检测到大量游离 OVA，则步骤 3.4.1.到 3.4.8。的协议应重复。作为OVA染色（图2A）的补充，蛋白质印迹分析中αDEC-205的染色通过增加"裸"αDEC-205和偶联物之间的分子量来验证成功的偶联 ，如图2B所示。
除了蛋白质印迹外，特定的ELISA还可以验证αDEC-205与OVA的成功偶联。然而，与蛋白质印迹分析相比，该ELISA不允许检测游离和未偶联的αDEC-205或OVA。由于测定设置（图2C），只有当偶联有效时才会产生阳性信号。检测到的信号（在450nm处的吸收）与分析的蛋白质量之间的正相关关系验证了通过化学偶联成功生成αDEC-205 / OVA，如图2D所示。同时，αDEC-205 / OVA偶联物的9.38 ng已经产生的正信号证明了该方法的强灵敏度（图2D）。如果吸附量没有增加，则偶联物量增加，则共轭可能不成功。在这种情况下，蛋白质印迹分析也会产生阴性结果，即在为OVA染色的印迹中未检测到偶联物，并且αDEC-205染色的印迹中的分子量没有增加。
虽然蛋白质印迹和ELISA测定用于评估游离抗原的偶联和去除，但随后需要进行功能分析以确认与DEC-205的结合和DC的靶向。为此，我们进行了体外结合研究（图3）和体内免疫（图4）。对于这些实验，雌性6-8周C57BL / 6和8-12周Balb / c小鼠从商业来源获得或在亥姆霍兹感染研究中心（HZI）的动物设施中繁殖，并饲养在特定的无病原体条件下。图3显示了αDEC-205和HCV核心蛋白（αDEC-205 / Core）偶联物在体外与CD11c+细胞结合的功能测定。流式细胞术清楚地显示αDEC-205 /Core能够有效地结合骨髓来源的CD11c+细胞（图3A，B）以及新鲜分离的小鼠CD11c+脾细胞（数据未显示）。这些测定证明了化学偶联不会干扰αDEC-205的结合能力。免疫荧光分析进一步证实了这一点，显示αDEC-205 / Core与MHC-II+ CD11c+从体外生成的骨髓衍生树突状细胞（BMDC）中分选的细胞的结合（图3C）。
过去，我们已经展示了由所证明的方案产生的αDEC-205 / OVA偶联物，以有效地在小鼠体内诱导OVA特异性免疫反应，证实了偶联物的成功产生以及DC的功能靶向（图4）12，14。具体而言，皮下接种αDEC-205 / OVA可有效诱导体液和细胞OVA特异性免疫应答。重要的是，在重组腺病毒激发模型中，我们检测到能够消除病毒感染的肝细胞的抗病毒CD8+ T细胞，这对针对嗜肝病毒的疫苗具有很强的意义12。此外，抗原特异性细胞毒性T细胞的高效诱导强调了这种方法在体内启动抗肿瘤免疫的潜力。此外，我们已经成功地使用αDEC-205 / OVA在体内DC靶向14的背景下测试和比较不同的佐剂。在用αDEC-205 / OVA与佐剂组合Poly（I：C）（聚肌苷 - 多胞苷酸）和CpG（含有未甲基化CpG基序的合成寡脱氧核苷酸）一起接种疫苗时，我们观察到一般（图4A）和一些时间点与单独接种OVA相比显着更高的OVA特异性IgG水平（图4B）。此外，αDEC-205 / OVA有效地诱导了OVA特异性CD4+以及CD8+ T细胞反应（图4C，D）和αDEC-205 / OVA诱导的CD8+ T细胞反应显着超过单独由OVA诱导的反应（图4D）。
图1：αDEC-205和OVA的化学共轭模型。 在第一步中，αDEC-205的伯胺与交联剂磺基-SMCC的NHS酯反应，产生马来酰亚胺活化的αDEC-205。通过与TCEP-HCl孵育来还原OVA蛋白的二硫键后，马来酰亚胺活化的αDEC-205与TCEP-HCl还原的OVA蛋白反应形成αDEC-205 / OVA抗体/抗原偶联物。缩写： N-羟基琥珀酰亚胺酯 （NHS 酯）;磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC）;三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：化学偶联αDEC-205 / OVA的验证。为了验证αDEC-205和OVA蛋白的有效化学偶联，进行了蛋白质印迹分析（A，B）和ELISA（C，D）。对αDEC-205/OVA、αDEC-205和不同浓度的OVA蛋白样品进行SDS-PAGE（10%），随后利用兔αOVA一抗和山羊αrabbit-IgG-HRPO二抗检测OVA蛋白（A）或山羊αrat-IgG（H+L）-HRPO抗体检测αDEC-205（B）进行蛋白质印迹分析。（C） 用于验证 αDEC-205/OVA 偶联物的 ELISA 示意图。兔αOVA包衣抗体通过偶联的OVA结合αDEC-205 / OVA。山羊αrat-IgG（H + L）-HRPO识别结合偶联物的αDEC-205部分，因此信号为正信号，从而确认有效偶联。（D） ELISA的执行如（C）所示。分析了αDEC-205 / OVA的连续稀释量（1：2）（600ng至9.38 ng）。数据显示为代表性测定的一式三份均值。缩写：酶联免疫吸附测定（ELISA）;马萝卜过氧化物酶（HRPO）;卵清蛋白 （OVA）;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。图A和B已从Volckmar等人12修改而来。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：通过流式细胞术和免疫荧光显微镜将αDEC-205 /核心与骨髓来源的树突状细胞（BMDC）结合。为了分析αDEC-205/Core在BMDC体外结合其靶分子DEC-205的能力， 进行了荧光活化细胞分选（FACS）分析（A，B）和免疫荧光显微镜（C）。简而言之，从8-12周龄的雌性Balb / c小鼠（n = 3）的后腿中分离骨髓细胞，并在补充有1%青霉素/链霉素，1%谷氨酰胺，0.25mM巯基乙醇和5ng / mL GM-CSF（粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子）的RPMI培养基中培养。在第6天，小心地收获了不粘附的BMDC并用于结合分析。（A，B）将体外生成的BMDC与10μg/ mL αDEC-205 /核，αDEC-205或培养基（对照）在4°C下孵育1小时，然后用APC标记的αCD11c[克隆HL3]染色。通过用PE标记的山羊αrat（A）或小鼠αHCV核心[克隆C7-50]对细胞进行额外染色，然后进行继发性αmouse-IgG1-PE染色（B）来检测BMDC表面结合的αDEC-205 / Core。代表性直方图显示门控CD11c+细胞的PE信号和PE阳性细胞百分比。（C）从幼稚的Balb / c小鼠体外产生的BMDC被分类为MHC-II+和CD11c+细胞，并与10μg/ mL αDEC-205 /Core在4°C下孵育1小时。 在洗涤后，用Alexa 594偶联αrat-IgG或小鼠αHCV Core [克隆C7-50]和Alexa 488偶联αmouse-IgG染色细胞结合的αDEC-205 / Core在4°C下染色30分钟。通过免疫荧光显微镜观察细胞（比例尺= 20μm）。αDEC-205 /Core与BMDC的结合能力通过两种染色剂的叠加（双阳性=橙色）得到证实。缩写：骨髓来源的树突状细胞（BMDC）;荧光活化细胞分选（FACS）;粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）;丙型肝炎病毒。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用αDEC-205 / OVA免疫后OVA特异性体液和细胞免疫反应。αDEC-205 / OVA在体内靶向DC的功能已通过免疫实验得到证明，如先前发表在Volckmar等人12中。简而言之，雌性6-8周龄C57BL / 6小鼠（n = 5）在第0天，第14天和第28天用30μgαDEC-205 / OVA偶联物与佐剂50μgPoly（I：C）/ 50μgCpG，30μgαDEC-205单独或单独7μgOVA蛋白进行皮下免疫，总体积为每只动物50μLPBS。进一步的对照组仅用PBS治疗。（A，B）为了监测体液免疫反应，通过异氟醚吸入对接种疫苗的小鼠进行轻度麻醉，并在第0，13和27天从眶后窦收集血液样本，并在第42天通过心脏穿刺收集血液样本。血清按照描述制备，并通过ELISA12测定OVA特异性IgG的存在。终点滴度表示为最后一次血清稀释的倒数值，其产生的吸光度是阴性对照值的两倍。结果来自三个独立实验。（A） OVA特异性总血清IgG滴度的动力学显示为组均值。（B） OVA特异性IgG滴度在第27天和第42天显示为单个小鼠与组均值。统计数据：未配对的双侧 t 检验。（C，D）如前所述，在第42天使用小鼠IFNγ检测试剂盒通过酶联免疫吸附点（ELISPOT）测定分析细胞免疫应答的诱导12。将来自免疫小鼠的分离的脾细胞汇集用于实验组，并分析用5 mg / mL CD4+ （C）或CD8+ OVA肽（D）刺激后的IFNγ点形成单元/106个细胞的数量（OVA肽：CD4323-339（ISQAVHAAHAEINEAGR）和CD8257–264 （SIINFEKL））。条形表示 SEM ±平均值（n=5，一式三份来自合并样本）。统计学：单因素方差分析与邓内特的多重比较检验（**p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001）。缩写：胞嘧啶 - 磷酸 - 鸟嘌呤寡核苷酸序列（CpG），酶联免疫吸附测定（ELISA），酶联免疫吸附斑点（ELISPOT），卵清蛋白（OVA），磷酸盐缓冲盐水（PBS），聚肌苷 - 多胞苷酸（Poly（I：C））。该图已根据Volckmar等人12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/修改。请点击此处查看此图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
内吞作用受体特异性抗体和蛋白质抗原的化学偶联为临床前小鼠模型 中的体内 DC靶向提供了一种有效且重要的灵活方法。通过我们的方案，我们为模型抗原OVA与DEC-205特异性IgG抗体的成功偶联提供了一种有效的方法。
在我们的方案中，αDEC-205是从杂交瘤细胞系中纯化的，过去，我们已经使用如上所述的蛋白G琼脂糖纯化了抗体。值得注意的是，在后来的研究中，我们还使用FPLC纯化αDEC-205，随后的化学偶联同样有效。高效化学偶联的关键步骤是启动抗体和蛋白质。我们从不同的可用方案中优化了这些步骤，最终使用交联剂磺基-SMCC进行抗体孵育，并通过TCEP-HCl还原蛋白质。具体而言，在这一点上，关键步骤是TCEP-HCl的新鲜制备（步骤3.1）和TCEP-HCl与蛋白质孵育的持续时间，不应延长（步骤3.1.2）。此外，用于通过TCEP-HCl还原二硫键的蛋白质缓冲液至关重要，因为它会对TCEP-HCl的还原产生负面影响。此外，重要的是立即混合活化的抗体和还原蛋白（步骤3.3.6），以确保偶联的最佳反应条件。在我们手中，这种方法产生了关于共轭的最有效和最可靠的结果。后续体内方法的另一个关键步骤是从αDEC-205 / OVA偶联物 中 去除未结合的OVA。为了验证这一步，我们优化了蛋白质印迹分析，并建议检测偶联的αDEC-205以及偶联的OVA蛋白（图2A 和 B）。如果最终偶联溶液中存在未结合的OVA，则印迹和检测已知浓度的OVA（如图 2A所示）将有助于估计未结合OVA的量与SDS-PAGE加载的蛋白质总量的关系。如果偶联效率低下，故障排除应解决用于偶联的抗原/抗体比问题。如果偶联如ELISA检测到的那样有效，但无法通过蛋白质印迹分析检测到，我们已经体验到蛋白质印迹分析中的抗体浓度（步骤4.6.，4.8.，4.14）是最关键的因素。
我们方法的主要局限性是偶联效率有时变化，其中抗体分子的数量与偶联蛋白的量之间没有固定的相关性。然而，我们相信并已经体验到，所证明的方案可靠地允许随后对DC靶向进行 体内 研究，从而产生可重复的结果。此外，虽然原则上在我们的方案中，αDEC-205和OVA蛋白都可以交换替代抗体和抗原，用于各种兴趣的 体内 研究，但化学偶联的各个步骤将需要针对新组分进行新的优化。这主要适用于最佳抗体/抗原比，并且可能取决于可还原的Cys残基的可及性。在我们的方法中，导致成功偶联反应的最佳比率是OVA与αDEC-205的1：5和HCV蛋白NS3（非结构蛋白3）和Core与αDEC-205的1.35：1。对于每种偶联物，需要排除交联剂或偶联物本身对抗体抗原结合能力的负面影响。值得注意的是，免疫原性肽而不是全长蛋白质的偶联在这方面问题较小。然而，蛋白质在随后的免疫接种中提供更高的抗原多样性。遗传融合方法显示出化学偶联的替代方案，并且还具有明显的优势1。最终，选择将抗体和抗原联系起来进行DC靶向的策略将取决于资源，研究重点和偶联物的预期应用。我们认为，抗体和抗原的相对灵活性显示出化学偶联的主要优势，我们确实使用了此处描述的方案，将αDEC-205有效地化学偶联到丙型肝炎病毒（HCV）的不同蛋白质（图3 和未显示的数据）。
总体而言，我们认为，内吞作用受体特异性抗体与蛋白质抗原的化学偶联（例如在αDEC-205 / OVA中）显示出一种灵活可靠的工具，可以在研究DC靶向方法中产生具有特殊价值的抗体/抗原偶联物，也包括那些旨在诱导抗肿瘤免疫的方法，特别是在临床前动物模型中。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢S. Prettin的专家技术援助。这项工作得到了亥姆霍兹德国研究中心协会（HGF）的资助，该资助是亥姆霍兹联盟"癌症免疫疗法"（HCC_WP2b）的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al.
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
