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Biology

Organoid-व्युत्पन्न उपकला monolayer: आंत्र बाधा समारोह के लिए एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62074
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

Summary

यहां, हम आंतों की बाधा समारोह, पारगम्यता और परिवहन का अध्ययन करने के लिए मानव ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न आंतों के उपकला मोनोलेयर्स की तैयारी का वर्णन करते हैं। जैसा कि ऑर्गेनोइड्स बाहरी उत्तेजनाओं के लिए मूल उपकला ऊतक प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं, ये मॉडल सेल लाइनों की विस्तारक्षमता और प्राथमिक ऊतक की प्रासंगिकता और जटिलता के फायदों को जोड़ते हैं।

Abstract

अतीत में, आंतों के उपकला मॉडल सिस्टम परिवर्तित सेल लाइनों और प्राथमिक ऊतक तक सीमित थे। इन मॉडल प्रणालियों में अंतर्निहित सीमाएं हैं क्योंकि पूर्व मूल ऊतक शरीर विज्ञान का ईमानदारी से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, और उत्तरार्द्ध की उपलब्धता सीमित है। इसलिए, उनका आवेदन मौलिक और दवा विकास अनुसंधान को बाधित करता है। वयस्क स्टेम-सेल-आधारित ऑर्गेनोइड्स (अब से ऑर्गेनोइड्स के रूप में जाना जाता है) सामान्य या रोगग्रस्त उपकला ऊतक के लघु चित्र हैं जिनसे वे व्युत्पन्न होते हैं। उन्हें विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ क्षेत्रों से बहुत कुशलता से स्थापित किया जा सकता है, दीर्घकालिक विस्तारक्षमता है, और विट्रो में उपचार के लिए ऊतक- और रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अनुकरण करता है। यहां, आंतों के ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला मोनोलेयर्स की स्थापना को उपकला बाधा अखंडता, पारगम्यता और परिवहन, रोगाणुरोधी प्रोटीन स्राव, साथ ही हिस्टोलॉजी को मापने के तरीकों के साथ प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, आंतों के ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर्स को स्टेम और पारगमन-प्रवर्धित कोशिकाओं के साथ-साथ प्रमुख विभेदित उपकला कोशिकाओं के साथ समृद्ध किया जा सकता है। इसलिए, वे एक मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे लक्ष्य कोशिकाओं पर यौगिकों के प्रभावों और उनकी कार्रवाई के तरीके का अध्ययन करने के लिए तैयार किया जा सकता है। यद्यपि ऑर्गेनोइड संस्कृतियां तकनीकी रूप से सेल लाइनों की तुलना में अधिक मांग कर रही हैं, एक बार स्थापित होने के बाद, वे दवा के विकास के बाद के चरणों में विफलताओं को कम कर सकते हैं क्योंकि वे वास्तव में विवो एपिथेलियम जटिलता और इंटरपेशेंट विषमता में प्रतिनिधित्व करते हैं।

Introduction

आंत्र उपकला आंतों की ल्यूमिनल सामग्री और अंतर्निहित ऊतक के बीच एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है। इस बाधा में मुख्य रूप से अवशोषक एंटरोसाइट्स की एक एकल उपकला परत शामिल है जो तंग जंक्शनों से जुड़ी होती है, जो आसन्न कोशिकाओं के बीच मजबूत अंतरकोशिकीय कनेक्शन स्थापित करती है। ये कोशिकाएं एक ध्रुवीकृत उपकला अस्तर बनाती हैं जो आंत के एपिकल (लुमेन) और बेसोलेटरल पक्षों को अलग करती हैं, साथ ही साथ पचे हुए पोषक तत्वों और चयापचयों के परकोशिकीय परिवहन को विनियमित करती हैं। एंटरोसाइट्स के अलावा, अन्य महत्वपूर्ण उपकला कोशिकाएं जैसे कि गोब्लेट, पैनेथ और एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं भी क्रमशः बलगम, रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और हार्मोन का उत्पादन करके आंतों के होमियोस्टैसिस में योगदान करती हैं। आंतों के उपकला को लगातार ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5-पॉजिटिव (एलजीआर 5 +) स्टेम कोशिकाओं को विभाजित करके फिर से भर दिया जाता है, जो आंतों के क्रिप्ट्स के तल में पारगमन-प्रवर्धन (टीए) कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं जो ऊपर की ओर पलायन करते हैं और अन्य सेलप्रकारों में अंतर करते हैं 1। आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों द्वारा आंतों के उपकला होमियोस्टैसिस का विघटन, जैसे कि खाद्य एलर्जी, औषधीय यौगिकों और माइक्रोबियल रोगजनकों के संपर्क में, आंतों की बाधा समारोह के विघटन की ओर जाता है। ये स्थितियां सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), सीलिएक रोग, और दवा-प्रेरित जीआई विषाक्तता 2 सहित कई आंतों की बीमारियों का कारण बनतीहैं।

आंत्र उपकला पर अध्ययन कई इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म सिस्टम जैसे झिल्ली आवेषण, अंगों-ऑन-ए-चिप सिस्टम, यूएसिंग कक्षों और आंतों के छल्ले का उपयोग करके किया जाता है। ये प्लेटफ़ॉर्म झिल्ली के एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों तक पहुंच के साथ ध्रुवीकृत उपकला मोनोलेयर स्थापित करने के लिए उपयुक्त हैं, मॉडल के रूप में परिवर्तित सेल लाइनों या प्राथमिक ऊतक का उपयोग करते हैं। यद्यपि परिवर्तित सेल लाइनें, जैसे कोलोरेक्टल (एडेनो) कार्सिनोमा सेल लाइनें कैको -2, टी 84, और एचटी -29, ध्रुवीकृत आंतों के एंटरोसाइट्स या बलगम-उत्पादक कोशिकाओं में कुछ हद तक अंतर करने में सक्षम हैं, वे विवो एपिथेलियम के प्रतिनिधि नहीं हैं क्योंकि कई सेल प्रकार गायब हैं, और विभिन्न रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टरों को अस्पष्ट रूप से व्यक्त किया जाताहै 3 . इसके अलावा, चूंकि सेल लाइनें एक ही दाता से प्राप्त होती हैं, वे अंतर-रोगी विषमता का प्रतिनिधित्व नहीं करती हैं और कम जटिलता और शारीरिक प्रासंगिकता से पीड़ित होती हैं। यद्यपि यूएसिंग कक्षों में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक ऊतक और आंतों के छल्ले विवो स्थिति के अधिक प्रतिनिधि हैं, उनकी सीमित उपलब्धता, अल्पकालिक व्यवहार्यता, और विस्तार की कमी उन्हें उच्च-थ्रूपुट (एचटी) अध्ययनों के लिए एक माध्यम के रूप में अनुपयुक्त बनाती है।

ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो उपकला संस्कृतियों में आंत, गुर्दे, यकृत, अग्न्याशय और फेफड़ों जैसे विभिन्न अंगों से स्थापित होते हैं। वे दीर्घकालिक, स्थिर विस्तार के साथ-साथ आनुवंशिक और फेनोटाइपिक स्थिरता के लिए साबित होते हैं और इसलिए बाहरी उत्तेजनाओं के लिए वफादार प्रतिक्रियाओं के साथ मूल अंग के उपकला के प्रतिनिधि जैविक लघुचित्र हैं 4,5,6,7,8,9। ऑर्गेनोइड्स को या तो उच्छेदन या बायोप्सी किए गए सामान्य, रोगग्रस्त, सूजन, या कैंसर ऊतक से कुशलतापूर्वक स्थापित किया जाता है, जो विषम रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करता है 10,11,12,13,14,15,16। यह पेपर दर्शाता है कि ऑर्गेनोइड संस्कृतियों से व्युत्पन्न आंतों के उपकला मोनोलेयर्स को कैसे स्थापित किया जाए। मोनोलेयर्स को छोटी आंतों के साथ-साथ कोलोनिक और रेक्टल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों से सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है। यह मॉडल दवाओं के लिए उपकला कोशिकाओं के परिवहन और पारगम्यता के साथ-साथ उपकला पर उनके विषाक्त प्रभावों का अध्ययन करने का अवसर बनाता है। इसके अलावा, मॉडल प्रतिरक्षा कोशिकाओं और बैक्टीरिया के साथ सह-संस्कृति को आंतों के उपकला17,18,19 के साथ अपनी बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग रोगी-विशिष्ट तरीके से उपचारों के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने और उपकला बाधा-केंद्रित चिकित्सीय की अगली लहर की तलाश के लिए स्क्रीनिंग प्रयासों को शुरू करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के दृष्टिकोण को क्लिनिक तक बढ़ाया जा सकता है और व्यक्तिगत उपचार की ओर मार्ग प्रशस्त किया जा सकता है।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल में उपकला मोनोलेयर्स मानव सामान्य आंतों के ऑर्गेनोइड्स से तैयार किए जाते हैं, प्रोटोकॉल को अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के लिए लागू और अनुकूलित किया जा सकता है। उपकला organoid monolayers आंतों organoid विस्तार माध्यम में सुसंस्कृत कर रहे हैं WNT युक्त स्टेम सेल प्रसार का समर्थन करने के लिए और आंत्र क्रिप्ट सेलुलर संरचना का प्रतिनिधित्व करते हैं. आंतों के ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न आंतों के उपकला भाग्य, जैसे एंटरोसाइट्स, पैनेथ, गोब्लेट और एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया जा सकता है, जो WNT, Notch, और epidermal growth factor (EGF) मार्गों को मॉड्युलेट करके। यहां, विस्तार माध्यम में मोनोलेयर की स्थापना के बाद, वे अधिक विभेदित आंतों के उपकला कोशिकाओं की ओर प्रेरित होते हैं, जैसा कि पहले वर्णित है 20,21,22,23,24,25। स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए, ब्याज के यौगिक, इसकी लक्ष्य कोशिकाओं और प्रयोगात्मक स्थितियों की कार्रवाई के मोड के आधार पर, मोनोलेयर्स को प्रासंगिक कार्यात्मक रीडआउट के साथ यौगिक के प्रभावों को मापने के लिए पसंद की सेलुलर संरचना की ओर प्रेरित किया जा सकता है।

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Protocol

1. संस्कृति के लिए अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: एक biosafety कैबिनेट के अंदर सभी चरणों का प्रदर्शन करें और सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए मानक दिशानिर्देशों का पालन करें। पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग जैव सुरक्षा कैबिनेट शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए किया जाता है। उपयोग से पहले और बाद में, जैव सुरक्षा कैबिनेट की सतह को 70% इथेनॉल में भीगने वाले टिशू पेपर के साथ साफ किया जाता है। एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) की तीन-आयामी बूंदों के गठन की सुविधा के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में तैयार 96-, 24-, और 6-वेल प्लेटों का एक पूर्वव्यापी स्टॉक रखें।

  1. बेसल माध्यम तैयारी
    1. बेसल माध्यम (बीएम) को हैम के पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (एडी-डीएफ) मध्यम बोतल के साथ 500 एमएल उन्नत ड्यूलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में 200 एमएम ग्लूटामाइन के 5 एमएल, 1 एम 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथिल) के 5 एमएल-1पिपराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), और 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) समाधान (10,000 यू / एमएल) समाधान (10,000 यू / एमएल) जोड़कर तैयार करें। इसे रेफ्रिजरेटर में कम से कम 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. WNT स्रोत
    1. पहले से वर्णित विधि26 के अनुसार WNT3a-वातानुकूलित माध्यम (WNT3aCM) तैयार करें।
      नोट: हाल ही में, एक अगली पीढ़ी के सरोगेट WNT (NGS-WNT), जो मानव आंतों organoids के विस्तार का भी समर्थन करता है,27 उत्पन्न किया गया है।
  3. आंत्र organoid आधार मध्यम तैयारी
    नोट: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सभी विकास कारकों और अभिकर्मकों का उपयोग करें। छोटे ऐलीकोट का उपयोग करें और फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों से बचें; कार्यात्मक विकास कारक सफल ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए आवश्यक हैं।
    1. 1 μM A83-01, 2.5 mM N-acetylcysteine, 2x B27 पूरक, 100 ng / mL मानव एपिडर्मल विकास कारक (hEGF), 10 nM गैस्ट्रिन, 200 ng / mL hNoggin, और 100 μg / mL प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक रोगाणुरोधी सूत्रीकरण के 100 μg / mL के साथ बीएम के पूरक द्वारा केंद्रित 2x आंतों के ऑर्गेनोइड बेस माध्यम (2x आईबीएम) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 2x IBM को एलीकोट करें और 4 महीने तक -20 °C पर फ्रीज करें। जब आवश्यक हो, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान (आरटी) पर कई घंटों के लिए रात भर एक एलीकोट पिघलाएं।
    3. आंत्र ऑर्गेनोइड विस्तार माध्यम (आईईएम) तैयार करने के लिए, या तो 50% WNT3aCM या 50% BM और 0.5 nM NGS-WNT, 250 ng / mL मानव Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM निकोटिनामाइड, और 10 μM SB202190 के साथ 2x IBM को पूरक करें।
  4. आंत्र organoid विभेदन मध्यम तैयारी
    1. 50% BM, 250 ng / mL hRspo3, और 1.5 μM WNT Pathway inhibitor (IWP-2) के साथ 2x IBM को पूरक करके enterocyte differentiation medium (eDM) तैयार करें। 10 दिनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ईडीएम स्टोर करें।
    2. या तो 40% BM और 10% WNT3aCM या 50% BM और 0.1 nM NGS-WNT, 250 ng/ mL hRspo3, 10 μM DAPT और 100 nM PD0325901 के साथ 2x IBM पूरक द्वारा संयोजन विभेदन माध्यम (cDM) तैयार करें। 10 दिनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर cDM स्टोर करें।
  5. बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) का हेरफेर
    नोट:: निर्माता की सिफारिश के अनुसार बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ECM) ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
    1. बर्फ पर रात भर ईसीएम पिघलना; बोतल से ईसीएम को 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, दोनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा किया गया था। -20 डिग्री सेल्सियस पर केवल एक बार एलीकोट को फिर से फ्रीज करें। एक बार पिघलने के बाद, ईसीएम को 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें। उपयोग करने से पहले बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: ईसीएम को ठीक से मिलाएं और सुनिश्चित करें कि क्रिप्ट्स या ऑर्गेनोइड्स एम्बेड करने से पहले यह ठंडा है।

2. Organoid संस्कृतियों

  1. जमे हुए organoids से संस्कृतियों की स्थापना
    नोट: बीएम को आरटी तक पहुंचने दें, और 12 एमएल ऐलीकोट रखें, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया, जमे हुए ऑर्गेनोइड्स युक्त एक क्रायोवियल को पिघलाने की प्रक्रिया शुरू करने से पहले तैयार हो।
    1. ऑर्गेनोइड क्रायोवियल को तेजी से पिघलाएं 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में आंदोलन करके जब तक कि केवल बर्फ का एक स्लीवर न रह जाए। तुरंत क्रायोवियल में गर्म बीएम ड्रॉपवाइज के 500 μL जोड़ें, और ठंड माध्यम को पतला करने और सामग्री को ध्यान से मिलाने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    2. एक P1000 पिपेट का उपयोग करते हुए, ऑर्गेनोइड्स को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ट्यूब के नीचे धीरे-धीरे मिश्रण करते हुए गर्म बीएम ड्रॉपवाइज का एक और 1 एमएल जोड़ें। ठंड माध्यम को पतला करने और सामग्री को ध्यान से मिलाने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    3. ऑर्गेनोइड्स युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में गर्म बीएम ड्रॉपवाइज के 12 एमएल तक जोड़ें, और ऑर्गेनोइड्स को धीरे से फिर से निलंबित करने के लिए 10 एमएल बाँझ पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपेट करें।
    4. 85 × g और 8 °C पर 5 मिनट के लिए ऑर्गेनोइड निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। गोली को परेशान किए बिना supernatant को ध्यान से त्यागें, और 10 μM Y27632 या अन्य rho-associated coiled-coil-forming protein serine / threonine kinase inhibitor (ROCK inhibitor) के साथ पूरक IEM के 30% v / v में organoids को फिर से निलंबित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    5. ऑर्गेनोइड्स युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ईसीएम का 70% v / v जोड़ें। बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को रखते हुए ऑर्गेनोइड निलंबन को मिलाएं, और घनत्व की जांच करने के लिए निलंबन के बीज 5 μL (चित्रा 1 ए)। यदि घनत्व उपयुक्त है तो चढ़ाना जारी रखें; यदि घनत्व बहुत अधिक है, तो क्रमशः 30-70% v/v के समान अनुपात में अधिक IEM/ECM समाधान जोड़ें।
    6. एक prewarmed 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में, बीज 50 μL organoid निलंबन के 50 μL 10 μL (चित्रा 1B) की 5 अलग बूँदें pipetting द्वारा. प्लेट को उल्टा करें, और इसे 5 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में छोड़ दें। प्लेट को अभी भी 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उल्टा स्थानांतरित करें, और इसे एक और 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 μM रॉक अवरोधक के साथ आईईएम के 500 μL जोड़ें, और इनक्यूबेटर के लिए प्लेट हस्तांतरण। विकास की निगरानी करने के लिए नियमित रूप से एक बूंद छवि, और पुराने माध्यम को एस्पिरेट करके और ताजा आईईएम के 500 μL जोड़कर हर 2-3 दिनों में आईईएम को ताज़ा करें।
    8. ऑर्गेनोइड्स को पारित करें एक बार जब वे पिघलने से ठीक हो जाते हैं और संसाधित होने के लिए सही आकार तक पहुंच जाते हैं (चित्रा 1 सी), जैसा कि अनुभाग 2.2 में वर्णित है।
  2. आंत्र ऑर्गेनोइड्स का पासिंग
    नोट: कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर ईसीएम ठंडा करें, और उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए आईईएम को आरटी पर रखें।
    1. एक संस्कृति से माध्यम का उपयोग अच्छी तरह से एक 1250 μL कम प्रतिधारण फ़िल्टर-टिप का उपयोग करके ऑर्गेनोइड गुंबदों को तोड़ने के लिए करें, और अच्छी तरह से सामग्री को लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। बीएम के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से धोएं, और इसे उसी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. अन्य सभी कुओं के साथ चरण 2.2.1 और 2.2.2 को दोहराएं (अधिकतम आधा प्लेट या ईसीएम बूंदों के 600 μL को धोया जा सकता है और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ा जा सकता है)।
    3. 12 मिलीलीटर तक ट्यूब को भरने के लिए बीएम जोड़ें, और 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10x ऊपर और नीचे पिपेट करें। 85 × g पर 8 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    4. बीएम को हटाने से पहले, यह देखने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि क्या सभी ऑर्गेनोइड्स 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा 1 डी) के नीचे छर्रे हैं। यदि ऑर्गेनोइड गोली या ईसीएम परत को ओवरलेइंग नहीं है, तो या तो साफ है या इसमें केवल मलबे, एकल कोशिकाएं, या पैलेट ऑर्गेनोइड्स की तुलना में बहुत कम ऑर्गेनोइड्स शामिल हैं, तो supernatant को एस्पिरेट करें और ईसीएम को बाहर निकाल दें और पी 200 पिपेट का उपयोग करके ऑर्गेनोइड गोली को बहुत सावधानी से ओवरले करने के लिए ईसीएम को बाहर निकालें।
      नोट: Organoids ईसीएम में फंस सकते हैं और कम centrifugation बल के कारण एक कॉम्पैक्ट गोली के रूप में तलछट नहीं करते हैं। यदि ईसीएम में ऑर्गेनोइड्स होते हैं, तो ट्यूब को 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × जी पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें, और 2.2.4 में वर्णित supernatant को सावधानीपूर्वक हटा दें। यदि कई 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब हैं, तो उन्हें चरण 2.2.4 के बाद पूल किया जा सकता है।
    5. प्रत्येक गोली के लिए बीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें (50-200 μL की मात्रा का, ऑर्गेनोइड संस्कृति और घनत्व के आधार पर), और ध्यान से फिर से निलंबित करें। उन्हें कतरनी करने के लिए कम से कम 5x पर ऑर्गेनोइड्स को ऊपर और नीचे पाइप करें, फोम गठन से बचें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांचकरें कि क्या ऑर्गेनोइड्स बाधित हैं (चित्रा 2 ए)। यदि ऑर्गेनोइड्स बाधित होते हैं, तो चरण 2.2.7 पर आगे बढ़ें; यदि ऑर्गेनोइड्स बाधित नहीं होते हैं, तो उन्हें एक और 5x पाइप करें। इस बार, ऑर्गेनोइड्स को बाधित करने के लिए अधिक यांत्रिक बल लगाने के लिए पिपेट टिप के साथ प्लास्टिक ट्यूब की दीवार को स्पर्श करें।
      नोट: सिस्टिक (चित्रा 1 C) और नवोदित (चित्रा 1E) ऑर्गेनोइड्स की यांत्रिक कर्तन या तो 200 μL या 10 μL प्लास्टिक पिपेट टिप के साथ संभव है जो कम-प्रतिधारण 1250 μL फ़िल्टर-टिप (चित्रा 1F) पर फिट होती है, जो ऑर्गेनोइड्स को बाधित करने के लिए आवश्यक मात्रा पर निर्भर करती है। एक संकुचित ग्लास पिपेट (चित्रा 1 एफ) के उपयोग की सिफारिश की जाती है जब ऑर्गेनोइड्स युक्त ईसीएम के 200 μL से अधिक संसाधित होते हैं (6-अच्छी तरह से प्लेट का एक अच्छी तरह से या 24-अच्छी तरह से प्लेट के 4 कुओं का एक अच्छी तरह से)।
    6. माइक्रोस्कोप के नीचे फिर से जांचें कि क्या ऑर्गेनोइड्स बाधित हैं। यदि बाधित होता है, तो अगले चरण के साथ आगे बढ़ें; यदि नहीं, तो 20x तक ऑर्गेनोइड्स को पाइप करें, नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे ऑर्गेनोइड्स की जांच करें। यदि ऑर्गेनोइड्स अभी भी बाधित नहीं होते हैं, तो निलंबन में 25% वी / वी सेल पृथक्करण अभिकर्मक 1 ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें, और 20x तक ऑर्गेनोइड्स को पाइप करें, यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स की जांच करें कि वे एकल कोशिकाओं को पचा नहीं रहे हैं।
    7. 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब में बीएम के 12 मिलीलीटर तक जोड़ें, और ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके ऑर्गेनोइड पैलेट को धोएं। 85 × g पर 8 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। supernatant को छोड़ दें, और ऑर्गेनोइड गोली के लिए IEM और ECM जोड़कर 70% v / v ECM के लिए अंतिम एकाग्रता को समायोजित करें।
    8. passaging के लिए एकत्र IEM / ECM की दोगुनी मात्रा के साथ organoid गोली resuspending शुरू करें, और घनत्व की जांच करने के लिए निलंबन के बीज 5 μL। यदि घनत्व उपयुक्त है तो चढ़ाना जारी रखें (चित्रा 2 बी); घनत्व बहुत अधिक है, तो अधिक IEM/ECM समाधान जोड़ें। एक prewarmed 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए निलंबन के 200 μL जोड़ें, 10 μL मात्रा की अलग बूँदें बनाने.
    9. प्लेट को उल्टा करें, और इसे 5 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में छोड़ दें। प्लेट को अभी भी 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उल्टा स्थानांतरित करें, इसे एक और 30 मिनट के लिए छोड़ दें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 μM रॉक अवरोधक के साथ आईईएम के 2 एमएल जोड़ें, और इनक्यूबेटर के लिए प्लेट स्थानांतरित।
    10. विकास की निगरानी करने के लिए नियमित रूप से एक बूंद की छवि, और पुराने माध्यम को एस्पिरेट करके और ताजा आईईएम के 2 एमएल जोड़कर हर 2-3 दिनों में आईईएम को ताज़ा करें।
  3. उपकला मोनोलेयर तैयारी के लिए आंतों के organoids के passaging
    1. एक अपवाद के साथ धारा 2.2 में वर्णित एक ही पासिंग प्रोटोकॉल का पालन करके मोनोलेयर तैयारी के लिए कटाई से 3 दिन पहले मार्ग ऑर्गेनोइड्स। चरण 2.2.7 में, 1-1.5x में ऑर्गेनोइड्स को आईईएम / ईसीएम की शुरुआती मात्रा को पुन: निलंबित कर दिया जाता है ताकि एक उच्च घनत्व और विस्तार क्षमता हो जब उन्हें मोनोलेयर तैयारी के लिए काटा जाता है (चित्रा 3 ए)।

3. उपकला मोनोलेयर तैयारी

  1. संस्कृति उपकला monolayers दोनों पर 24-अच्छी तरह से और 96-अच्छी तरह से झिल्ली आवेषण उपलब्ध प्लेट प्रकारों की एक किस्म के साथ (तालिका 1). दोनों आकारों के लिए उच्च-थ्रूपुट सिस्टम (एचटीएस) झिल्ली आवेषण का उपयोग करें क्योंकि इनमें झिल्ली आवेषण और एक रिसीवर प्लेट के साथ एक अभिन्न ट्रे होती है। 24-अच्छी तरह से प्रारूप के लिए, अलग-अलग हटाने योग्य झिल्ली आवेषण के साथ प्लेटों का उपयोग भी संभव है।
    नोट: विभिन्न झिल्ली प्रकार (polyethylene terephthalate (PET) या polycarbonate) और रंध्र आकार (0.4-8.0 μm) उपलब्ध हैं और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। मोनोलेयर्स को केवल ब्राइटफील्ड द्वारा चित्रित किया जा सकता है जब पीईटी झिल्ली के साथ आवेषण का उपयोग किया जाता है। प्रकाश-तंग झिल्ली एपिकल से बेसोलेटरल डिब्बे तक फ्लोरोसेंट प्रकाश रिसाव को अवरुद्ध करती है और इस पर विचार किया जा सकता है जब गतिशील परिवहन या फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सब्सट्रेट ्स की पारगम्यता का अध्ययन किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल 24-अच्छी तरह से झिल्ली आवेषण का उपयोग करता है; 96-अच्छी तरह से झिल्ली आवेषण के लिए अनुकूलन अनुभाग 5 में वर्णित हैं। घनत्व, आकृति विज्ञान, और organoids के आकार के आधार पर (चित्रा 3A), एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के 6 कुओं (के रूप में खंड 2.3 में seeded) झिल्ली आवेषण की एक पूरी 24 अच्छी तरह से प्लेट सीडिंग के लिए पर्याप्त हैं।
  2. कोटिंग झिल्ली ECM के साथ आवेषण
    नोट:: यदि पर्याप्त कक्ष होने के बारे में संदेह है, तो कक्षों की गिनती करने के बाद आवेषण कोट करें। यह अनावश्यक कोटिंग और महंगी झिल्ली आवेषण के नुकसान को रोकने के लिए है।
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में समर्थन प्लेट में झिल्ली आवेषण रखें। बर्फ-ठंडे Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) Ca 2 +और Mg 2 + के साथ, और प्रत्येक सम्मिलित करें के एपिकल डिब्बे में पतला ECM के 150 μL पिपेट में ECM 40x को पतला करें। प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. सीडिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में सेल पृथक्करण अभिकर्मक 2 के प्रीवार्म एलीकोट। एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए अभिकर्मक के 2 मिलीलीटर तैयार करें।
    2. इनक्यूबेटर से बायोसेफ्टी कैबिनेट में ऑर्गेनोइड्स (अनुभाग 2.3 में तैयार) वाले संस्कृति प्लेट को स्थानांतरित करें। 2.2.1.-2.2.4 चरणों में वर्णित के रूप में organoids, संसाधित करें। एक ट्यूब में कई ट्यूब पूल मत करो।
    3. ट्यूब को भरें, जिसमें 6-अच्छी तरह से प्लेट के अधिकतम 3 कुओं से ऑर्गेनोइड्स होते हैं, डीपीबीएस के साथ 12 मिलीलीटर तक (सीए2 + और एमजी2 + के बिना), और 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10x को ऊपर और नीचे पाइपेट करें। 85 पर सेंट्रीफ्यूज 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जी ×, और ऑर्गेनोइड गोली को परेशान किए बिना supernatant aspirate।
    4. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 2 mL prewarmed सेल पृथक्करण अभिकर्मक 2 के जोड़ें प्रारंभिक सामग्री और resuspend के रूप में इस्तेमाल किया. ट्यूब के तल पर ऑर्गेनोइड्स के डूबने को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए ट्यूबों को तिरछे या क्षैतिज रूप से इनक्यूबेट करें।
    5. एक 5 mL बाँझ प्लास्टिक पिपेट या एक P1000 पिपेट का उपयोग करके 10x ऊपर और नीचे पिपेट, सेल पृथक्करण अभिकर्मक की कुल मात्रा के आधार पर, पिपेट। माइक्रोस्कोप के नीचे ऑर्गेनोइड निलंबन की जांच करें यह देखने के लिए कि क्या एकल कोशिकाओं और 2-4 कोशिकाओं से मिलकर कुछ सेल क्लंप का मिश्रण बना है (चित्रा 3 बी)। यदि आवश्यक हो, तो चरण 3.3.4-3.3.5 को दोहराकर पाचन जारी रखें (सेल पृथक्करण अभिकर्मक की मात्रा में वृद्धि न करें) जब तक कि मिश्रण चित्रा 3 बी के समान न दिखे।
      नोट: एकल कोशिकाओं के लिए पूरी तरह से organoids को पचाने से बचें। कोशिकाओं के कुछ छोटे समूहों (यानी, 2-4 कोशिकाओं के समूह) होना आवश्यक है।
    6. सेल निलंबन के लिए 10 μM ROCK अवरोधक सहित बीएम के 12 मिलीलीटर तक जोड़कर सेल पृथक्करण रोकें। 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × जी पर सेंट्रीफ्यूज, और सेल पैलेट को परेशान किए बिना supernatant aspirate। कई 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में एक ही ऑर्गेनोइड संस्कृति को संभालते समय, सेल छर्रों को पूल करें और उन्हें बीएम के 12 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
    7. बीएम के साथ पूर्वनिर्धारित 40 μm छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें, और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से फसल करें। बीएम के 10 मिलीलीटर के साथ छलनी को धोएं, और एक ही 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह-थ्रू की कटाई करें।
    8. तनावपूर्ण सेल निलंबन को दो नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 × जी पर सेंट्रीफ्यूज, और सेल पैलेट को परेशान किए बिना supernatant aspirate। IEM के 4 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया, जो प्रारंभिक सामग्री के रूप में उपयोग की जाने वाली पूर्ण संस्कृति प्लेट प्रति 10 μM ROCK अवरोधक के साथ पूरक है।
    9. गिनती के लिए ट्रिपैन नीले रंग के साथ 1: 1 अनुपात में सेल निलंबन की एक छोटी राशि मिलाएं। लाइव की गणना करें, नीले नहीं, कोशिकाओं (चित्रा 3 C), और लाइव कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। छोटे clumps में, प्रत्येक व्यक्तिगत सेल की गिनती करें।
    10. 10 μM ROCK अवरोधक के साथ पूरक IEM के प्रति mL 3 × 106 जीवित कोशिकाओं से युक्त एक सेल निलंबन तैयार करें।
  4. पॉलिएस्टर झिल्ली आवेषण पर सीडिंग कोशिकाओं
    1. ईसीएम-लेपित आवेषण (चरण 3.2.1) से सावधानीपूर्वक एस्पिरेट DPBS, जबकि प्लेट को क्षैतिज रूप से रखते हुए। प्रत्येक basolateral डिब्बे में रॉक अवरोधक के साथ पूरक आईईएम के Pipet 800 μL. एपिकल कम्पार्टमेंट ड्रॉपवाइज में ईसीएम-लेपित झिल्ली पर चरण 3.3.10 में तैयार सेल निलंबन के पिपेट 150 μL। प्रति प्लेट, केवल बीएम के साथ कम से कम एक "रिक्त" अच्छी तरह से सुनिश्चित करें।
    2. एक बार जब कोशिकाएं झिल्ली पर तलछट हो जाती हैं, तो ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) को मापें, जैसा कि अनुभाग 4.1 में वर्णित है, और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके झिल्ली को प्रतिबिंबित करता है। प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें। हर दिन टीईईआर को मापें, और मोनोलेयर गठन की निगरानी के लिए नियमित रूप से छवियों को प्राप्त करें (चित्रा 4 ए-डी)।
  5. मोनोलेयर ताज़ा कर रहा है
    नोट: हर 2-3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें, कोशिकाओं के ऊपर एक सकारात्मक हाइड्रोस्टेटिक दबाव बनाए रखने के लिए निम्नलिखित क्रम का पालन करें और कोशिकाओं को झिल्ली से धक्का देने से रोकें। माध्यम को ताज़ा करते समय, सुनिश्चित करें कि मोनोलेयर, जो माध्यम की आकांक्षा पर दिखाई देता है, पिपेट टिप से क्षतिग्रस्त नहीं होता है।
    1. झिल्ली आवेषण युक्त प्लेट के basolateral डिब्बों से माध्यम निकालें। फिर, ध्यान से झिल्ली आवेषण के एपिकल डिब्बों से माध्यम aspirate.
    2. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में ताजा आईईएम ड्रॉपवाइज के 150 μL जोड़ें, और फिर प्रत्येक बेसोलेटरल डिब्बे में ताजा आईईएम के 800 μL जोड़ें।
  6. वांछित आंत्र उपकला सेल प्रकारों के लिए मोनोलेयर का संवर्धन
    1. मोनोलेयर को IEM में confluent बनने की अनुमति दें, जो लगभग 100 Ω · सेमी² के TEER मान के अनुरूप है (जैसा कि चरण 4.1.1.4 में गणना की गई है)। यह निर्धारित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि मोनोलेयर्स पूरी तरह से गठित हो गए हैं (चित्रा 4 डी) और छेद की अनुपस्थिति के लिए (जैसा कि चित्र 4 बी, सी में देखा गया है)।
    2. झिल्ली आवेषण के बेसोलेटरल और एपिकल डिब्बों से आईईएम को सावधानीपूर्वक हटा दें, और अनुभाग 1.4 में तैयार किए गए ईडीएम या सीडीएम के साथ बदलें। ऑर्गेनोइड कोशिकाओं को वांछित विशिष्ट सेल प्रकार से समृद्ध करने के लिए विशिष्ट विभेदन माध्यम में एक और 3-4 दिनों के लिए मोनोलेयर को संस्कृति करें। अनुभाग 3.4 में वर्णित के अनुसार, माध्यम को हर 2-3 दिनों में ताज़ा करें.
    3. दैनिक TEER को मापें, और यदि वांछित हो तो नियमित रूप से छवियों को प्राप्त करें (चित्रा 5A-C)।
      नोट: TEER मान जो इंगित करता है कि एक पूरी तरह से संगठित समृद्ध मोनोलेयर प्रति ऑर्गेनोइड संस्कृति बदलता है; आमतौर पर TEER मान 600 तक बढ़ जाते हैं और विभेदन मीडिया में 3 दिनों के बाद 1000 Ω · सेमी2 (जैसा कि चरण 4.1.1.4 में गणना की गई है) तक बढ़ सकते हैं और 3-5 दिनों के लिए स्थिर होते हैं।

4. उपकला monolayer परख readouts

  1. Transepithelial electrical resistance (TEER)
    नोट: टीईईआर माप व्यापक रूप से शारीरिक बाधाओं के जैविक मॉडल में तंग जंक्शन गतिशीलता और बाधा समारोह अखंडता का विश्लेषण करने के लिए एक विधि के रूप में स्वीकार किए जाते हैं, जैसे कि उपकलामोनोलेयर28,29। तंग जंक्शनों पर सेलुलर इंटरैक्शन में वृद्धि के कारण भेदभाव के बाद टीईईआर में वृद्धि को एक मैनुअल टीईईआर मीटर या एक स्वचालित टीईईआर माप रोबोट का उपयोग करके मापा जा सकता है।
    1. मैन्युअल TEER मीटर का उपयोग करके TEER का मापन
      1. 70% इथेनॉल के साथ इलेक्ट्रोड को साफ करें, और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर हवा से सूखने दें। इलेक्ट्रोड को BM युक्त ट्यूब में रखें। इलेक्ट्रोड को मैन्युअल TEER मीटर से कनेक्ट करें। ओम (Ω) में मापने के लिए फ़ंक्शन स्विच को चालू करें। पावर स्विच चालू करें.
      2. सम्मिलित करने के एपिकल डिब्बे में छोटे इलेक्ट्रोड को रखें, जबकि लंबे इलेक्ट्रोड को बैसोलेटरल कम्पार्टमेंट (चित्रा 6 ए) में तैनात किया गया है। मोनोलेयर को छूने से बचें।
      3. रिक्त कुएं (आररिक्त) में प्रतिरोध को मापें, और फिर शेष नमूनों (आरनमूना) को उसी तरह से मापें। विभिन्न स्थितियों के साथ नमूनों के बीच बीएम के साथ इलेक्ट्रोड धोएं। पहले डेमी पानी के साथ इलेक्ट्रोड को साफ करें और फिर 70% इथेनॉल के साथ और इसे हवा से सूखने दें।
      4. TEER (Ω·cm2) की गणना करें: [Rनमूना (Ω) - Rरिक्त (Ω)] × झिल्ली क्षेत्र (सेमी2) (तालिका 1 और चित्र6B)।
    2. एक स्वचालित TEER माप रोबोट का उपयोग कर TEER का मापन (सामग्री की तालिका)
      1. झिल्ली आवेषण युक्त 96-अच्छी तरह से और 24-अच्छी तरह से एचटीएस प्लेटों के लिए एचटीएस सिस्टम का उपयोग करते समय स्वचालित टीईईआर माप करें। दोनों प्रकारों के लिए टीईईआर माप के लिए अलग-अलग इलेक्ट्रोड का उपयोग करें (24- और 96- एचटीएस झिल्ली आवेषण)। एक स्वचालित TEER माप रोबोट का उपयोग कर TEER को मापने के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  2. उपकला बाधा अखंडता और पारगम्यता का मापन
    नोट: यह प्रोटोकॉल मोनोलेयर अखंडता के संकेत के रूप में एपिकल से बेसोलेटरल डिब्बे तक लूसिफर पीला पारगम्यता का परिचय देता है। यह खंड मोनोलेयर पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए 1 ज इनक्यूबेशन चरण के बाद बेसोलेटरल डिब्बे में प्रतिदीप्ति माप का वर्णन करता है और इस प्रकार, बाधा अखंडता। यह माप एक अंत बिंदु परख है और विशेष रूप से उपयोगी है जब बाधा अखंडता पर उनके प्रभाव के लिए यौगिकों का परीक्षण.
    1. बर्फ पर लूसिफर पीला थाव, और बीएम को आरटी के लिए संतुलित करने दें। झिल्ली आवेषण की एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, बीएम में 60 μM लूसिफर पीला के काम करने वाले समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करें।
      नोट: लूसिफर पीला प्रकाश-संवेदनशील है। अंधेरे 1.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों में dilutions तैयार करें और biosafety कैबिनेट प्रकाश बंद के साथ सभी चरणों का प्रदर्शन।
    2. ध्यान से झिल्ली आवेषण के basolateral और एपिकल डिब्बों से माध्यम को हटा दें, जैसा कि चरण 3.5.1 में वर्णित है। यदि वांछित हो, तो क्षतिग्रस्त बाधा के माध्यम से लूसिफर पीले रिसाव के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक पिपेट टिप का उपयोग करके एक अनुपचारित मोनोलेयर को खरोंचें।
    3. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में 60 μM लूसिफर पीला के साथ बीएम के 150 μL जोड़ें, और प्रत्येक basolateral डिब्बे में लूसिफर पीले रंग के बिना बीएम के 800 μL जोड़ें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 50 आरपीएम पर 60 मिनट के लिए शेकर पर रखें।
    4. इस बीच, चरण 4.2.1 में तैयार किए गए कार्य समाधान के साथ शुरू होने वाले बीएम में लूसिफर येलो का एक मानक वक्र तैयार करें। प्रत्येक चरण में 1: 3 को पतला करें जब तक कि 3 एनएम की एकाग्रता तक नहीं पहुंच जाता है। एक नकारात्मक नियंत्रण (केवल BM) शामिल करें।
    5. एक 96 अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट के लिए तीन प्रतियों में प्रत्येक मानक के 100 μL स्थानांतरण। 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, झिल्ली आवेषण को हटा दें और प्रत्येक बेसोलेटरल से 100 μL अच्छी तरह से स्थानांतरित करें (चरण 4.2.3) 96-अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट में तीन गुना में। 430 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 530 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक प्लेट रीडर का उपयोग करके प्लेट के प्रतिदीप्ति को मापें।
    6. नकारात्मक नियंत्रण मान (केवल BM) के लिए सही करने के बाद, बेसोलेटरल डिब्बे (अंतिम रिसीवर एकाग्रता (μM)) में लूसिफर पीला एकाग्रता की गणना करने के लिए मानक वक्र मानों का उपयोग करें।
    7. निम्नलिखित सूत्र (चित्रा 6C) के अनुसार स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (Papp) की गणना करें:
      Equation 1
    8. झिल्ली आवेषण युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, निम्न सूत्र का उपयोग करें:
      Equation 2
  3. मोनोलेयर्स को ठीक करना और हिस्टोलॉजी के लिए पैराफिन ब्लॉक तैयार करना
    नोट: उपकला monolayers उनके सेलुलर संरचना, polarity, और इस तरह के जंक्शनल प्रोटीन, प्रसार, या भेदभाव मार्करों के रूप में ब्याज के विभिन्न प्रोटीन की अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए हिस्टोलॉजिक धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह अनुभाग हिस्टोलॉजिक स्टेनिंग के लिए पैराफिन ब्लॉक तैयारी का वर्णन करता है।
    1. सावधानीपूर्वक झिल्ली आवेषण के basolateral और एपिकल डिब्बों से माध्यम निकालें, जैसा कि चरण 3.5.1 में वर्णित है।
    2. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में DPBS के 150 μL (Ca2+ और Mg2+ के बिना) और प्रत्येक बेसोलेटरल डिब्बे में 800 μL जोड़कर मोनोलेयर्स को धोएं। ध्यान से DPBS फिर से aspirate, पहले basolateral डिब्बे से और फिर एपिकल डिब्बे से.
      नोट:: basolateral डिब्बे पर इस चरण से खाली रहेगा।
    3. एक धुएं हुड में, प्रत्येक एपिकल डिब्बे में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का 150 μL जोड़ें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस चरण के बाद से, एक धुएं हुड के अंदर इस खंड में सभी क्रियाओं को निष्पादित करें, क्योंकि पैराफॉर्मेल्डिहाइड विषाक्त है।
    4. झिल्ली आवेषण के एपिकल डिब्बों से फिक्सेटिव को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, और इसे तरल हैलोजन अपशिष्ट के रूप में निपटाएं।
      नोट: इस चरण के बाद से, तरल हैलोजन अपशिष्ट के रूप में सभी तरल अपशिष्ट का निपटान करें।
    5. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में डीपीबीएस के 200 μL (Ca 2 +और Mg 2 + के बिना) जोड़कर मोनोलेयर्स को धोएं, और DPBS को फिर से ध्यान से एस्पिरेट करें। इस चरण को एक बार और दोहराएँ.
    6. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में 25% एथिल अल्कोहल (ईटीओएच) के 200 μL जोड़ें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 15 मिनट के बाद, ध्यान से झिल्ली आवेषण के एपिकल डिब्बों से 25% EtOH aspirate. 50% EtOH समाधान के साथ और बाद में 70% EtOH समाधान के साथ दोहराएं।
    7. प्रत्येक एपिकल डिब्बे में 70% EtOH के 200 μL जोड़ें, और पैराफिल्म के साथ प्लेट लपेटें। इसे आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. ध्यान से 70% EtOH aspirate, और ध्यान से आवेषण से मोनोलेयर झिल्ली में कटौती करने के लिए एक scalpel का उपयोग करें। सम्मिलित करने के किनारे के चारों ओर, basolateral पक्ष से काटें।
    9. मानक प्रक्रिया का पालन करते हुए पैराफिन ब्लॉक तैयार करें।
      1. जब पैराफिन अभी भी गर्म होता है, तो चिमटी के साथ पैराफिन से मोनोलेयर लें, और इसे एक पूर्वकूल्ड सतह पर रखें।
      2. सावधान रहें कि मोनोलेयर को नुकसान न पहुंचे। एक एकल किनारे ब्लेड का उपयोग करके आधे में मोनोलेयर काटें।
      3. जब कैसेट के तल में पैराफिन ठोस होना शुरू हो जाता है, तो पैराफिन में दो मोनोलेयर भागों को रखने के लिए गर्म चिमटी का उपयोग करें, सीधे पक्ष के साथ एक दूसरे के बगल में और एक ऊर्ध्वाधर दिशा में यह सुनिश्चित करने के लिए कि मोनोलेयर कूप में ऊर्ध्वाधर होगा।
    10. जब पैराफिन ब्लॉक तैयार हो जाते हैं, तो माइक्रोटोम का उपयोग करके ब्लॉकों को काट लें, और मानक प्रक्रिया का पालन करते हुए 4 μm मोटे वर्गों की स्लाइड बनाएं। सुनिश्चित करें कि monolayers कूप में ऊर्ध्वाधर समाप्त होता है।
    11. पहले 7,9 वर्णित के रूप में हिस्टोलॉजिक दाग प्रदर्शन करें। Hematoxylin और eosin (H &E), Ki67, mucin-2 (MUC2), और Alcian Blue का उपयोग करें ताकि क्रमशः सामान्य आकृति विज्ञान, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं, बलगम उत्पादन और गोब्लेट कोशिकाओं को दिखाया जा सके (चित्रा 6E)।
      नोट:: अतिरिक्त विभेदन मार्कर, जैसे कि पनेथ कोशिकाओं के लिए लाइसोजाइम, का भी उपयोग किया जा सकता है। यह मार्कर चित्रा 6E में प्रस्तुत नहीं किया गया है क्योंकि पनेथ कोशिकाएं बृहदान्त्र उपकला के बजाय छोटे आंतों के उपकला में मौजूद होती हैं।
  4. मध्यम supernatant में स्रावित प्रोटीन माप
    1. सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट का उपयोग करके इलियल मोनोलेयर्स के एपिकल supernatant में लाइसोजाइम के स्तर को मापें (चित्रा 6 D देखें)। यदि वांछित हो, तो विभिन्न साइटोकिन्स और ब्याज के अन्य प्रोटीन के स्तर को मापें।
  5. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके उपकला सेल मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पर भेदभाव मीडिया के प्रभावों को मापें।
      1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए अलगाव के बाद आरएनए लाइसिस बफर के 350 μL में मोनोलेयर्स को लाइस करें। cDNA संश्लेषण और qPCRs, जैसा कि पहले 7,9 वर्णित है, cDNA संश्लेषण किट, मास्टर मिश्रण, और सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध oligonucleotides का उपयोग करके प्रदर्शन करें।

5. झिल्ली आवेषण युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अपस्केलिंग

नोट: उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग या झिल्ली आवेषण युक्त HTS 96-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करके कई मध्यम स्थितियों के लिए उपकला monolayers तैयार करें।

  1. अनुकूलन जब 96-अच्छी तरह से प्रारूप में monolayers की तैयारी
    1. झिल्ली आवेषण युक्त 24-वेल प्लेटों के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी चरणों का पालन करें, तालिका 1 में वर्णित लोगों के लिए वॉल्यूम और सेल नंबर बदल रहे हैं। झिल्ली आवेषण के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेटों पर मोनोलेयर तैयार करने के लिए, निम्नलिखित अंतरों के साथ अनुभाग 3 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
      1. चित्रा 3 ए में दर्शाए गए ऑर्गेनोइड घनत्व के साथ एक 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के लगभग 9 कुओं को झिल्ली आवेषण के साथ एक पूर्ण 96-अच्छी तरह से प्लेट बीज करने की आवश्यकता होती है। चरण 3.2.1 में, DPBS में 40x पतला ECM के 67 μL के साथ झिल्ली precoat (Ca2+ और Mg2+ के साथ)।
      2. धारा 3.5 में, पहले झिल्ली आवेषण की अभिन्न प्लेट को एक और 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें ताकि एपिकल और बैसोलेटरल दोनों डिब्बों के मध्यम जलपान की अनुमति मिल सके।

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Representative Results

चित्रा 1A एक cryovial से उन्हें पिघलाने के बाद आंतों organoids के एक प्रतिनिधि brightfield छवि से पता चलता है. इष्टतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च घनत्व पर ऑर्गेनोइड्स को पिघलाना महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनोइड्स को लगभग 10 μL (चित्रा 1B) के ईसीएम गुंबदों में 24- या 6-अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया जाता है। अधिकांश सामान्य आंतों के ऑर्गेनोइड्स में सिस्टिक आकृति विज्ञान होता है। पिघलने की प्रक्रिया से ठीक होने के बाद, ऑर्गेनोइड्स एक बड़े आकार में बढ़ते हैं और ऑर्गेनोइड संस्कृति (चित्रा 1 सी) के आधार पर 3-7 दिनों के बाद पारित होने के लिए तैयार होते हैं। ऑर्गेनोइड्स की कटाई और ईसीएम को धोने के बाद (चित्रा 1 डी), ऑर्गेनोइड्स को यांत्रिक कर्तन द्वारा एक छोटे आकार में बाधित किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स (सिस्टिक चित्रा 1 सी, नवोदित चित्रा 1 ई) की आकृति विज्ञान के आधार पर, प्लास्टिक या ग्लास पिपेट्स (चित्रा 1 एफ) का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को बाधित किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को एक निलंबन (चित्रा 2 ए) में बाधित किया जाता है, जिसे नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के तहत मॉनिटर किया जाना चाहिए। उन्हें बहुत छोटा बनाने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कोशिकाओं के समूहों को ऑर्गेनोइड विकास सुनिश्चित करने के लिए एक साथ रहने की आवश्यकता होती है। चित्रा 2 बी ईसीएम में ऑर्गेनोइड्स को पास करने के बाद ही दिखाता है। सामान्य तौर पर, सिस्टिक ऑर्गेनोइड्स को अपेक्षाकृत उच्च घनत्व पर चढ़ाया जाता है जबकि नवोदित ऑर्गेनोइड्स को कम घनत्व में चढ़ाया जाता है; हालांकि, यह विभिन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के बीच भिन्न हो सकता है।

मोनोलेयर्स की तैयारी के लिए ऑर्गेनोइड्स को पास करते समय, उन्हें उच्च घनत्व पर प्लेट करना सुनिश्चित करें, और उन्हें तीन दिनों के लिए बढ़ने दें ताकि वे इष्टतम विस्तार स्थितियों में हों। ऑर्गेनोइड्स को मोनोलेयर तैयारी के लिए काटा जा सकता है जब वे आकार और घनत्व में चित्रा 3 ए के साथ तुलनीय होते हैं, जहां 6-अच्छी तरह से प्लेट के 6 कुएं, जिनमें से प्रत्येक में ऑर्गेनोइड गुंबदों के 200 μL होते हैं, आमतौर पर झिल्ली आवेषण की एक पूर्ण 24-अच्छी तरह से प्लेट को सीडिंग करने के लिए पर्याप्त होते हैं। सेल पृथक्करण अभिकर्मक के साथ एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी के बाद, एकल कोशिकाओं और कोशिकाओं के छोटे clumps दिखाई देने चाहिए (चित्रा 3 B), और जीवित कोशिकाओं की गणना की जा सकती है (चित्रा 3 C)। तीर ट्राइपैन नीले रंग से सना हुआ मृत कोशिकाओं को इंगित करते हैं, जिसे गिनती से बाहर रखा जाना चाहिए। एकल कोशिकाओं और छोटे clumps तो झिल्ली आवेषण में seeded कर रहे हैं के रूप में चित्रा 4A में देखा. मोनोलेयर गठन 1-3 दिनों (चित्रा 4 बी, सी) के बाद दिखाई देता है, और मोनोलेयर आमतौर पर ऑर्गेनोइड संस्कृति (चित्रा 4 डी) के आधार पर 3-6 दिनों के बाद confluent हो जाएगा। मोनोलेयर विस्तार माध्यम में रहते हैं जब तक कि वे confluent न हों, जिसके बाद उन्हें विभिन्न संवर्धन मीडिया का उपयोग करके दूसरों के बीच, एंटरोसाइट्स या गोब्लेट कोशिकाओं के साथ समृद्ध किया जा सकता है। चित्रा 5A एक मोनोलेयर दिखाता है जिसे विस्तार माध्यम (आईईएम) में 8 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। जब एंटरोसाइट्स (ईडीएम) के साथ समृद्ध होता है, तो एक संरचना देखी जाती है, जैसा कि चित्रा 5 बी में है, जबकि संयोजन माध्यम (सीडीएम) के संपर्क में मोनोलेयर एक चिकनी संरचना (चित्रा 5 सी) दिखाते हैं।

मोनोलेयर गठन को मात्रात्मक रूप से टीईईआर (चित्रा 6 ए) को मापने के बाद किया जा सकता है। एक पूरी तरह से confluent monolayer ~ 100 Ω ·cm2 का एक TEER मान है, जो ~ 1000 Ω · सेमी2 तक बढ़ जाता है जब या तो भेदभाव माध्यम (चित्रा 6 बी) के संपर्क में आता है। सभी मध्यम स्थितियों में मोनोलेयर्स लूसिफर येलो (0.45 केडीए) के लिए कम स्पष्ट पारगम्यता (पीऐप) दिखाते हैं। आईईएम में सुसंस्कृत इलियल मोनोलेयर्स द्वारा लाइसोजाइम स्राव आईईएम में सुसंस्कृत मोनोलेयर्स की तुलना में अधिक था जब तक कि confluent तक और eDM या cDM में एक और 4 दिनों के लिए (+ बाद के eDM या cDM के रूप में दर्शाया गया) (चित्रा 6 D)। आईईएम, आईईएम + बाद के ईडीएम या आईईएम + बाद के सीडीएम में सुसंस्कृत मोनोलेयर्स अलग-अलग आकृति विज्ञान दिखाते हैं, जैसा कि एच एंड ई स्टेनिंग (चित्रा 6 ई) के साथ देखा जा सकता है। जबकि आईईएम और सीडीएम मीडिया में बृहदान्त्र ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला मोनोलेयर्स में एक चिकनी एपिकल सतह होती है, एंटरोसाइट-विभेदित मोनोलेयर्स डब्ल्यूएनटी की अनुपस्थिति में एक इनवेजिनेटेड एपिकल आकृति विज्ञान पेश करते हैं। Ki67-सकारात्मक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को केवल विस्तार स्थितियों में पता लगाया जा सकता है। एल्शियन ब्लू और एमयूसी 2 दाग बलगम गोब्लेट कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होता है, जिसे ईडीएम में विभेदित मोनोलेयर्स में और सीडीएम में अधिक प्रमुखता से देखा जाता है जब WNT, Notch, और EGF सिग्नलिंग को क्रमशः बाधित किया जाता है (चित्रा 6E)। विभेदन पर, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं कम हो जाती हैं जबकि गोब्लेट सेल और एंटरोसाइट मार्कर जीन अभिव्यक्ति आईईएम स्थितियों के तहत देखी गई तुलना में बढ़ जाती है, जैसा कि क्रमशः क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एलजीआर 5, एमयूसी 2 और एएलपीआई जीन अभिव्यक्ति परिमाणीकरण द्वारा दिखाया गया है (चित्रा 6 एफ)।

Figure 1
चित्र1: जमे हुए ऑर्गेनोइड्स से एक आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना। (ए) पिघलने के बाद आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृति की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि। (बी) ईसीएम गुंबद (50 μL) एक 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में seeded। (सी) एक सामान्य आंत्र organoid संस्कृति की प्रतिनिधि छवि passaging के लिए तैयार. (डी) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स युक्त 15-एमएल ट्यूब में ईसीएम की उपस्थिति की जांच करने के तरीके पर प्रतिनिधि छवि। (ई) एक नवोदित आंत्र organoid संस्कृति passaging के लिए तैयार की प्रतिनिधि छवि. (एफ) एक 10 μL प्लास्टिक पिपेट टिप एक कम प्रतिधारण 1250 μL फिल्टर टिप (बाएं) और एक संकुचित ग्लास पिपेट (दाएं) organoids के यांत्रिक कर्तन के लिए फिट. स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: ECM = extracellular मैट्रिक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मोनोलेयर्स के रखरखाव या तैयारी के लिए आंतों के ऑर्गेनोइड्स को संसाधित करना। (ए) यांत्रिक व्यवधान के बाद आंतों के ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवि। (बी) पासिंग के बाद एक आंत्र ऑर्गेनोइड संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मोनोलेयर तैयारी के लिए आंतों के ऑर्गेनोइड्स से एकल कोशिकाओं को तैयार करना। (ए) मोनोलेयर तैयारी के लिए फसल के लिए तैयार आंत्र ऑर्गेनोइड्स। (बी) एकल कोशिकाओं और एकल कोशिका तैयारी के बाद कोशिकाओं के छोटे clumps। (C) ग्रिड कक्ष में गिनती के दौरान दृश्यमान एकल कोशिकाएं और छोटे clumps। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: झिल्ली पर एकल कोशिकाओं को सीडिंग के बाद मोनोलेयर गठन। (A) झिल्ली पर सीडिंग के ठीक बाद एकल कोशिकाएं। औसतन, (बी) मोनोलेयर सीडिंग के बाद 1-3 दिनों के बाद लगभग 50% confluent है, (सी) ~ 3-5 दिन में 90% confluent, और (डी) पूरा मोनोलेयर दिन 4-7 के आसपास बना है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मोनोलेयर में विशिष्ट सेल प्रकारों का संवर्धन( ए) आईईएम में 8 दिनों के बाद मोनोलेयर। (बी) मोनोलेयर आईईएम में 4 दिनों के बाद एंटरोसाइट्स से समृद्ध होता है और ईडीएम में एक और 4 दिन। (सी) मोनोलेयर आईईएम में 4 दिनों के बाद और सीडीएम में एक और 4 दिनों के बाद गोब्लेट कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों से समृद्ध होता है। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: IEM = आंतों organoid विस्तार माध्यम; eDM = enterocyte विभेदन माध्यम; cDM = संयोजन विभेदन माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उपकला ऑर्गेनोइड मोनोलेयर्स का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के संभावित रीडआउट्स। (ए) टीईईआर को मापने के लिए झिल्ली डालने में इलेक्ट्रोड। (बी) टीईईआर मान ~ 100 Ω · सेमी2 के मूल्य के साथ समय में वृद्धि करते हैं जब मोनोलेयर संगम तक पहुंचता है। एंटरोसाइट्स या विभिन्न उपकला कोशिकाओं के संयोजन के साथ मोनोलेयर्स को समृद्ध करने के बाद, टीईईआर 1000 Ω · सेमी2 या उच्चतर तक बढ़ जाता है। (सी) सभी मध्यम परिस्थितियों (आईईएम + 4 दिन आईईएम / ईडीएम / सीडीएम) में मोनोलेयर्स लूसिफर येलो के लिए अपारगम्य हैं। (डी) लाइसोजाइम की अभिव्यक्ति इलियम मोनोलेयर्स में अधिक होती है जब किसी भी प्रकार के भेदभाव माध्यम (आईईएम + 4 दिन आईईएम / ईडीएम / सीडीएम) की तुलना में विस्तार माध्यम में उगाया जाता है। (ई) बृहदान्त्र monolayers विभिन्न मध्यम स्थितियों (IEM + 4 दिन IEM / eDM / cDM) के संपर्क में आने पर अलग-अलग आकारिकी दिखाते हैं जैसा कि H & E, Ki67, Alcian Blue और MUC2 दाग द्वारा कल्पना की गई है। जैसा कि अपेक्षित था, विस्तार माध्यम में सुसंस्कृत मोनोलेयर्स बहुत प्रोलिफेरेटिव हैं, जैसा कि Ki67 धुंधला द्वारा दिखाया गया है। EDM के साथ विभेदित मोनोलेयर प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के बिना एक स्तंभक उपकला दिखाते हैं। CDM के संपर्क में मोनोलेयर भी proliferative नहीं हैं और अधिक goblet कोशिकाओं का विकास करते हैं। स्केल बार = 100 μm. (F) स्टेम सेल (LGR5), goblet सेल (MUC2), और enterocyte (ALPI) मार्कर जीन अभिव्यक्ति बृहदान्त्र monolayers में qRT-PCR द्वारा. संक्षेप: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; IEM = आंतों organoid विस्तार माध्यम; eDM = enterocyte विभेदन माध्यम; cDM = संयोजन भेदभाव माध्यम; पीअनुप्रयोग = स्पष्ट पारगम्यता गुणांक; LGR5 = ल्यूसीन-समृद्ध दोहराने वाले जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5; H&E = hematoxylin और eosin; AB = Alcian Blue; MUC2 = mucin-2; ALPI = आंतों alkaline फॉस्फेट; QRT-PCR = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

झिल्ली आवेषण
24-अच्छी तरह से प्लेटें 96-अच्छी तरह से प्लेटें
झिल्ली सतह (सेमी2) 0.33 0.143
एपिकल आयतन (μL) 150 100
बैसोलैटरल आयतन (μL) 800 300
# कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति बीज के लिए 450,000 200,000
झिल्ली आवेषण के साथ HTS प्लेटें पालतू पालतू
अलग-अलग आवेषण के साथ प्लेटें पालतू ना
झिल्ली आवेषण के साथ प्रकाश तंग प्लेटों
इलेक्ट्रोड दो प्रारूपों के लिए अलग-अलग हैं सामग्री की तालिका देखें

तालिका 1

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Discussion

यह प्रोटोकॉल आंतों के ऑर्गेनोइड्स के सामान्य हेरफेर और रखरखाव के साथ-साथ इन ऑर्गेनोइड्स से व्युत्पन्न उपकला मोनोलेयर्स की तैयारी और संभावित अनुप्रयोगों का वर्णन करता है। आज तक, मोनोलेयर्स को ग्रहणी, इलियम और बृहदान्त्र ऑर्गेनोइड्स के विभिन्न क्षेत्रों से सफलतापूर्वक तैयार किया गया है जो सामान्य के साथ-साथ पहले और सक्रिय रूप से सूजन वाले आंतों के ऊतकों (अप्रकाशित डेटा) से व्युत्पन्न हैं। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड मोनोलेयर्स का आवेदन एक बीमारी और रोगी-विशिष्ट तरीके से बाधा समारोह के अध्ययन के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के दवा उपचारों के लिए रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। यद्यपि सेल लाइनें आंतों के एंटरोसाइट्स और गोब्लेट जैसी कोशिकाओं से युक्त विभेदित और ध्रुवीकृत मोनोलेयर बना सकती हैं, लेकिन कई अलग-अलग एंजाइमों और ट्रांसपोर्टरों को इन सेल लाइनों में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कम जटिलता और शारीरिक प्रासंगिकता 3,30 होती है। ऑर्गेनोइड संस्कृति तकनीकी रूप से सेल संस्कृति की तुलना में अधिक मांग और श्रमसाध्य है; हालांकि, ऑर्गेनोइड्स इन विवो स्थिति के अधिक प्रतिनिधि हैं, जबकि सेल लाइनें बार-बार जटिल सेटअप में ऊतक प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने में विफल रही हैं।

यद्यपि प्राथमिक ऊतक-आधारित मॉडल इन विवो केप्रतिनिधि हो सकते हैं, उन्हें परीक्षण जानवरों के उपयोग या मानव सामग्री तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जो सीमित उपलब्धता और नैतिक बाधाओं से जुड़ा हुआ है। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक ऊतक में कोई या सीमित विस्तारक्षमता नहीं है और विस्तारित प्रयोगात्मक समय सीमा में स्थिर नहीं है। ऑर्गेनोइड तकनीक को आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से स्थिर दीर्घकालिक विस्तारित संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए प्राथमिक ऊतक की सीमित मात्रा की आवश्यकता होती है, जबकि अभी भी उपकला ऊतक जटिलता और रोगी विषमता का प्रतिनिधित्व करते हैं। विभिन्न सेल लाइनों, जैसे कि कैको -2, का उपयोग अक्सर उपकला मोनोलेयर तैयार करने के लिए किया जाता है। कैको -2 कोशिकाओं को एक ध्रुवीकृत उपकला मोनोलेयर स्थापित करने में 21 दिन लगते हैं जिसका उपयोग किसी भी प्रयोग30 के लिए किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला मोनोलेयर्स को वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित ऑर्गेनोइड एकल कोशिकाओं से तैयार किया जाता है, और 3-6 दिनों के बाद, एक ध्रुवीकृत उपकला बनाते हैं जिसे उन्हें एंटरोसाइट्स या गोब्लेट कोशिकाओं के साथ समृद्ध करने के लिए आगे विभेदित किया जा सकता है।

मोनोलेयर एक स्थिर मॉडल है जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह या मैकेनिक खिंचाव की कमी होती है जैसा कि अंगों-ऑन-ए-चिप में देखा जाता है। हालांकि, वे (ऑटोलॉगस) प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ बैक्टीरिया या परजीवी17,18,19,31 के साथ सह-खेती करने का अवसर प्रदान करते हैं। ऑर्गेनोइड्स मोनोलेयर तैयारी के लिए उपयुक्त होते हैं जब वे अपने विस्तार चरण में होते हैं; आंत्र organoids के लिए, यह आमतौर पर passaging के बाद 3 दिन है. पाचन एंजाइमों के दीर्घकालिक संपर्क से बचने के लिए एकल कोशिकाओं के लिए ऑर्गेनोइड्स का पृथक्करण जल्दी से किया जाना चाहिए। एकल-सेल निलंबन की तैयारी के बाद स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए, Rho-associated protein kinase inhibitor (ROCK inhibitor), Y27632, को एनोइकिस-प्रेरित सेल मृत्युको रोकने के लिए कोशिकाओं में जोड़ा जाता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे अपनी ऑर्गेनोइड विशेषताओं और ध्रुवीकरण को बनाए रखने के लिए ईसीएम के साथ पूर्वनिर्धारित झिल्ली पर मोनोलेयर्स को संस्कृति करना महत्वपूर्ण है। कार्यात्मक स्क्रीनिंग assays के लिए जो बाहरी उत्तेजनाओं के लिए जीआई पथ उपकला सेल प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि ऑर्गेनोइड संस्कृतियां विकसित होने के लिए परख के प्रकार और अंतिम रीडआउट के आधार पर आवश्यक सेलुलर जटिलता का प्रतिनिधित्व करती हैं।

आंत्र ऑर्गेनोइड्स विवो में मौजूद विभिन्न उपकला सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसे कि स्टेम, टीए, एंटरोसाइट, पैनेथ, गोब्लेट और एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं 4,5, और इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक परिभाषित ऑर्गेनोइड माध्यम का उपयोग करके तैयार और बनाए रखा जाता है। एंटरोसाइट भेदभाव को संस्कृति की स्थिति का उपयोग करके अतिरिक्त चार दिनों के लिए ऑर्गेनोइड्स को संवर्धित करके बढ़ावा दिया जा सकता है जो WNT अणुओं / उत्प्रेरकों को हटाने के द्वारा WNT मार्ग को दोहरी रूप से बाधित करते हैं, और पोर्क्यूपिन अवरोधक, IWP-2 (enterocyte colon differentiation medium, eDM) के अलावा। चूंकि बलगम-उत्पादक गोब्लेट कोशिकाएं बाधा फ़ंक्शन होमियोस्टैसिस के लिए भी आवश्यक हैं, एक दूसरी संस्कृति स्थिति का उद्देश्य स्टेम, एंटरोसाइट और गोब्लेट कोशिकाओं से युक्त एक अधिक विषम सेल आबादी का उत्पादन करना है, जिसमें नॉच और ईजीएफ मार्गों को बाधित किया जाता है जबकि डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग को आंशिक रूप से डब्ल्यूएनटी 3 एसीएम को 10% (या एनजीएस-डब्ल्यूएनटी के लिए 0.1 एनएम) को कम करके आंशिक रूप से सक्रिय रखा जाता है, बजाय 50% (0.5 एनएम एनजीएस-डब्ल्यूएनटी) के बजाय आईईएम में उपयोग किया जाता है। ईडीएम के विपरीत, जो एंटरोसाइट भेदभाव के लिए समृद्ध है, यह दूसरी स्थिति कई सेल प्रकारों की उपस्थिति का समर्थन करती है और इसलिए इसे संयोजन भेदभाव माध्यम (सीडीएम) कहा जाता है।

ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर्स के अनुप्रयोगों में उपकला बाधा अखंडता की निगरानी के साथ-साथ तंग जंक्शन और ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति की जांच करना शामिल है। बाधा अखंडता, पारगम्यता, और परिवहन का विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में पेश किए गए रीडआउट का उपयोग करके किया जा सकता है। जबकि टीईईआर तंग जंक्शनों के माध्यम से आयनिक चालकता को मापता है, पारगम्यता परख पानी के प्रवाह को मापता है और इस प्रकार तंग जंक्शनों के माध्यम से परकोशिकीय पारगम्यता28,29 है। उपकला बाधा अखंडता, पारगम्यता, और monolayers के परिवहन कार्यक्षमता का मूल्यांकन झिल्ली आवेषण के एपिकल और बेसोलेटरल डिब्बों में विभिन्न फ्लोरोसेंट या रेडियोधर्मी सब्सट्रेट के ट्रैफ़िक को मापकर किया जा सकता है। टीईईआर माप बाधा अखंडता के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देते हैं, ध्रुवीकृत एंटरोसाइट्स और गोब्लेट कोशिकाओं की ओर अंतर करते समय मूल्यों में वृद्धि दिखाते हैं, और मोनोलेयर्स को चोट पहुंचाने के बाद कमी होती है।

लूसिफर पीला पारगम्यता परख प्रारंभिक बाधा अखंडता मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monolayers को चोट उत्प्रेरण के बाद कम अखंडता की पुष्टि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रोटोकॉल मोनोलेयर अखंडता के संकेत के रूप में एपिकल से बेसोलेटरल डिब्बे तक लूसिफर पीला पारगम्यता का परिचय देता है। इसी तरह, अन्य फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अभिकर्मकों, जैसे कि 4 या 40 केडीए डेक्सट्रान, को बाधा क्षति-उत्प्रेरण एजेंटों के परिणामस्वरूप बढ़ी हुई परकोशिकीय पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सब्सट्रेट्स, जैसे कि रोडामाइन 123, का उपयोग विभिन्न ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि पी-ग्लाइकोप्रोटीन -1। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रतिदीप्ति परख प्रोटीन के स्तर के माप की अनुमति देता है, जैसे कि लाइसोजाइम, जो एपिकल डिब्बे में स्रावित होते हैं। प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा चोट प्रेरण की प्रतिक्रियाओं को इन रीडआउट के साथ मापा जा सकता है, साथ ही साथ बाधा-बहाल यौगिकों के संभावित प्रभावों के साथ भी।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम Topsector जीवन विज्ञान और स्वास्थ्य द्वारा समर्थित है - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ हॉलैंड (LSH-TKI) परियोजना संख्या LSHM16021 Organoids के साथ डच LSH क्षेत्र के सार्वजनिक-निजी भागीदारी (पीपीपी) भत्ता Hubrecht Organoid Technology (HUB) के लिए विष विज्ञान मॉडलिंग के लिए उपन्यास उपकरण के रूप में और HUB आंतरिक वित्तपोषण रोग मॉडलिंग और विष विज्ञान विभाग के लिए। हम सबाइन Middendorp (बाल चिकित्सा गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, विल्हेल्मिना बच्चों के अस्पताल, यूएमसी, Utrecht के प्रभाग) और ह्यूगो आर डी जोंगे और मार्सेल जे.सी. बिजवेल्ड्स (गैस्ट्रोएंटरोलॉजी और हेपेटोलॉजी विभाग, इरास्मस एमसी, रॉटरडैम) की प्रयोगशालाओं को झिल्ली आवेषण पर मोनोलेयर स्थापित करने के लिए प्रारंभिक तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher Emergo 10644795
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips Greiner bio-one 732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 mL conical tubes Greiner bio-one 188271
24-well cell culture plates Greiner bio-one 662160
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) Corning 351156
24-well HTS Transwell plates (Table 1) Corning 3378
24-well plate with Transwell inserts Corning 3470
40 µm cell strainer PluriSelect 43-50040-01
50 mL conical tubes Greiner bio-one 227261
6-well cell culture plates Greiner bio-one 657160
96-well black plate transparent bottom Greiner bio-one 655090
96-well fast thermal cycling plates Life Technologies Europe BV 4346907
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate Corning 351162
96-well HTS Transwell plates (Table 1) Corning 7369
96-well transparent culture plate Greiner bio-one 655180
A83-01 Bio-Techne Ltd 2939
Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies Europe BV A11105-01 Cell dissociation reagent 2
Advanced DMEM/F-12 Life Technologies Europe BV 12634028
B27 supplement Life Technologies Europe BV 17504001
Cell culture microscope (light / optical microscope) Leica
CellTiter-Glo Promega G9683
Centrifuge Eppendorf
CO2 incubator PHCBI
DAPT Sigma-Aldrich D5942
DEPC treated H2O Life Technologies Europe BV 750024
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ Life Technologies Europe BV 14040091
DPBS, powder, no calcium, no magnesium Life Technologies Europe BV 21600069
EnzChek Lysozyme Assay Kit Life Technologies Europe BV E22013
EVOM2 meter with STX electrode WTI
Gastrin Bio-Techne Ltd 3006
Glass pipettes Volac
GlutaMAX Life Technologies Europe BV 35050038
hEGF Peprotech AF-100-15
HEPES Life Technologies Europe BV 15630056
Human Noggin Peprotech 120-10C
Human Rspo3 Bio-Techne Ltd 3500-RS/CF
IWP-2 Miltenyi Biotec 130-105-335
Ki67 primary antibody Sanbio BSH-7302-100
Ki67 secondary antibody Agilent K400111-2
Kova International Glasstic Slide with Counting grids Fisher Emergo 10298483
Laminar flow hood Thermo scientific
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich L0259
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) Corning 356231 extracellular matrix (ECM)
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL Life Technologies Europe BV 4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strips Life Technologies Europe BV 4323032
Microcentrifuge tubes Eppendorf 0030 120 086
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) Gilson
Microtome Leica
MUC2 primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15334
MUC2 secondary antibody VWR VWRKS/DPVR-HRP
Multichannel pipette (200 µL) Gilson
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165
NGS Wnt U-Protein Express N001-0.5mg
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Oligonucleotide ALPI1/Forward Custom-made GGAGTTATCCTGCTCCCCAC
Oligonucleotide ALPI1/Reverse Custom-made CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Oligonucleotide LGR5/Forward Custom-made ACACGTACCCACAGAAGCTC
Oligonucleotide LGR5/Reverse Custom-made GGAATGCAGGCCACTGAAAC
Oligonucleotide MUC2/Forward Custom-made AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
Oligonucleotide MUC2/Reverse Custom-made TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Oligonucleotide TBP/Forward Custom-made ACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Oligonucleotide TBP/Reverse Custom-made AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG
Optical adhesive covers Life Technologies Europe BV 4311971
PD0325901 Stemcell Technologies 72184
Penicillin/streptomycin Life Technologies Europe BV 15140122
Plate shaker Panasonic
PowerUp SYBR Green Master Mix Fisher Emergo A25776
Primocin InvivoGen ANT-PM-2 antimicrobial formulation for primary cells
Qubit RNA HS Assay Kit Life Technologies Europe BV Q32852
Reagent reservoir for multichannel pipet Sigma-Aldrich CLS4870
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe WTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit Thermo scientific 87023
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
SB202190 Sigma-Aldrich S7076
Serological pipettes Greiner bio-one 606180 / 607180 / 760180
Serological pipettor (Pipet-Aid) Drummond
Single edge razor blade GEM Scientific
Superscript 1st strand system for RT-PCR Life Technologies Europe BV 11904018
Tecan Spark 10M plate reader Tecan
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies Europe BV 15250-061
TrypLE Express Enzyme (1x) Life Technologies Europe BV 12605-010 Cell dissociation reagent 1
Water bath Grant
Y27632 (ROCK inhibitor) AbMole M1817

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References

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जीव विज्ञान मुद्दा 173 उपकला monolayer मानव आंत्र organoids झिल्ली डालने बाधा समारोह पारगम्यता परिवहन
Organoid-व्युत्पन्न उपकला monolayer: आंत्र बाधा समारोह के लिए एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल
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van Dooremalen, W. T. M., Derksen,… More

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