Summary
Apresentamos um protocolo para a construção de um sistema simples de distribuição de esporos constituído por uma caixa de inoculação com uma malha de ~50 μm e uma câmara de plástico transparente. Isso pode ser usado para inocular uniformemente plantas com esporos de oídio, permitindo assim uma avaliação precisa e reprodutível dos fenótipos de doenças das plantas em estudo.
Abstract
Reduzir as perdas de culturas devido a doenças fúngicas requer uma melhor compreensão dos mecanismos que regem a imunidade das plantas e a patogênese fúngica, o que, por sua vez, requer a determinação precisa dos fenótipos de doenças das plantas após a infecção por um patógeno fúngico específico. No entanto, a fenotipagem precisa da doença com patógenos fúngicos biotróficos incultiváveis, como o oídio, não é fácil de alcançar e pode ser uma etapa limitante da taxa de um projeto de pesquisa. Aqui, desenvolvemos um sistema de fenotipagem de doenças seguro, eficiente e fácil de operar usando a interação Arabidopsis-oídio como exemplo. Este sistema consiste principalmente em três componentes: (i) uma caixa de inoculação de madeira equipada com uma tampa removível montada com uma malha de aço inoxidável ou nylon de poros de ~50 μm para inocular um plano de plantas com esporos de fungos, (ii) uma câmara de plástico transparente com uma pequena abertura frontal para minimizar a fuga de esporos durante a realização da inoculação no interior, e (iii) um método de deslocamento e distribuição de esporos para inoculação uniforme e eficaz. Os protocolos aqui descritos incluem as etapas e parâmetros para fazer a caixa de inoculação e a câmara de plástico a um baixo custo, e uma demonstração em vídeo de como usar o sistema para permitir até mesmo a inoculação com esporos de oídio, melhorando assim a precisão e a reprodutibilidade da fenotipagem da doença.
Introduction
O oídio é uma das doenças mais comuns e importantes de inúmeras culturas alimentares e plantas ornamentais1. Estudos de doenças do oídio têm sido muito populares, como evidenciado por mais de 10.500 publicações como o resultado da pesquisa com "oídio" como palavra-chave na Web of Science (a partir de novembro de 2020). De fato, o oídio (representado pela Blumeria graminis) é considerado um dos 10 principais patógenos fúngicos pela revista Molecular Plant Pathology2. A quantificação da suscetibilidade à doença é um passo necessário na caracterização dos genes das plantas que contribuem para a resistência ou suscetibilidade à doença, ou na identificação funcional de genes efetores candidatos no oídio. No entanto, a fenotipagem confiável da doença é muito mais desafiadora com o oídio em comparação com a maioria dos outros patógenos fúngicos, em parte porque, ao contrário dos esporos deste último, os esporos de espécies de oídio (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 com base em nossa experiência de laboratório) mostram viabilidade reduzida após passar por um processo de suspensão de água 3,4 . A inoculação inadequada e/ou desigual de plantas de ensaio com um determinado agente patogénico do oídio pode conduzir a resultados de fenotipagem imprecisos.
Vários métodos de inoculação foram relatados para estudos de oídio. Estes incluem (i) escovação de esporos diretamente de folhas infectadas para testar plantas5, (ii) pulverização de uma suspensão de esporos para testar plantas6, (iii) sopro de esporos usando uma torre de decantação operada a vácuo para plantas no fundo da torre7 e (iv) entrega de esporos pelo uso combinatório de uma membrana de malha de nylon e vibração baseada em som8 . O método de escovação de esporos (ou poeira) é fácil de executar, mas de natureza desigual, portanto, pode não ser preciso para avaliação quantitativa. A pulverização de esporos é conveniente e uniforme, mas, como dito acima, pode resultar em má germinação de esporos4. Os dois últimos (isto é, iii-iv) são métodos muito aprimorados capazes de alcançar até mesmo a inoculação; no entanto, ambos não são flexíveis no ajuste de sua capacidade de inoculação em termos do número de plantas a serem inoculadas em um único evento, fazendo com que qualquer aparelho não seja trivial, e sua operação é restrita a áreas de laboratório onde há vácuo e / ou fonte de eletricidade.
Nosso laboratório trabalha com interação planta-oídio há mais de 20 anos 9,10. Ao longo da última década, testamos uma série de métodos de inoculação e desenvolvemos recentemente um método de inoculação de oídio simples e eficaz. Este método de escovação de esporos à base de malha pode garantir uma inoculação uniforme e é simples e escalável, portanto, deve ser facilmente adotado por qualquer laboratório que trabalhe com oídio.
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Protocol
1. Fazer uma caixa de inoculação padrão com uma tampa superior removível montada com uma malha
- Compre um rolo de malha de membrana de nylon de 50 μm ou malha de aço inoxidável de 48 μm (recomendado) nas lojas. Certifique-se de encomendar o suficiente para cortar em várias peças de 14 em x 26 em para a substituição de malha desgastada.
- Compre um 1/4 em x 2 pés x 4 pés de fibra de média densidade ou compensado, e corte dois 24-1/2 em x 10 em pedaços e dois 12 em x 10 em pedaços para fazer uma caixa de inoculação. Use 8 grampos de canto para apoiar os quatro lados.
NOTA: Se estiver voltado para o lado largo do gabinete, o lado esquerdo de 12 em x 10 no lado é fixado permanentemente e o lado direito de 12 em x 10 no lado é uma porta removível mantida no lugar por quatro capturas magnéticas (Figura 1A,B). - Coloque quatro cintas de canto de 2 polegadas, duas em cada canto interno do lado esquerdo, a uma polegada do topo e a uma polegada da parte inferior, marque e faça um furo. Use parafusos para prender permanentemente o lado curto esquerdo a dois lados longos (frente e verso). A distância interna entre os dois lados longos deve ser de 12 polegadas e não de 11-1/2 polegadas.
- Com as braçadeiras de canto ainda no lugar e o alinhamento adequado da porta direita, marque e perfure a localização das 4 pegas magnéticas para manter a porta destacável direita no lugar. Instale uma maçaneta de botão na porta. A parte superior da porta pega sob a tampa superior (Figura 1A,B).
- Para fazer uma tampa superior removível com uma malha, corte a longa cavilha quadrada de madeira em 2 conjuntos de 26 polegadas e 12-3/4 polegadas. Cole e pregue as quatro peças de tal forma que caiba ao redor da caixa - as dimensões internas do quadro são um pouco maiores do que as dimensões externas da caixa, pois a malha da tela será anexada a esse quadro.
- Corte a malha da tela para um pouco menos de 14 pol x 26 pol. Não permita que a tela se projete além do quadro de modo a evitar bordas afiadas. Tenha ajuda para esticar a tela no quadro. Segure a malha com a armação por grampos (Figura 1C) e use uma pistola grampeadora com os grampos certos para prender a tela ao quadro.
- Corte dois conjuntos de cavilha quadrada de madeira mais curta (21 pol e 9 pol) e use parafusos para encaixotar firmemente a malha ao longo do quadro usando os 4 pedaços mais curtos de cavilha quadrada de madeira (Figura 1C, D).
2. Fazer uma câmara de inoculação
- Compre folhas de acrílico transparente e itens de ferragens de lojas apropriadas. Corte uma janela de abertura de 7 em x 20 na folha de acrílico frontal da caixa, conforme mostrado na Figura 2C.
- Monte as folhas de acrílico dos lados esquerdo e direito, frontal (com janela) e traseira em uma caixa usando 8 grampos de canto, conforme mostrado na Figura 2A. Certifique-se de que as medidas internas da câmara sejam iguais às dimensões da folha superior.
NOTA: O lado direito está lá para suporte e não será anexado às folhas dianteiras ou traseiras. É 1/2 em mais curto do que as outras folhas de propósito. Este lado direito se tornará uma porta "puxada para baixo" mantida no lugar por uma dobradiça de ângulo reto na parte inferior e duas capturas magnéticas na parte superior, como mostrado na Figura 2C,D. - Use chaves de canto para fixar os painéis juntos (Figura 2B,C). Segure as chaves no lugar, marque com um marcador sharpie, perfure o centro e, em seguida, faça o furo.
NOTA: Perfurar acrílico é diferente de perfurar qualquer outra coisa, não force ou o lado do furo oposto à broca pode rachar. Use rebites ou parafusos. Não aperte demais os parafusos ou o acrílico pode rachar com o tempo. - Gire o compartimento em seu lado traseiro e remova as 4 braçadeiras de canto e posicione a folha superior no lugar. Marque e perfure.
- Instale a dobradiça de ângulo reto, feita de uma cinta angular de 3/4. Use uma porca de bloqueio de retenção de nylon como uma haste de dobradiça. Não aperte, deixe um vão para que a porta gire nesta dobradiça.
- Marque, perfure centralmente, perfure e prenda os dois ímãs magnéticos da porta com parafusos de cabeça de panela #6-32x3/4". Em seguida, prenda as placas de captura com parafusos de cabeça plana #6-32x3/8", consulte a Figura 2C,D.
3. Plantas inoculantes em planícies
- Prepare esporos de oídio frescos como inóculo (por exemplo, Arabidopsis oídio Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultivar plantas mutantes limpas de Arabidopsis imunocomprometidas4-1 11 em uma câmara de crescimento (22 °C, 65% de umidade relativa por 6-8 semanas) e inocular uma ou meia planta plana de almofada 4-1 para acumular esporos de oídio frescos suficientes (Figura 3A).
- Cultivar as plantas para determinação dos fenótipos de infecção no padrão 11 em x 21 em x 2,5 em flats.
NOTA: Plantas de Arabidopsis cultivadas em dias curtos (8 h de luz, 16 h de escuridão; 22 ° C) por seis a oito semanas são boas para testes de infecção com oídio. - Quando esporos frescos de oídio de plantas infectadas em 8-10 dias após a inoculação (dpi) estiverem disponíveis, mova um plano de plantas para teste de infecção para a caixa de inoculação dentro da câmara de inoculação (Figura 1B,2C).
- Corte 15-20 folhas de Arabidopsis fortemente infectadas (ou 4-6 rosetas infectadas, dependendo do tamanho da folha / roseta e do nível de inoculação), deixe as folhas secarem se houver água condensada.
- Pegue 1-2 folhas ou uma roseta com um par de pinças longas usando uma mão e enfrente as folhas de cabeça para baixo. Em seguida, coloque as duas mãos através da abertura da câmara e bata suavemente no braço da pinça com uma tesoura enquanto move lentamente as folhas/roseta acima da malha montada na caixa de inoculação (Figura 3B). Repita isso até que todas as folhas ou rosetas sejam usadas.
NOTA: Os esporos maduros se desalojarão facilmente dos conidióforos das folhas infectadas. Tente desalojar os esporos na malha da forma mais uniforme possível. - Use uma ou duas escovas finas de ventilador-liquidificador para escovar suavemente os esporos através da malha (Figura 3C). Certifique-se de escovar toda a superfície da malha em diferentes direções por quatro ou mais vezes para maximizar a distribuição uniforme de esporos nas plantas no fundo da caixa de inoculação (Figura 3D). Gentilmente bata na malha por algumas vezes com os pincéis para sacudir os esporos que estão presos na malha.
- Deixe os esporos se acalmarem por meio minuto. Em seguida, mova para fora o plano que contém as plantas inoculadas da caixa de inoculação. Cubra o plano com uma cúpula de plástico e coloque-o em uma câmara de crescimento (22 °C, 65% de umidade relativa). A fenotipagem da doença pode ser realizada em 5, ou 8 a 12 dpi 12.
4. Inocular plantas com caixas de inoculação menores
NOTA: Nos casos em que menos plantas devem ser inoculadas, a caixa de inoculação padrão ainda pode ser usada. Certifique-se de colocar as plantas no meio da caixa. Desaloje e escove os esporos na área da malha que cobre as plantas para garantir que todas as plantas sejam inoculadas enquanto salva o inóculo. Alternativamente, e de preferência, caixas de inoculação menores podem ser usadas (conforme descrito abaixo).
- Converta caixas de papelão em uma caixa de inoculação. Basta remover os lados superior e inferior da caixa, colar o canto para firmá-lo, se necessário, e montar uma malha de 50 μm de tamanho adequado na parte superior, colando ou grampeando (Figura 4A,B).
- Mova o plano contendo as plantas dentro da câmara de inoculação, coloque a caixa de inoculação menor em cima do plano para cobrir as plantas.
- Desaloje e pincele os esporos conforme descrito acima.
5. Inocular folhas destacadas em placas de Petri
NOTA: Nos casos em que (i) os esporos de oídio fresco são muito limitados e/ou (ii) as plantas devem ser mantidas limpas enquanto os fenótipos da doença e/ou a localização subcelular de proteínas nas células infectadas precisam ser avaliados, as folhas destacadas podem ser usadas para infecção em placas de ágar MS.
- Faça uma mini caixa de inoculação que seja apenas um pouco maior que uma placa de Petri.
- Prepare placas de ágar médio Murashige e Skoog (MS) de 1/2 resistência (1,5%). Adicione tiabendazol (40 mg/L) para reduzir a contaminação por mofo, se necessário. Conservar as placas a 4 °C no frigorífico até à sua utilização.
- Corte uma ou duas folhas totalmente expandidas da base do pecíolo para cada planta individual a ser testada. Insira o pecíolo das folhas separadas em meio de ágar em um ângulo de ~30°.
NOTA: Cada placa pode conter de 20 a 40 folhas, dependendo do tamanho das folhas e da placa utilizada (Figura 4C). - Inocular as folhas dentro da câmara de inoculação conforme descrito acima. Mova a placa com a tampa para uma câmara de crescimento.
- Corte uma pequena seção de uma folha e verifique a localização subcelular das proteínas em pontos de tempo específicos.
- Para avaliar os fenótipos de infecção, transfira as folhas para uma placa de ágar MS asséptica fresca a 4 ou 5 dpi. Corte a base do pecíolo antes de inserir as folhas no meio de ágar fresco. Avalie os fenótipos da doença em 8 ou 9 dpi.
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Representative Results
Aqui, apresentamos um novo método de inoculação de esporos de oídio que é fácil de preparar, operar e ajustar. A Figura 1 mostra a montagem da caixa de inoculação padrão com ênfase na marca da tampa removível montada com uma malha de membrana de 50 μm. A Figura 2 mostra a montagem da câmara de inoculação. A Figura 3 ilustra as principais etapas do processo de inoculação utilizando esse sistema. A Figura 4 mostra outras caixas de inoculação que podem ser usadas para inocular uma planta inteira plana ou menos, ou folhas destacadas em meio de ágar MS. Finalmente, a Figura 5 fornece dados para demonstrar a uniformidade da inoculação refletida pela distribuição de esporos ou fenótipos de infecção de plantas.
Figura 1. Fazer uma caixa de inoculação. (A-B) Fotos mostrando a caixa com a porta fechada (A) ou aberta para inserção de um plano de plantas de Arabidopsis (B). Observe que um par de pegas magnéticas da porta do armário é usado para segurar a porta. (C) Uma foto mostrando a montagem de uma malha no quadro do retângulo como um passo crítico para fazer a tampa da caixa. Observe que grampos e suportes de canto são usados para posicionar a malha antes que ela seja fixada por pregos parafusados. (D-E) Fotos mostrando a tampa removível da caixa com uma nova malha de aço inoxidável montada (D) ou uma caixa montada (E). Observe que a malha é fixada entre 3/4 pol. cavilha quadrada de madeira com comprimento indicado em D e E. Linhas amarelas realçam a medida de tamanho da caixa. Ter uma caixa de inoculação que se encaixa em um plano padrão pode aumentar muito a eficiência da fenotipagem, especialmente quando muitas plantas devem ser inoculadas (por exemplo, durante uma triagem genética). Uma tampa removível montada com uma malha facilita a limpeza ou substituição da malha. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fazer uma câmara de inoculação. (A) Uma foto mostrando a montagem inicial das quatro folhas de acrílico usando grampos de canto. (B) Uma foto que dá uma visão de cima para baixo da câmara de plástico. (C-D) Fotos mostrando o sistema de inoculação totalmente montado (C) e uma das duas capturas magnéticas (superior) e dobradiças de ângulo reto (inferior) instaladas em uma folha de acrílico lateral como a porta (D). Observe que a janela de inoculação é para desalojar e escovar esporos pelo usuário (representados por linhas distribuídas). As linhas amarelas realçam a medida do tamanho da caixa. Ter uma câmara de inoculação é uma vantagem, mas sem ela, a inoculação ainda pode ser realizada com uma caixa de inoculação em uma pequena sala ou ambiente de vento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ilustração do processo de inoculação. (A) Imagens que mostram oídio fresco em folhas de plantas indicadas. (B) Uma imagem mostrando como sacudir os esporos na malha, batendo suavemente no fórceps agarrando as folhas infectadas. (C) Imagens que mostram dois pincéis finos de ventilador-liquidificador e escovação suave de esporos na malha. (D) Um desenho esquemático mostrando as direções da escovação de esporos na malha que pode ajudar a resultar em distribuição uniforme de esporos em plantas no fundo da caixa de inoculação. É importante ressaltar que o uso de esporos frescos para inoculação é fundamental para o sucesso da infecção. Com base em nossa experiência, os conídios produzidos em folhas infectadas entre 8 a 12 dpi são frescos e podem ser facilmente desalojados por agitação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Caixas de inoculação de papelão simples e provisórias para testes de infecção. A) Uma caixa de cartão para a inoculação de plantas num plano normalizado. (B) Caixas de inoculação de tamanho médio para inocular menos plantas. (C) Uma pequena caixa de inoculação para inoculação de folhas destacadas em placa de Petri quadrada contendo meio de ágar MS. Linhas amarelas realçam a medida de tamanho da caixa. Caixas de papelão de outros tamanhos podem ser usadas se se ajustarem aos planos que contêm plantas a serem testadas. Caixas de plástico não devem ser usadas porque os esporos podem ser atraídos para a superfície de plástico devido à sua eletricidade estática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Avaliação da uniformidade da inoculação. (A) Um desenho esquemático mostrando as posições de seis lâminas microscópicas na parte inferior de um apartamento. Uma micrografia representativa à direita mostra até mesmo a distribuição de esporos na lâmina após uma inoculação pesada. Barra de escala = 200 μm. ( B ) Um gráfico de barras mostrando a densidade de esporos distribuídos em seis locais (1 a 6), como mostrado em (A) após três inoculações simuladas com esporos de quatro (para inoculação leve) ou 15 (para inoculação pesada) folhas infectadas totalmente expandidas de plantas de almofada4-1 . Foram contados esporos em uma área de 4 x0,25 cm 2 delimitada por uma folha de cobertura de vidro quadriculada (da ibidi USA Inc. ou self-made) em cima de cada lâmina. Não foram detectadas diferenças significativas na densidade de esporos entre seis lâminas em cada um dos dois esquemas de inoculação ( teste t de Student; p > 0,5). As barras de erro indicam SD. (C) Plantas representativas do tipo selvagem Arabidopsis Col-0 e do mutante pad4-1 infectadas com G. cichoracearum UCSC1 aos 12 dias após uma inoculação pesada. Observe que todas as plantas pad4-1 apresentaram maior suscetibilidade à doença em comparação com as plantas Col-0. Múltiplos fatores determinam a uniformidade da inoculação. Em geral, é relativamente mais fácil conseguir uma inoculação uniforme quando se utiliza inóculo suficiente para atingir uma densidade de > 50 esporos/cm2. Conídios frescos desalojados por agitação podem ser facilmente desagregados e escovados individualmente através da malha. Conídios velhos ou mortos tendem a formar agregados, portanto, são difíceis de desalojar e dispersar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso método de inoculação baseado em caixa de malha tem várias vantagens em relação a outros métodos de inoculação. Primeiro, pode alcançar uma distribuição uniforme dos esporos se operado corretamente, como demonstrado na Figura 5. Em segundo lugar, o uso de malha de ~ 50 μm, além de deslocamento de esporos por agitação suave de folhas infectadas pode reduzir a infecção de plantas por tripes ou outros insetos infectantes de plantas que estão presentes em plantas de origem. Em terceiro lugar, o uso de caixas de inoculação de tamanhos diferentes para inocular plantas ou folhas separadas dentro da câmara de plástico (ambas as quais podem ser limpas facilmente por pulverização de etanol a 75%) pode fazer uso mais eficaz do inóculo e reduzir a contaminação cruzada. Descobrimos que nenhum ou muito poucos esporos fúngicos escaparam das câmaras de inoculação durante todo o processo de inoculação.
Uma caixa de inoculação de boa qualidade é fundamental para garantir uma inoculação uniforme. Verificou-se que a caixa de inoculação padrão pode ser utilizada para a inoculação de plantas jovens e maduras de Arabidopsis (Figura 1), mudas de morango, cardo de porca e N. benthamiana (não mostradas). A altura da caixa pode aumentar ainda mais se as plantas forem mais altas do que cinco polegadas para garantir distância suficiente (> 5 polegadas) da malha até as plantas abaixo para permitir a distribuição uniforme dos esporos. A altura da câmara de plástico também pode aumentar de acordo para permitir espaço adequado para manobrar o deslocamento dos esporos e a escovação no topo da caixa de inoculação.
A montagem uniforme e apertada de uma malha de ~50 μm de escolha para a tampa da caixa de inoculação é importante e requer cuidados extras. O tamanho dos poros é ligeiramente maior do que os esporos de oídio que são principalmente 30-40 μm de diâmetro. A tampa pode ser limpa lavando com água da torneira ou pulverizando com etanol a 75% após o uso. Recomendamos o uso de uma malha de aço inoxidável de 48 μm, pois a malha é mais durável e durará mais tempo.
A câmara de inoculação cria um ambiente de agitação e minimiza a fuga de esporos durante o deslocamento dos esporos e/ou a escovação. A câmara é feita de vidro plástico transparente para que o usuário possa ver a olho nu se os esporos desalojados são distribuídos mais ou menos uniformemente na malha antes da escovação. Isto é especialmente importante se for necessária uma inoculação leve e uniforme. Escovar suavemente, mas rapidamente, em diferentes direções também é importante, pois pode dispersar esporos agregados e empurrá-los através dos poros individualmente, alcançando uma distribuição uniforme depois que os esporos caem e se acomodam no fundo da caixa de inoculação. Para facilitar o manuseio, a câmara de inoculação deve ser colocada sobre uma mesa com uma altura adequada, de modo que o deslocamento dos esporos e a escovação possam ser facilmente feitos com as mãos através da janela da câmara.
A inoculação à base de caixa de malha pode ser ampliada ou reduzida usando caixas de inoculação de tamanhos diferentes. Caixas de inoculação de malha simples e provisórias são fáceis de fabricar e podem alcançar resultados satisfatórios se usadas corretamente. É certo que, em comparação com a inoculação com o método7 da torre de decantação operada a vácuo, esse método pode levar mais tempo no deslocamento de esporos e na escovação. Além disso, para a inoculação de plantas grandes e altas, a caixa de inoculação padrão descrita aqui pode ser muito pequena, portanto, uma caixa de inoculação maior e uma câmara maior devem ser usadas para alcançar a inoculação uniforme. Para algumas espécies de plantas, como tabaco e pepino, folhas destacadas ou cotilédones podem ser inoculados com este método para avaliar a suscetibilidade à doença de toda a planta.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (IOS-1901566) para S. Xiao. Os autores gostariam de agradecer a F. Coker e C. Hooks pela manutenção da instalação de crescimento da planta, e a Jorge Zamora pela ajuda técnica associada à fabricação da caixa e câmara de inoculação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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