Summary
Hier presenteren we een methode om perifere bloed natural killer (PBNK), NK-cellen uit leverweefsels en chimere antigeenreceptor (CAR) -NK-cellen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) uit te breiden. Dit protocol demonstreert de uitbreiding van NK- en CAR-NK-cellen met behulp van 221-mIL-21-feedercellen naast de geoptimaliseerde zuiverheid van geëxpandeerde NK-cellen.
Abstract
Chimere antigeenreceptor (CAR) -gemodificeerde immuunceltherapie is een opkomende behandeling geworden voor kankers en infectieziekten. NK-gebaseerde immunotherapie, met name CAR-NK-cellen, is een van de meest veelbelovende 'off-the-shelf' ontwikkelingen zonder ernstige levensbedreigende toxiciteit. Het knelpunt voor het ontwikkelen van een succesvolle CAR-NK-therapie is echter het bereiken van voldoende niet-uitputtende, langlevende, 'kant-en-klare' CAR-NK-cellen van een derde partij. Hier hebben we een nieuwe CAR-NK-expansiemethode ontwikkeld met behulp van een Epstein-Barr-virus- (EBV) getransformeerde B-cellijn die een genetisch gemodificeerde membraanvorm van interleukine-21 (IL-21) tot expressie brengt. In dit protocol worden stapsgewijze procedures gegeven om NK- en CAR-NK-cellen uit navelstrengbloed en perifeer bloed uit te breiden, evenals vaste orgaanweefsels. Dit werk zal de klinische ontwikkeling van CAR-NK immunotherapie aanzienlijk verbeteren.
Introduction
Natural killer (NK) cellen zijn een belangrijke subset van lymfocyten die CD56 tot expressie brengen en geen expressie hebben van de T-celmarker, CD3 1,2. Conventionele NK-cellen worden geclassificeerd als aangeboren immuuncellen die verantwoordelijk zijn voor immunosurveillance van viraal geïnfecteerde cellen en kankercellen. In tegenstelling tot T-cellen herkennen NK-cellen geïnfecteerde of kwaadaardige cellen met behulp van CD16 of andere activerende receptoren en vereisen ze niet de vorming van een complex tussen antigeenpeptiden en belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) klasseI-moleculen 3,4. Recente klinische onderzoeken met chimere antigeenreceptor (CAR)-NK-cellen voor de behandeling van recidiverende of refractaire CD19-positieve kankers (non-Hodgkin-lymfoom of chronische lymfatische leukemie [CLL]) toonden de uitstekende veiligheidsvoordelen van CAR-NK-cellen5. Car-NK-celinfusie is bijvoorbeeld geassocieerd met minimale of verwaarloosbare graft versus host disease (GVHD), neurotoxiciteit, cardiotoxiciteit en cytokine release syndrome (CRS)6,7,8,9,10. Conventionele methoden om menselijke NK-cellen uit te breiden vertoonden echter uitputtende fenotypen met sterke broedermoord en telomeertekort, wat een grote uitdaging vormt bij het verkrijgen van een voldoende aantal functionele NK-cellen voor adoptieve immunotherapie11.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, werd een methode ontwikkeld om primaire NK-cellen rechtstreeks uit te breiden uit niet-gefractioneerde perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) met behulp van een bestraalde en genetisch gemanipuleerde 721.221 (hierna 221) cellijn, een menselijke B-lymfoblastoïde cellijn met lage expressie van MHC klasseI-moleculen 3. Eerdere studies toonden het belang van IL-21 aan bij NK-celexpansie; daarom werd een genetisch gemanipuleerde membraangebonden IL-21 ontwikkeld die een versie van de 721.221-cellijn tot expressie brengt (vanaf nu 221-mIL-21) 11,12,13,14,15. De resultaten toonden aan dat 221-mIL-21 feeder-cel-geëxpandeerde primaire NK-cellen werden uitgebreid tot een gemiddelde van >40.000-voudig met aanhoudende hoge NK-celzuiverheid gedurende ongeveer 2-3 weken. Aanvullende informatie over de toepassing van dit protocol is te vinden in Yang et al.16.
Dit protocol is bedoeld om de stapsgewijze procedure van de nieuwe uitbreiding van PBNK-, CBNK-, weefsel-afgeleide NK- en CAR-NK-cellen ex vivo te demonstreren.
Protocol
Menselijke weefsels en bloedgerelateerd werk in dit protocol volgt de richtlijnen van de Rutgers University Institutional Review Board (IRB)
1. NK-celexpansie uit leverweefsels (dag 0), zoals weergegeven in figuur 1.
OPMERKING: Het initiële celnummer en de levensvatbaarheid zijn sterk gecorreleerd met de tijd sinds de verwijdering van het orgaan en de initiële hoeveelheid weefselmonsters. Als weefsels echter in 30 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) worden geplaatst en 's nachts op ijs of in de koelkast bij 4 °C worden bewaard, kunnen NK-cellen tot 24 uur later nog steeds met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid worden uitgebreid.
- Identificeer levensvatbare weefselgebieden om lymfocyten uit weefsels en secties te verkrijgen met behulp van steriele chirurgische apparatuur.
- Plaats weefsels in 30 ml HBSS (zonder calcium of magnesium) en bewaar op ijs totdat het klaar is om zich voor te bereiden op isolatie.
- Gehakt het weefsel in < kubussen van 0,5 cm met behulp van steriele scheermesjes of scharen en tangen in een bioveiligheidskast.
- Bereid een 1x collagenase IV-oplossing (1 mg / ml) door een 10x-bouillon in HBSS te verdunnen (10x Collagenase IV: 10 mg / ml of ~ 200 U / ml).
- Plaats de gehakte weefselstukken in de weefseldissociatorbuizen. Vul de buisjes met niet meer dan 4 g weefsel en dompel de stukjes weefsel onder in ~10 ml 1x collagenase IV.
OPMERKING: Het gebruik van DNase I wordt niet aanbevolen omdat dit de levensvatbaarheid en opbrengst van NK enigszins kan verminderen. Raadpleeg de tabel met materialen voor de specifieke weefseldissociatorbuizen die worden gebruikt. - Plaats de weefseldissociatorbuizen in een weefseldissociator en meng bij 37 °C om het weefsel grondig te hakken.
OPMERKING: Voor leverweefsel kan dit meer dan 30 minuten duren. Voor meer brokkelig weefsel kan ongeveer 15 minuten voldoende zijn. Raadpleeg de tabel met materialen voor specifieke weefseldissociatorbuizen en de gebruikte weefseldissociator. - Verwijder de weefseldissociatorbuizen en triturate door 40 μm nylon celzeef met behulp van de achterkant van een spuit van 5 ml. Verzamel het eluent en gooi de grote onverteerde fragmenten weg.
- Draai het eluent op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant.
- Resuspendeer de celpellets in 30% polyvinylpyrrolidon (PVP) -gecoat silica om vetcellen te verwijderen die anders de uiteindelijke lymfocytenfractie zullen besmetten.
- Om 1x PVP-gecoat silica te bereiden, gebruikt u 9:1 verdunning van PVP-gecoat silica in 10x PBS.
OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen voor het specifieke pvp-gecoate silica dat wordt gebruikt. - Om 30% PVP-gecoat silica te bereiden, verdunt u 1x PVP-gecoat silica met PBS / HBSS.
- Om 1x PVP-gecoat silica te bereiden, gebruikt u 9:1 verdunning van PVP-gecoat silica in 10x PBS.
- Draai de celpellet op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 9 ml R-10 media.
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de samenstelling van R-10-media - Leg de celsuspensie voorzichtig over 4 ml Ficoll of lymfocytenscheidingsmedia om lymfocyten te scheiden van rode bloedcellen en polymorfonucleaire cellen.
- Scheid de lagen door centrifugeren op 400 x g gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur met de acceleratie en remmen uit of op de laagste stand. Decanteer voorzichtig de bovenste-middellange laag en oogst de interfase die weefselinfiltrerende lymfocyten bevat.
- Spoel de cellen met 10 ml media en ga verder met celtelling, flowcytometrie, aliquoting en bevriezing van cellen of primair NK-expansieprotocol.
2. Primaire NK-celexpansie van PBMC's (of CB- of orgaanweefsels) (dag 0), zoals weergegeven in figuur 2.
- Ontdooi de bevroren PBMC en de bevroren, bestraalde voedingscellen in een waterbad van 37 °C.
- Was de PBMC en 100 gamma-bestraalde (Gy-bestraalde) 221-mIL-21 cellen door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten met 10 ml R-10 media afzonderlijk.
- Bewaar 1 x 106 cellen PBMC voor flowcytometrie.
OPMERKING: De initiële NK-celzuiverheid is een belangrijke factor bij het berekenen van nk-celexpansiesnelheid. - Resuspendeer de cellen in 1 ml R-10 media. Tel de cellen met Trypan Blue.
- Meng 5x 106 cellen PBMC met 10 x 106 cellen van 100 Gy-bestraalde 221-mIL-21 cellen in een speciale 6-well plaat (zie Tabel van materialen).
- Voeg 30 ml R-10-media toe, aangevuld met humaan IL-2 (200 U/ml) en humaan IL-15 (5 ng/ml) (zie materiaaltabel).
- Incubeer de speciale 6-well plaat bij 37 °C met 5% CO2.
- Vervang de media door R-10 media aangevuld met menselijke IL-2 (200 U/ml) en menselijke IL-15 (5 ng/ml) om NK-cellen om de 3-4 dagen te behouden.
OPMERKING: Onderhoud minder dan 20 x 106 cellen per put voor verdere uitbreiding bij elke mediawissel. Voor de beste levensvatbaarheid moet u ervoor zorgen dat het totale celnummer in elke put niet groter is dan 100 x 106 cellen. - Noteer het totale celaantal, de levensvatbaarheid en voer elke 3-4 dagen flowcytometrie uit om de NK-celexpansiesnelheid te berekenen.
3. Aanhechting van 293T-cellen (dag 2), zoals weergegeven in figuur 2.
- Splits 1,8 x 106 293T cellen in 11 ml D-10 media per behandelde 100 mm plaat.
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de samenstelling van D-10-media - Incubeer 293T cellen bij 37 °C met 5% CO2.
4. Retrovirus transfectie (Dag 3)
- Meng in een buis van 1,7 ml 470 μL gereduceerde serummedia met 30 μL transfectiereagens.
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de specifieke gebruikte gereduceerde serummedia en transfectiereagens. - Voeg in een afzonderlijke buis van 1,7 ml 2,5 μg pRDF-plasmide, 3,75 μg Pegpam3-plasmide en 2,5 μg CAR-construct in SFG-vector toe aan de gereduceerde serummedia, zodat het uiteindelijke volume 500 μL is.
- Meng de oplossingen in stap 4.1 en 4.2 druppelsgewijs.
- Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 1 ml van het mengsel toe vanaf stap 4.4 tot 293T celplaat op dag 1 op een druppelsgewijze manier.
- Incubeer de plaat(en) bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48-72 uur.
5. Retronectine plaatcoating (dag 3)
- Verdun retronectine-eiwit met Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 50-100 μg/ml.
- Voeg 500 μL verdunde retronectine toe aan elk putje van een onbehandelde 24-wellsplaat (5 putjes per CAR-construct). Sluit de plaat af met parafilm en incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
6. Transductie (Dag 4)
- Centrifugeer de retronectineplaat bij 2103 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Blok elke put van de 24-well plaat met 1 ml R-10 medium.
- Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Verwarm de centrifuge voor tot 32 °C terwijl de retronectineplaat wordt geblokkeerd.
- Verzamel het retrovirus supernatant door de getransfecteerde 293T cellen te filteren met behulp van een 0,45 μm filter.
- Aliquot 2 ml van het gefilterde retrovirus supernatant in elke put.
- Centrifugeer de 24-putplaat bij 2103 x g gedurende 2 uur bij 32 °C.
- Verzamel tijdens de centrifugatie van de plaat de uitgebreide PBNK-cellen vanaf dag 0 en tel de cellen met Trypan Blue.
OPMERKING: Ga door met het uitbreiden van PBNK-cellen door R-10-media toe te voegen, aangevuld met IL-2 (200 U / ml) en IL-15 (5 ng / ml). - Verdun de geëxpandeerde PBNK-cellen met R-10-media aangevuld met IL-2 (200 U /ml) en IL-15 (5 ng / ml) tot 2,5 x 105-5 x 105 cellen / ml (0,5 x 106-1 x 106 cellen per put).
OPMERKING: Noteer het totale celnummer, de levensvatbaarheid en sla 5 x 105 uitgebreide PBNK-cellen op voor flowcytometrie, omdat deze waarden belangrijk zijn bij het bepalen van de NK-celexpansiesnelheid. - Na centrifugatie, aspirateer het retrovirus supernatant gedeeltelijk uit elke put.
OPMERKING: Niet volledig aspirateren, d.w.z. laat ongeveer 100 μL retrovirus supernatant per put achter, omdat dit de transductie-efficiëntie zal verminderen. - Aliquot 2 ml van de verdunde geëxpandeerde PBNK-cellen vanaf stap 6.8 naar elke put.
- Centrifugeer de plaat bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 32 °C. Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48-72 uur.
OPMERKING: Parafilm de plaat niet.
7. Verzameling VAN CAR-NK-cellen (dag 6 of 7), zoals weergegeven in figuur 2.
- Verzamel voorzichtig de cellen van de 24-well plaat en breng de cellen over naar een centrifugebuis van 50 ml
OPMERKING: Probeer geen bubbels te genereren, omdat dit zal resulteren in een afname van de levensvatbaarheid van cellen. - Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet met 1 ml R-10 media en tel de cellen met Trypan Blue.
OPMERKING: Bewaar 5 x 105 cellen voor flowcytometrie om de transductie-efficiëntie te bepalen. - Breng de geresuspendeerde cellen over naar een speciale 6-wellsplaat met 30 ml R-10-media aangevuld met IL-2 (200 U / ml) en IL-15 (5 ng / ml).
- Incubeer de speciale 6-well plaat bij 37 °C met 5% CO2.
- Vervang R-10 media aangevuld met IL-2 (200 U/ml) en IL-15 (5 ng/ml) om NK-cellen om de 3 - 4 dagen te behouden.
OPMERKING: Onderhoud minder dan 20 x 106 cellen per put voor verdere uitbreiding bij elke verandering. Voor de beste levensvatbaarheid moet u ervoor zorgen dat het totale celnummer in elke put niet groter is dan 100 x 106 cellen. - Noteer het totale celnummer, de levensvatbaarheid en voer elke 3-4 dagen flowcytometrie uit om de NK-celexpansiesnelheid te berekenen.
- Gebruik de cellen voor geschikte in vitro of in vivo testen.
OPMERKING: De ex vivo geëxpandeerde PBNK- en CAR-NK-cellen kunnen gedurende ongeveer 4 weken worden gekweekt in een incubator van 37 °C. - Onderzoek het NK-celnummer en de zuiverheid op dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 en dag 21 door flowcytometrie.
Representative Results
Een schematische workflow van weefselinfiltrerende NK-celisolatie en PBNK-celexpansie met behulp van de 221-mIL-21 feedercelmethodologie is weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Geëxpandeerde PBNK-cellen werden elke 3 of 4 dagen verzameld voor flowcytometrie om de ZUIVERHEID van de NK-cellen te bepalen door cellen te kleuren met anti-humane CD56 en anti-humane CD3. Het experiment werd herhaald met behulp van twee verschillende donoren om de reproduceerbaarheid van het expansiesysteem aan te tonen (figuur 3). PBNK-cellen uitgebreid met 221-mIL-21 bleken bijna 5 × 104-vouwen uit te breiden (figuur 3A). Bovendien was de NK-celzuiverheid sterk gehandhaafd, ongeveer 85% gedurende de 21-daagse expansie (figuur 3B). Met behulp van het 221-mIL-21 feedercelexpansiesysteem varieerde de NK-celzuiverheid consequent tussen 85% -95%, onafhankelijk van de donoren (gegevens niet getoond). Om de robuustheid van het 221-mIL-21 expansiesysteem aan te tonen, werden PBMC's gekleurd voor anti-CD56 en anti-CD3 voorafgaand aan de expansie, die een celzuiverheid van 7,09% voor NK-cellen en een hoog percentage T-cellen vertoonden (figuur 4A). PBMC's werden gecocultureerd met 221-mIL-21 om NK-cellen uit te breiden; de NK-zuiverheid is voorafgaand aan car-nk-transductie op dag 4 gecontroleerd (figuur 4A). CAR-NK-cellen werden verzameld en gekleurd voor anti-CD56, anti-CD3 en anti-hIgG(H+L) F(ab')2, wat een hoge NK-celpopulatie (86,9% op dag 7) en een hoge CAR-transductie-efficiëntie van ongeveer 70% liet zien (figuur 4). Hogere transductie-efficiënties (tot 95%) werden ook waargenomen met behulp van het retrovirusverpakkingssysteem. Al met al tonen deze gegevens aan dat de 221-mIL-21 feedercellen met succes NK-cellen kunnen uitbreiden en de NK-celzuiverheid ex vivo kunnen behouden.
Figuur 1: Diagram van NK-celexpansie van vaste menselijke orgaanmonsters. Kortom, de verkregen menselijke levermonsters worden gehakt in kleine blokjes voor mechanische spijsvertering. Gedissocieerde cellen worden vervolgens geïsoleerd met behulp van PVP-gecoat silica en lymfocytenscheidingsmedia. Verder worden de NK-cellen uitgebreid met behulp van het uitbreidingsprotocol zoals beschreven in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische workflow van CAR-NK-celgeneratie van PBMC's. Kortom, 221-mIL21 feedercellen werden bestraald bij 100 Gy voorafgaand aan coculturing met PBMC's aangevuld met IL-2 en IL-15 op dag 0. Tegelijkertijd werden 293T-cellen getransfecteerd met het retrovirusverpakkingssysteem om CAR-retrovirus te produceren dat vervolgens werd getransduceerd in de geëxpandeerde PBNK-cellen in aanwezigheid van IL-2 en IL-15. Primaire CAR-NK-cellen werden geoogst op dag 7 en bleven gedurende 21 dagen uitbreiden. Dit cijfer is aangepast van Yang et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dynamische time-lapsed expansie van PBNK-cellen. (A) Vouwuitbreiding van PBNK tijdens een 22-daagse tijdscursus. Cellen werden gekleurd met anti-CD56 en anti-CD3 op aangegeven dagen voor flowcytometrie. Het totale aantal NK-cellen werd bepaald door nk-celzuiverheid te vermenigvuldigen met het totale aantal cellen. De expansiesnelheid werd als volgt gegenereerd: (Aantal NK-cellen)Tn/(Aantal NK-cellen)T0, waarbij Aantal NK-cellen = (percentage NK-celzuiverheid) × (totaal aantal cellen), T0 het aantal NK-cellen is op dag 0, en Tn het aantal NK-cellen op dag n. (B) NK-celzuiverheid tijdens een 22-daagse tijdsverloop. De NK-celexpansie werd twee keer herhaald met twee verschillende donoren. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve flowcytometrische analyse van CAR-NK-cellen. (A) Representatieve dotplots die de dynamische time-lapse van NK-celzuiverheid van de CAR-NK-cellen tijdens een 18-daagse cursus laten zien. Flowcytometrie-analyse werd beoordeeld door de cellen te kleuren met anti-CD56 en anti-CD3 op aangegeven tijdstippen. Dag 0 duidt op pre-uitbreiding van PBNK. Dag 4 geeft aan na-expansie van PBNK en pre-transductie van CAR-NK cellen. Dag 7 geeft de posttransductie van CAR-NK cellen aan. (B) Representatieve stippelpunten die de transductie-efficiëntie van CAR-NK-cellen weergeven met behulp van het retrovirusverpakkingssysteem. Cellen werden gekleurd met anti-CD56, anti-CD3 en anti-hIgG(H+L) F(ab')2 voor flowcytometrie. (C) Representatieve dot plots die de CAR-expressie weergeven in verschillende subsets, waaronder CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+, en CD56-CD3- op dag 18. Cellen werden gekleurd met anti-CD56, anti-CD3 en anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (wat car-expressie aangeeft) voor flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De meeste van de huidige CAR-NK-producten in klinische onderzoeken maken gebruik van NK-cellijnen17, zoals NK-92, een cellijn geïsoleerd van een non-Hodgkin-lymfoompatiënt18, NK-92MI, IL-2 onafhankelijke NK-92-cellijn19 en NKL, geïsoleerd uit een grote granulaire lymfocytpatiënt20, omdat deze cellijnen gemakkelijk proliferatief zijn voor 'kant-en-klare' producten. Deze cellijnen, bijvoorbeeld NK-92-cellen, hebben echter marginale klinische werkzaamheid en in vivo expansie, omdat ze vóór infusie moeten worden bestraald, waardoor hun proliferatie en cytotoxiciteit in vivo worden beperkt 21. Om deze redenen worden momenteel verschillende strategieën onderzocht om primaire NK-cellen uit verschillende bronnen uit te breiden, waaronder perifeer bloed, CB, beenmerg (BM), menselijke embryonale stamcellen (HSC's), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en tumorweefsels 21,22,23. NK-cellen kunnen bijvoorbeeld ex vivo worden uitgebreid met behulp van interleukines, waaronder IL-15, IL-18 en IL-21. Lymfoblastoïde cellijnen zoals K562-cellen of Epstein-Barr Virus-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen zoals 721.221-cellen, worden ook gebruikt voor NK-celexpansie16. De bovengenoemde strategieën genereren echter vaak onvoldoende NK-cellen voor een adoptieve overdracht van CAR-NK immunotherapie22,24. Om het probleem op te lossen, toont de studie hier een protocol voor een ex vivo NK-celuitbreiding met behulp van een genetisch gemodificeerde EBV-getransformeerde cellijn, 221-mIL-21 feedercellen.
De expansiemethodologie met behulp van 221-mIL-21 feedercellen die in dit protocol wordt getoond, is geoptimaliseerd om NK-cellen uit te breiden met een expansiesnelheid van ten minste 10 tot 100 keer hoger dan andere leukemiecellijnen, waaronder HL-60 en OCl-AML3-expressiemembraan IL-21, K562 en K652-mIL21 die OX40-ligand 22,24,25 tot expressie brengen. De CAR-expressie wordt ook ex vivo gedurende ongeveer 2 weken geëvalueerd. Belangrijker is dat de 221-mIL-21 feedercelexpansiestrategie kan worden toegepast om NK-cellen uit verschillende bronnen, waaronder PBMC's, CB en vaste organen zoals de lever, uit te breiden zonder een eerste NK-verrijkingsstap. Hoewel het 221-mIL-21 feedersysteem niet zo donorafhankelijk is als de eerder genoemde feedercellijnen, is het niet helemaal onafhankelijk van donoren. Gemiddeld kan het 221-mIL-21 expansiesysteem 90% van de NK-celzuiverheid bereiken met een hoog NK-celgetal, met ongeveer <5% van de T-celverontreiniging op dag 14 na de expansie. Om de mogelijkheden van T-celverontreiniging te elimineren, is het daarom noodzakelijk om NK-cellen te isoleren van verkregen monsters voorafgaand aan de ex vivo expansie of een CD3+ selectiesysteem te gebruiken om T-cellen te elimineren na een ex vivo expansie.
Een van de kritiekpunten bij het gebruik van een NK-celexpansiesysteem is dat de feedercellen mogelijk niet volledig zijn uitgeroeid na de expansie of voorafgaand aan een transfusie, wat aanzienlijke regelgevingsproblemen kan opleveren; daarom is volledige uitroeiing van feedercellen vóór een transfusie cruciaal. Recente CAR-NK klinische studies waarin K562-mIL21-4-1BBL feedercellen werden gebruikt voor de ex vivo CBNK celexpansie24,25 toonden echter geen zorgwekkende complicaties. Bovendien toonden onze voorlopige gegevens een geleidelijke afname van de bestraalde 221-mIL-21-populatie naarmate de expansie vorderde (gegevens niet getoond). Er zijn echter uitgebreidere studies nodig om deze uitbreidingsmethode in een klinische setting te implementeren. Gezamenlijk helpt het 221-mIL-21 expansiesysteem de uitdaging van het uitbreiden van primaire CAR-NK-cellen op te lossen en zal daarom aanzienlijk bijdragen aan het bredere gebruik van CAR-NK-celgebaseerde immunotherapie in de nabije toekomst.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We willen de leden van het Liu-laboratorium (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang en Dr. Chih-Hsiung Chen) bedanken voor hun commentaar op de manuscripten. We willen Dr. Gianpietro Dotti bedanken voor de SFG vectoren en Dr. Eric Long voor de 721.221 cellen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) en Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH-programma), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti en R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) en Rutgers University-New Jersey Medical School Startup-financiering voor D. Liu Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A.
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
