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Articolo metodologico

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

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DOI:

10.3791/62405

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16 aprile 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institutes of Brian Science, Fudan University, 4Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Abstract

La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d'archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l'astroglia dall'elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.

Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l'isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l'arricchimento degli astrociti; e l'approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell'accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.

Introduzione

La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell'accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell'inevitabile attivazione cellulare durante l'elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo1 . Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) è emerso come alternativa allo smistamento delle cellule vive, consentendo la dissociazione e l'immunotagging delle popolazioni di nuclei dal tessuto congelato. Negli ultimi dieci anni, FANS è diventato ampiamente utilizzato per isolare e caratterizzare molecolarmente le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) in una varietà di campioni cerebrali e regioni anatomiche 1,2,3,4.

Tuttavia, metodi simili per isolare specifiche sottopopolazioni di nuclei gliali dalla corteccia umana sono stati limitati, portando a una relativa mancanza di sofisticazione nella comprensione della complessità degli astrociti sia nei tessuti normali che in quelli malati. A tal fine, un protocollo precedentemente pubblicato è stato adattato per isolare le popolazioni neuronali umane utilizzando FANS4 e un metodo è stato convalidato per arricchire gli astrociti (e per i progenitori oligodendrogliali) utilizzando una combinazione di tripli anticorpi, catturando gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive5. Per arricchire specificamente gli astrociti nella frazione NeuN-, sono stati utilizzati anticorpi contro uno dei due fattori di trascrizione noti per essere espressi in modo differenziale tra le popolazioni di astrociti, PAX6 o SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 è altamente espresso durante lo sviluppo fetale precoce all'interno di progenitori radiali simili a glia nelle zone germinali e contribuisce sia alla neurogenesi e alla gliogenesi 8,9,10,11, sia alla specifica neuronale retinica12. Nell'adulto, PAX6 è differenzialmente sovraespresso negli astrociti umani a riposo6 e mostra co-espressione proteica con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti del tessuto epilettico umano13.

Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo di popolazioni di nuclei neocorticali neuronali e arricchiti di astrociti da parte di FANS. Il tessuto post-mortem fresco (non fissato) congelato a scatto (cioè fresco-congelato) raccolto dalla corteccia adulta viene prima dissociato meccanicamente e chimicamente. Dopo la lisi e l'ultracentrifugazione in un gradiente di saccarosio, i componenti citoplasmatici ed extracellulari vengono scartati mentre i nuclei vengono trattenuti. I nuclei vengono quindi etichettati con anticorpi nucleari coniugati fluorescentemente corrispondenti ai lignaggi bersaglio desiderati e ordinati utilizzando FANS. Seguendo questo approccio, l'arricchimento degli astrociti è dimostrato nelle popolazioni PAX6+ NeuN- raccolte, convalidate sia da un pannello qPCR mirato che dal sequenziamento dell'RNA nucleare a valle.

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Protocollo

NOTA: Il programma per la protezione dei soggetti umani presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai (ISMMS) e il suo Institutional Review Board (IRB) assicurano la condotta etica della ricerca e la conformità con le normative federali, statali e istituzionali. In questo studio, tutti i campioni post-mortem utilizzati sono stati de-identificati, ottenuti con il consenso appropriato attraverso il biorepository, e sono stati esenti dalla designazione di "ricerca umana" dall'IRB dell'ISMMS (HS # 14-01007).

1. Preparazione del buffer

NOTA: se si esegue il sequenziamento dell'RNA a valle, trattare accuratamente tutti gli spazi di lavoro e gli strumenti con la soluzione di decontaminazione RNase per prevenire la degradazione dell'mRNA.

  1. Preparare il buffer di lisi.
    1. Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 5,47 g di saccarosio (0,32 M finale), 250 μL di 1 M CaCl2 (5 mM finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 10 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,1 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 50 μL di Triton X-100 (0,1% finale) e 17 μL di 3 M ditiotreitolo (DTT, 1 mM finale, aggiungere fresco) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Preparare il tampone di saccarosio
    1. Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 30,78 g di saccarosio (1,8 M finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 17 μL di 3 M DTT (1 mM finale, aggiungere fresco).

2. Dissociazione del tessuto congelato in sospensione monocucle

  1. Aggiungere 4 mL di tampone di lisi ghiacciato a un douncer di tessuto di vetro da 7 mL (grinder) e mantenere sul ghiaccio. Sezionare circa 200-400 mg di corteccia umana adulta appena congelata, dounce circa 50x e trasferire l'omogeneizzato tissutale in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 mL.
  2. Utilizzando una pipetta da 5 mL, aggiungere 6,5 mL di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifuga, facendo attenzione a non disturbare lo strato tra saccarosio e l'omogeneizzato tissutale.
    NOTA: se si elaborano campioni aggiuntivi, bilanciare attentamente i tubi in base al peso aggiungendo un ulteriore tampone di lisi al campione più leggero. Il bilanciamento preciso dei tubi ultracentrifuga è essenziale per prevenire danni al rotore e garantire la rotazione alla velocità corretta.

3. Ultracentrifugazione

  1. Ultracentrifugare il lisato a 24.400 giri/min (101.814 × g) per 1 ora a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet.
    NOTA: un pellet potrebbe non essere visibile se si inizia con meno di 200 mg di tessuto.
  2. Aggiungere 600 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ libero) al pellet di nuclei e incubare sul ghiaccio per 10 minuti prima di risospendere.
  3. Pipettare su e giù 50 volte per risospese il pellet di nuclei sul ghiaccio.
  4. Utilizzare un emocitometro per visualizzare i nuclei intatti al microscopio e per garantire che la concentrazione della risospensione sia superiore a 105 nuclei / mL prima di procedere alla fase successiva (combinare 10 μL dei nuclei risospesi con 10 μL di tripano blu).

4. Incubazione degli anticorpi

  1. Per immunotattare il campione per i FANS, aggiungere 500 μL del pellet del campione risospeso, 490 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale), 1 μL di anticorpo anti-NeuN di topo coniugato ad AF555 (NeuN-AF555, concentrazione finale 1:1000) e 1 μL di anticorpo anti-PAX6 di topo coniugato all'alloficocianina (PAX6-APC, concentrazione finale 1:1000).
    NOTA: Possono essere aggiunti anticorpi alternativi coniugati ad altri fluorofori (vedi discussione). Qui, l'anti-OLIG2 del topo coniugato ad AF488 (concentrazione 1:1000) è stato utilizzato con risultati favorevoli.
  2. Eseguire controlli solo 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e monocolore per impostare i parametri di gating, utilizzando una piccola quantità del campione se necessario.
    1. Per eseguire il controllo a colore singolo AF555, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo NeuN-AF555 (concentrazione 1:1000).
    2. Per eseguire il controllo APC a colore singolo, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di 10% BSA (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo PAX6-APC (concentrazione 1:1000).
    3. Per eseguire il controllo solo DAPI, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero) e 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) (DAPI verrà aggiunto in seguito, vedere 4.4).
      NOTA: se vengono utilizzati più di due anticorpi, si consiglia di eseguire il controllo della fluorescenza meno uno (FMO) oltre ai controlli monocolore.
  3. Incubare i campioni e i controlli con rotazione al buio per 1 ora a 4 °C.
  4. Aggiungere DAPI a 1:1000 a tutti i campioni e controlli e procedere con l'ordinamento.

5. Selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS)

NOTA: Si raccomanda di utilizzare una struttura istituzionale di citometria a flusso con l'assistenza di personale addestrato, a meno che non sia già esperto in tecniche di citometria / smistamento a flusso.

  1. Cancello come mostrato di seguito.
    1. In primo luogo, e per ogni campione, gate by forward scatter (FSC-A) vs. side scatter (SSC-A) per includere le particelle nell'intervallo di dimensioni appropriato per i nuclei, escludendo così i globuli rossi e i detriti (Figura 1A).
      NOTA: una preparazione di nuclei molto pulita può distinguere tra un ammasso di detriti più piccolo e un cluster di nuclei.
    2. Successivamente, e per ogni campione, gate da FSC-A vs. FSC-W (o FSC-A vs. FSC-H) e SSC-A vs. SSC-W (o SSC-A vs. SSC-H) per includere solo nuclei singoletti (Figura 1B).
    3. Successivamente, e per ogni campione, gate da PARTE DI DAPI per includere singoletti nuclei intatti (popolazione GATED ALTA DAPI), esclusi i detriti (DAPI-basso, a sinistra della popolazione gated) e i doppietti (a destra della popolazione gated) (Figura 1C).
    4. Imposta ulteriori gating basati su controlli di fluorescenza, determinati visivamente come cluster distinti su grafici FACS.
      1. Eseguire il controllo solo DAPI per determinare la colorazione di fondo delle popolazioni, in assenza di anticorpi (Figura 1D e Figura 2A).
      2. Eseguire il controllo solo NeuN-AF555 per determinare il cutoff per la colorazione NeuN+ nel canale per AF555 (Figura 2B).
      3. Eseguire il controllo solo PAX6-APC per determinare il cutoff per la colorazione PAX6+ nel canale APC (Figura 2C).
      4. Eseguire ulteriori controlli monocolore se si utilizzano più anticorpi (Figura 2D,E).
        NOTA: se si utilizzano più di due anticorpi, si consiglia un controllo FMO per visualizzare eventuali cambiamenti nelle popolazioni.
    5. Una volta eseguiti tutti i controlli, disegna i cancelli per le collezioni NeuN+ e PAX6+ al di sopra delle soglie stabilite.
      1. Gate la popolazione NeuN+ per raccogliere i neuroni (Figura 1E e Figura 2F).
      2. Gate la popolazione PAX6+ dalla popolazione NeuN- per raccogliere astrociti (Figura 1E, F e Figura 2F).
      3. Gate e raccogliere ulteriori popolazioni gliali (come le cellule progenitrici degli oligodendrociti, come mostrato qui da OLIG2+) dalla popolazione NeuN-PAX6- (Figura 1F).
        NOTA: Nel caso in cui determinare i cutoff di gating appropriati sia difficile con il software di citometria a flusso a causa di popolazioni indistinte, può essere utile modificare il numero di eventi visualizzati (aumentando o riducendo il numero di eventi sul grafico FANS).
  2. Raccogliere i campioni in modo appropriato in base all'analisi a valle prevista.

6. Raccolta di popolazioni di FANS per analisi molecolari a valle

  1. Per il sequenziamento dell'RNA di massa, raccogliere 50.000-500.000 nuclei in PBS (vedere anche paragrafo 7.1).
    1. Aggiungere 2 mL di soluzione di saccarosio, 50 μL di 1 M CaCl2 e 30 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 e riempire con PBS fino a 10 mL.
    2. Invertire e incubare sul ghiaccio per 15 min, quindi centrifugare a 900 × g per 10-15 min a 4 °C.
    3. Aspirare il surnatante, risospendere in 1 mL di reagente che estrae l'RNA, vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
    4. In alternativa, raccogliere i campioni direttamente in 200 μL del reagente che estrae l'RNA. Aggiungere il reagente che estrae l'RNA fino a 1 mL dopo lo smistamento, mantenendo un rapporto 1:1 tra il reagente e il campione selezionato. Vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
  2. Per il test di massa per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), raccogliere 50.000-75.000 nuclei in PBS in un tubo di microcentrifuga rivestito con albumina sierica bovina al 5% (BSA). Congelare i nuclei su ghiaccio secco/-80 °C o utilizzarli immediatamente per la preparazione dell'ATAC.
  3. Per sn RNA-seq o ATAC-seq, raccogliere nuclei in BSA allo 0,04% in PBS (vedere anche paragrafo 7.2).

7. Suggerimenti per la preparazione pre-libreria

  1. Preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA nucleare di massa
    1. Dopo aver raccolto il reagente di estrazione dell'RNA, eseguire l'estrazione standard di fenolo / cloroformio RNA aggiungendo fenolo / cloroformio e precipitando l'RNA dallo strato acquoso superiore con etanolo, seguita dalla digestione della DNasi su tubo (15 min).
    2. Eseguire la pulizia dell'RNA e concentrarsi in un volume finale di 15 μL di acqua.
      NOTA: Utilizzando questo metodo, il recupero rappresentativo da 300 mg di campione di corteccia adulta è di ~ 300.000 nuclei NeuN + (15-20 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione) e ~ 250.000 nuclei PAX6 + (10-12 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione). Questa resa rappresentativa può variare notevolmente in base alla qualità del campione, al rigore e al recupero dell'RNA.
    3. Eseguire una reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) prima del sequenziamento per confermare l'arricchimento degli astrociti basato sull'elevata espressione differenziale dei marcatori astrocitari canonici (GFAP, SOX9), della 10-formiltetraidrofolato deidrogenasi (ALDH1L1)) e dell'esaurimento dei marcatori neuronali e di altri marcatori di lignaggio cellulare (Figura 1G).
      NOTA: La raccolta della popolazione a doppio negativo (NeuN-PAX6-) consente un'analisi di controllo qualità qPCR più accurata e a più livelli per l'arricchimento relativo degli astrociti (Figura 2H).
    4. Genera librerie RNA-seq utilizzando un kit consigliato per valori numerici di integrità dell'RNA bassi, come previsto dai campioni post-mortem.
  2. Preparazione della libreria di sequenziamento a nucleo singolo
    1. Eseguire il sequenziamento sn attraverso un nucleo di sequenziamento istituzionale.
    2. Per l'elaborazione e il sequenziamento basati sulla nanofluidica, utilizzare la concentrazione raccomandata di 1 × 106 cellule/mL in almeno 60 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e 3 × 106 cellule/mL in almeno 20 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi mediante sequenziamento (snATAC-seq).

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Risultati

I nuclei sono stati raccolti da tessuto neocorteccia temporale fresco (non fissato) congelato a scatto con un tempo di raccolta post mortem di 12 ore. Dopo la dissociazione dei tessuti in sospensione nucleica, i campioni sono stati incubati con anticorpi contro NeuN, PAX6 e OLIG2 e ordinati in base al gating mostrato in Figura 1 e Figura 2. I nuclei sono stati raccolti da popolazioni ordinate NeuN+, PAX6+NeuN- e OLIG2+NeuN- (Figura 1E,F

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Discussione

La progettazione sperimentale secondo il protocollo delineato dovrebbe essere finalizzata dopo aver considerato diversi fattori biologici e tecnici. I campioni di tessuto di partenza sono freschi di congelamento, senza essere stati fissati, e preferibilmente hanno un breve intervallo di raccolta post-mortem per massimizzare il recupero dei nuclei. Sulla base dell'esperienza, un PMI fino a 24 ore consente un adeguato recupero dei nuclei; tuttavia, un PMI di 12 ore o meno è preferibile per ottimizzare il recupero dei nucle...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ci piace ringraziare i membri in Patologia e Neurochirurgia presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai per l'aiuto con l'approvvigionamento di tessuto cerebrale de-identificato e la citometria a flusso CORE di ISMMS per la consulenza di esperti. Lo studio è stato parzialmente finanziato da NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) e R61DA048207 (a S.A.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x PBS pH 7.2Invitrogen70013073
ANTICORPO ANTI-NEUN CLONE A60MilliporeMAB377A5MIanti-NeuN di topo coniugato a un composto fluorescente AF555 (eccitazione, 553 nm; emissione, 568 nm)
ANTICORPO ANTI-OLIG2 CLONE 211MilliporeMABN50A4MIanti-OLIG2 di topo coniugato a un composto fluorescente AF488 (eccitazione, 499 nm; emissione, 520 nm)
Bovino Albumina siericaFisherBP9704-100
Camera di conteggio Bright-LineHausser Scientific3110V
Cloruro di calcio AnidroFisherC614-3
Filtri cellulari, 40 &; MSP Scienceware136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato)InvitrogenD1306
DL-DitiotreitoloSigma43815-1G
Kit libreria DNAIllumina, NexteraFC-121... 1030
DNAse IWorthingtonLS002139
Dounce Tissue GrinderWHEATON357542
FACS SorterBD BiosciencesBD FACSAria III
Acetato di magnesio tetraidratoFisherM13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTNovusNBP234705J
RNA Clean & ConcentratoreZymo ResearchR1013
RNaseZap Soluzione di decontaminazione RNasiInvitrogenAM9780
SMARTer Kit RNA-Seq totale a filamento Pico Input MammalianClontech Laboratories635005Tempo di frammentazione di 2,5 minuti, come raccomandato per bassi valori di RNA RIN.
Saccarosio, certificato cristallo, ACS, 500 mgFisherS5500
SW 41 Ti Rotore a secchiello oscillanteColtro Beckman331362
Tris-HCl, soluzione 1M, pH 8.0, grado di biologia molecolare, ultrapuroThermo ScientificJ22638AE
TritonX-100FisherBP151-500tensioattivo non ionico nel tampone di lisi
ReagenteTRIzol LSReagente Invitrogen10296028
TRIzolReagente Invitrogen15596026per l'isolamento di RNA
Soluzione blu di tripano, 0,4%Gibco15250061
UltracentrifugaBeckman Coulter Optima XE-100A94516
Provette per ultracentrifuga PP 9/16 X 3-1/2Beckman Coulter331372
Acqua distillata ultrapura ( Invitrogen10977023indicato come acqua distillata
EDTA ultrapuroLife Technologies15576-028

Riferimenti

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  12. Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
  13. Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
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