Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Zarmeen Mussa; Jessica Tome-Garcia; Yan Jiang; Schahram Akbarian; Nadejda M. Tsankova

doi:10.3791/62405

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Articolo metodologico

Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

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DOI:

10.3791/62405

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16 aprile 2021

Zarmeen Mussa¹^,² , Jessica Tome-Garcia¹^,² , Yan Jiang³ , Schahram Akbarian²^,⁴ , Nadejda M. Tsankova¹^,²

¹Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ³Institutes of Brian Science, Fudan University, ⁴Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.

Abstract

La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d'archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l'astroglia dall'elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.

Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l'isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l'arricchimento degli astrociti; e l'approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell'accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.

Introduzione

La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell'accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell'inevitabile attivazione cellulare durante l'elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo¹ . Lo smistamento dei nuclei attiva....