Summary
우리는 하류 분자 분석에 사용하기 위해 인간 성상 세포 집단을 신선하게 냉동 된 조직으로부터 풍부하게하고 분리하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
인간 성상세포의 복잡성은 일차 인간 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 격리 및 분자 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 형광 활성화 핵 분류(FANS)는 동결된 보관 조직에서 인간 뉴런 핵(NeuN+) 집단을 성공적으로 분리하고 연구하는 데 사용할 수 있으므로 신선한 조직 취급과 관련된 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 유사하게 비신경세포(NeuN-) 요소로부터 아스트로아교세포를 분리하려는 노력은 결여되어 있다. 최근에 개발되고 검증된 면역태깅 전략은 세 개의 전사인자 항체를 사용하여 농축된 뉴런(NeuN+), 성상세포(쌍을 이룬 박스 단백질 6(PAX6)+NeuN-) 및 희소돌기아교세포 전구세포(OLIG2+NeuN-) 핵 집단을 병에 걸리지 않은, 신선한(고정되지 않은) 스냅 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 조직으로부터 동시에 분리한다.
이 기술은 원발성 병리학적 간질 신피질에서 세포 유형 특이적 전사체 변경의 특성화에 유용한 것으로 나타났다. 전사체 분석은 PAX6+NeuN-분류된 집단이 범성상세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 휴식 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획한다는 것을 확인했다. 이 논문은 단일 핵 (sn) 현탁액으로의 조직 해리를 포함하여 신선하고 냉동 된 인간 피질로부터 성상 세포가 풍부한 핵 집단을 분리하기위한 FANS 방법론을 설명합니다. 항-NeuN 및 항-PAX6 형광 접합된 항체를 사용한 핵의 면역태깅; 분류 중 민감도와 특이성을 최적화하고 성상세포 농축을 확인하기 위한 FANS 게이팅 전략 및 품질 관리 지표; 그리고 대량 또는 sn 해상도에서 다운스트림 전사체 및 크로마틴 접근성 시퀀싱에 대한 조달을 권장한다. 이 프로토콜은 다양한 병리를 가진 비 괴사성, 신선하고 냉동 된 인간 피질 표본에 적용 가능하며 24 시간 이내에 사후 조직 수집을 권장합니다.
Introduction
인간 성상세포의 분자 복잡성은 일차 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 건강과 질병 모두에서 고해상도로 분리 및 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 손상되지 않은 인간 뉴런과 글리아를 틈새 시장으로부터 분리하는 것은 신선한 뇌 조직 샘플의 제한된 접근, 신경교 및 신경 세포의 심하게 상호 연결된 특성, 처리 중 필연적 인 세포 활성화로 인해 어려운 것으로 입증되었으며, 이들 모두는 이러한 세포 유형의 분자 특성화를 제한합니다 생체 외1 . 형광 활성화 핵 분류 (FANS)는 살아있는 세포 분류의 대안으로 등장하여 동결 된 조직에서 핵 집단의 해리 및 면역 태깅을 가능하게합니다. 지난 10 년 동안 FANS는 다양한 뇌 표본 및 해부학 적 영역1,2,3,4에서 인간 신경 (NeuN +) 핵 집단을 분리하고 분자적으로 특성화하는 데 널리 사용되었습니다.
그러나, 인간 피질로부터 특정 신경교세포 하위집단을 분리하기 위한 유사한 방법들이 제한되어, 정상 및 병든 조직 둘 다에서 성상세포 복잡성에 대한 이해에서 정교함의 상대적 부족으로 이어졌다. 이를 위해, 이전에 발표된 프로토콜이 FANS4를 사용하여 인간 뉴런 집단을 단리하기 위해 채택되었고, 삼중-항체 조합을 사용하여 성상세포(및 올리고덴드로아교세포 전구인자)를 풍부하게 하는 방법이 검증되었고, 휴지 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획하였다5. NeuN-분획에서 성상세포에 대해 특이적으로 농축하기 위해, 성상세포 집단에 걸쳐 차등적으로 발현되는 것으로 알려진 두 개의 전사 인자 중 하나인 PAX6 또는 SRY-box 전사 인자 9 (SOX9)6,7에 대한 항체를 사용하였다. PAX6는 발아 영역에서 방사상 신경교세포 유사 전구물질 내에서 초기 태아 발달 동안 고도로 발현되며, 신경발생 및 교형성8,9,10,11 뿐만 아니라 망막 신경세포 사양 12에도 기여한다. 성인에서, PAX6는 휴지 인간 성상세포(6)에서 차별적으로 과발현되고, 인간 간질 조직 성상세포(13)에서 신경교모세서 산성 단백질(GFAP)과 단백질 공동발현을 나타낸다.
이 프로토콜은 FANS에 의한 신피질 뉴런 및 성상세포 풍부 핵 집단의 동시 분리를 기술한다. 성인 피질로부터 수집된 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동(즉, 신선한-냉동된) 사후 조직은 먼저 기계적으로 그리고 화학적으로 해리된다. 수크로오스 구배에서 용해 및 초원심분리 후, 핵이 유지되는 동안 세포질 및 세포외 성분은 폐기된다. 그런 다음 핵을 원하는 표적 혈통에 상응하는 형광 접합된 핵 항체로 표지하고 FANS를 사용하여 분류한다. 이 접근법에 따라, 성상세포의 농축은 수집된 PAX6+NeuN-집단에서 입증되며, 표적화된 qPCR 패널뿐만 아니라 하류 핵 RNA 시퀀싱에 의해 모두 검증된다.
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Protocol
참고 : 마운트 시나이 (ISMMS)의 이칸 의과 대학 (ISMMS)과 기관 검토위원회 (IRB)의 인간 과목 보호 프로그램은 연구의 윤리적 행위와 연방, 주 및 기관 규정 준수를 보장합니다. 이 연구에서, 사용된 모든 사후 표본은 비식별화되었고, 생물저장소를 통해 적절한 동의하에 획득되었으며, ISMMS의 IRB(HS#14-01007)에 의한 "인간 연구" 지정에서 면제되었다.
1. 완충액 준비
참고: 다운스트림 RNA 시퀀싱을 수행하는 경우 mRNA 분해를 방지하기 위해 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 작업 공간 및 도구를 철저히 처리하십시오.
- 용해 완충액을 준비하십시오.
- 50 mL까지의 증류수H2O에 다음을 용해시킨다: 5.47 g의 수크로오스 (0.32 M 최종), 250 μL의 1 MCaCl2 (5 mM 최종), 150 μL의 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM 최종), 10 μL의 500 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (0.1 mM 최종), 500 μL의 1 M 트리스-HCl (pH 8) (10 mM 최종), 50 μL의 트리톤 X-100 (0.1% 최종) 및 17 μL의 3 M 디티오트레이톨 (DTT, 1 mM 최종, 신선한 첨가) ( 물질의 표 참조).
- 수크로오스 버퍼 준비
- 최대 50 mL의 증류된H2O에 다음을 용해시킨다: 30.78 g의 수크로오스 (1.8 M 최종), 150 μL의 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM 최종), 500 μL의 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM 최종), 17 μL의 3 M DTT (1 mM 최종, 신선한 첨가).
2. 동결된 조직을 단핵 현탁액으로 해리
- 빙냉 용해 완충액 4 mL를 7 mL 유리 조직 더서(grinder)에 첨가하고, 얼음 위에 보관하십시오. 신선하게 냉동된 인간 성인 피질 약 200-400 mg을 해부하고, 대략 50x를 더덕이고, 조직 균질액을 12 mL 초원심분리 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.
- 5 mL 피펫을 사용하여, 6.5 mL의 빙냉 수크로오스 완충액을 초원심분리 튜브의 바닥에 첨가하고, 수크로오스와 조직 균질물 사이의 층을 방해하지 않도록 주의한다.
참고: 추가 샘플을 처리하는 경우 더 가벼운 샘플에 용해 버퍼를 추가하여 튜브 중량의 균형을 조심스럽게 조정하십시오. 초원심분리 튜브의 정확한 균형은 로터의 손상을 방지하고 적절한 속도로 회전을 보장하는 데 필수적입니다.
3. 초원심분리
- 용해물을 4°C에서 1시간 동안 24,400 rpm (101,814 × g)에서 초원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액과 파편을 조심스럽게 흡인하십시오.
참고: 200mg 미만의 조직으로 시작하면 펠렛이 보이지 않을 수 있습니다. - 600 μL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (Ca2+,Mg2+ 무함유)를 핵 펠릿에 첨가하고, 재현탁하기 전에 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
- 핵 펠릿을 얼음 위에 재현탁시키기 위해 50 번 위아래로 피펫을 상하로 피펫하십시오.
- 혈구 분석기를 사용하여 현미경으로 손상되지 않은 핵을 시각화하고 다음 단계로 진행하기 전에 재현탁물의 농도가 105 핵 / mL 이상인지 확인하십시오 (재현탁 된 핵 10 μL와 트리판 블루 10 μL를 결합).
4. 항체 배양
- FANS에 대한 샘플을 면역태그하기 위해, 500 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 490 μL의 1x PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10% BSA (0.1% 최종), 1 μL의 마우스 항-NeuN 항체 AF555에 접합된 (NeuN-AF555, 1:1000 최종 농도), 및 1 μL의 마우스 항-PAX6 항체 (PAX6-APC, 1:1000 최종 농도)를 첨가하였다.
참고: 다른 형광단에 접합된 대체 항체가 첨가될 수 있다 (논의 참조). 여기서, AF488에 접합된 마우스 항-OLIG2 (1:1000 농도)를 유리한 결과와 함께 사용하였다. - 필요에 따라 소량의 샘플을 사용하여 게이팅 파라미터를 설정하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 전용 및 단색 제어를 수행합니다.
- AF555 단색 조절을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1x PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10% BSA (0.1% 최종) 및 1 μL의 NeuN-AF555 항체 (1:1000 농도)를 첨가한다.
- APC 단색 조절을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1X PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유), 10 μL의 10% BSA (0.1% 최종), 및 1 μL의 PAX6-APC 항체 (1:1000 농도)를 첨가하였다.
- DAPI 전용 대조군을 수행하기 위해, 20 μL의 재현탁된 샘플 펠렛, 970 μL의 1X PBS (Ca2+,Mg2+ 무함유) 및 10 μL의 10% BSA (0.1% 최종)를 첨가한다 (DAPI는 나중에 첨가될 것이다, 4.4 참조).
참고: 두 개 이상의 항체를 사용하는 경우 단색 대조군 외에 형광-마이너스-원(FMO) 조절을 수행하는 것이 좋습니다.
- 샘플 및 대조군을 4°C에서 1 h 동안 어둠 속에서 회전하면서 인큐베이션한다.
- 1:1000에 DAPI를 모든 샘플 및 컨트롤에 추가하고 정렬을 진행합니다.
5. 형광 활성화 핵 분류 (팬)
참고 : 유세포 측정 / 분류 기술에 이미 능숙하지 않은 한 숙련 된 인력의 도움을 받아 기관 유세포 측정 시설을 사용하는 것이 좋습니다.
- 게이트는 아래와 같습니다.
- 먼저, 각 샘플에 대해, 순방향 산란(FSC-A) 대 게이트에 의한 게이트 측면 산란(SSC-A)은 핵에 적합한 크기 범위의 입자를 포함하는데, 따라서 적혈구 및 파편을 배제한다(도 1A).
참고 : 매우 깨끗한 핵 준비는 더 작은 파편 클러스터와 핵 클러스터를 구별 할 수 있습니다. - 다음으로, 각 샘플에 대해, FSC-A 대 FSC-W(또는 FSC-A 대 FSC-H) 및 SSC-A 대 SSC-W(또는 SSC-A 대 SSC-H)에 의해 게이트하여 단일항 핵만을 포함한다(도 1B).
- 다음에, 각 샘플에 대해, DAPI에 의한 게이트는 무손상 핵 일중항 (DAPI-고 게이티드 집단), 파편을 배제 (DAPI-낮은, 게이트 집단의 왼쪽에) 및 이중 (게이트 집단의 오른쪽에) (도 1C)을 포함한다.
- FACS 플롯에서 별개의 클러스터로 시각적으로 결정된 형광 제어를 기반으로 추가 게이팅을 설정합니다.
- DAPI 전용 대조군을 실행하여 항체가 없는 집단의 배경 염색을 결정한다(도 1D 및 도 2A).
- NeuN-AF555 전용 대조군을 실행하여 AF555에 대한 채널에서 NeuN+ 염색에 대한 컷오프를 확인하였다(도 2B).
- PAX6-APC 전용 컨트롤을 실행하여 APC 채널에서 PAX6+ 염색에 대한 컷오프를 확인합니다(그림 2C).
- 더 많은 항체를 사용하는 경우 추가 단색 컨트롤을 실행합니다(그림 2D,E).
참고: 두 개 이상의 항체를 사용하는 경우, FMO 대조군은 모집단의 변화를 시각화하는 것이 좋습니다.
- 모든 컨트롤이 실행되면 NeuN+ 및 PAX6+ 컬렉션의 게이트를 설정된 임계값 이상으로 그립니다.
- 뉴런을 수집하기 위해 NeuN+ 집단을 게이트한다(도 1E 및 도 2F).
- NeuN-집단으로부터 PAX6+ 집단을 게이트하여 성상세포를 수집한다(도 1E, F 및 도 2F).
- 게이트하고 NeuN-PAX6-집단으로부터 추가적인 신경교세포 집단 (예를 들어, OLIG2+에 의해 여기에 나타낸 바와 같은 올리고덴드로세포 전구 세포)을 수집한다 (도 1F).
참고: 불분명한 집단으로 인해 유세포 분석 소프트웨어에서 적절한 게이팅 컷오프를 결정하는 것이 어려운 경우, 시각화되는 이벤트 수를 수정하는 것이 도움이 될 수 있습니다(FANS 플롯의 이벤트 수 증가 또는 감소).
- 먼저, 각 샘플에 대해, 순방향 산란(FSC-A) 대 게이트에 의한 게이트 측면 산란(SSC-A)은 핵에 적합한 크기 범위의 입자를 포함하는데, 따라서 적혈구 및 파편을 배제한다(도 1A).
- 의도된 다운스트림 분석을 기반으로 적절하게 샘플을 수집합니다.
6. 다운스트림 분자 분석을 위한 FANS 집단 수집
- 벌크 RNA 시퀀싱을 위해, PBS에서 50,000-500,000개의 핵을 수집한다(또한 섹션 7.1 참조).
- 2 mL의 수크로오스 용액, 50 μL의 1 MCaCl2, 및 30 μL의 1 M Mg(CH3COO)2를 첨가하고, 10 mL까지의 PBS로 채운다.
- 역전 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 10-15분 동안 900 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고, RNA 추출 시약 1 mL에 재현탁시키고, 와류시키고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, -80°C에서 저장한다.
- 대안적으로, 샘플을 200 μL의 RNA 추출 시약 내로 직접 수집한다. 분류 후 RNA 추출 시약을 최대 1 mL까지 첨가하고, 분류된 샘플에 대한 시약의 1:1 비율을 유지한다. 소용돌이, 드라이 아이스 상에서 동결, -80°C에서 저장.
- 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 벌크 분석을 위해, 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅된 마이크로원심분리 튜브에서 PBS 중의 50,000-75,000 핵을 수집한다. 드라이 아이스 / -80 °C에서 핵을 동결하거나 즉시 ATAC 준비에 사용하십시오.
- sn RNA-seq 또는 ATAC-seq의 경우, PBS 중의 0.04% BSA에서 핵을 수집한다(또한 섹션 7.2 참조).
7. 도서관 예비 준비 팁
- 벌크 핵 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비
- RNA 추출 시약으로 수집 한 후 페놀 / 클로로포름을 첨가하고 에탄올로 상부 수층에서 RNA를 침전시켜 표준 페놀 / 클로로포름 RNA 추출을 수행 한 다음 튜브에서 DNase 소화 (15 분)를 수행하십시오.
- RNA 클린업을 수행하고 15 μL의 최종 부피의 물에 농축하십시오.
참고: 이 방법을 사용하여 성인 피질 샘플 300mg에서 회수되는 대표적인 방법은 ~300,000 NeuN+ 핵(정리 및 농축 후 총 RNA 15-20ng/μL)과 PAX6+ 핵(정리 및 농축 후 총 RNA 10-12ng/μL)이 ~250,000개입니다. 이 대표적인 수율은 샘플 품질, 게이팅 엄격성 및 RNA 회수에 따라 크게 달라질 수 있습니다. - 정준 성상세포 마커(GFAP, SOX9), 10-포르밀테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제(ALDH1L1))의 높은 차등 발현과 뉴런 및 기타 세포계 마커의 고갈에 기초하여 성상세포의 농축을 확인하기 위해 시퀀싱 전에 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 수행한다(도 1G).
참고: 이중 음성 집단(NeuN-PAX6-)의 수집은 성상세포의 상대적 농축을 위한 보다 정확하고 다층적인 qPCR 품질 관리 분석을 가능하게 합니다(그림 2H). - 사후 샘플에서 예상한 바와 같이 낮은 RNA 무결성 수 값에 권장되는 키트를 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 생성합니다.
- 단일 핵 시퀀싱 라이브러리 준비
- 기관 시퀀싱 코어를 통해 sn 시퀀싱을 수행합니다.
- 나노유체 기반 처리 및 시퀀싱의 경우, 단일 핵 RNA-시퀀싱(snRNA-seq)의 경우 1x PBS + 0.04% BSA의 최소 60μL에 1 ×× 106 세포/ mL의 권장 농도를 사용하고, 1x PBS + 0.04% BSA의 최소 20 μL에서 106 세포/mL의 권장 농도를 1x PBS + 0.04% BSA로 시퀀싱(snATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제-접근 가능한 크로마틴에 대한 단일 핵 분석의 경우 0.04% BSA를 사용합니다.
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Representative Results
핵은 12 h의 사후 수집 시간을 갖는 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동 측두엽 신피질 조직으로부터 수집되었다. 핵 현탁액 내로 조직을 해리시킨 후, 샘플을 NeuN, PAX6 및 OLIG2에 대한 항체와 함께 인큐베이션하고, 도 1 및 도 2에 도시된 게이팅에 따라 분류하였다. 핵은 NeuN+, PAX6+NeuN-, 및 OLIG2+NeuN-분류된 집단으로부터 수집되었다(도 1E, F 및 도 2F). 표적화된 qPCR 패널은 PAX6+(NeuN-) 집단에서 범성상세포 마커인 GFAP 및 ALDH1L1 에 대한 농축을 밝혀냈다(도 1G 및 도 2H). 추가적으로, OLIG2+ 집단을 올리고덴드로사이트 전구세포(OPC) 마커 PDGFRA 에 대해 농축시켰다(도 1G). 수집된 집단의 벌크 RNA 시퀀싱은 PAX6+(NeuN-) 집단에서 성상세포 마커의 비교 농축 및 뉴런 마커의 고갈을 보여주었다(도 1H). 면역형광은 성인 인간 피질 성상세포에서 PAX6와 GFAP의 공동국소화를 확인하였다(도 1I).
단색 컨트롤을 검토하면 각 마커에 대해 뚜렷한 양수 및 음수 모집단이 나타나므로 수집을 위한 정확한 컷오프를 설정할 수 있습니다(그림 2A-G). 또한, 성상세포-풍부 FANS 단리를 성상세포 핵 마커인 SOX9 및 PAX6에 대한 두 개의 상이한 항체와 비교하였다. 성상세포 풍부 게이트 내에서 SOX9(~6%)를 사용하는 팬보다 PAX6(~13.8%)를 사용하는 팬에 의해 더 높은 비율의 핵 이벤트가 포착되었습니다(그림 2F,G). 표적화된 qPCR 패널은 SOX9+(NeuN-) 및 PAX6+(NeuN-) 집단 모두에서 GFAP, PAX6 및 SOX9에 대한 농축을 밝혀냈다(도 2H). 조직 수집의 다양한 사후 간격 (PMI)을 갖는 몇몇 샘플의 해리 및 염색을 소급적으로 비교한 결과, 더 짧은 PMI가 더 큰 무손상 핵 회복과 관련된다는 것이 밝혀졌다 (도 3A). 최대 24 h의 PMI를 갖는 동결 조직은 최대 90 %의 무손상 핵의 높은 비율을 산출했다; 그러나 30시간 PMI에서는 손상되지 않은 핵을 거의 회수할 수 없었다(그림 3A). 표준 프로토콜에 항체-세척 단계를 포함하여(전형적으로 회수를 최적화하기 위해 이 단계를 생략함) 별개의 NeuN+/- 또는 PAX6+/- 집단의 분리에서 유의한 이동을 나타내지 않았다(도 3B).
때때로, PAX6+NeuN-집단의 불량한 분리는 생존 가능한 핵의 비율이 높은 샘플에서도 볼 수 있었고(그림 3C), 조직 해리 및 FANS 프로토콜의 반복이 필요했다. 단일핵 RNA-seq 연구는 PAX6 를 신피질뿐만 아니라 심실 하부 구역(SVZ) 및 인접한 선조체에서도 원형질 및 섬유성 성인 성상세포 하위집단 둘 다에 걸쳐 차등적으로 발현된 핵 전사 인자로서 더욱 우선시하였다(도 3D). 동일한 뇌 샘플에서 유래된 신피질과 선조체 사이의 NEUN/PAX6/OLIG2 삼중 팬의 비교는 PAX6+ 핵의 분리에서 지역별 차이를 보였다(도 3E). 이 프로토콜은 현재 신피질에 대해서만 유효성이 검사됩니다.
도 1: FANS에 의한 뉴런 및 성상세포 농축 분리의 검증. (A-F) 파편과 더블릿(A-C)을 배제하고 (D) (E-F) 농축 뉴런(NeuN+), 성상세포(PAX6+NeuN-) 및 OPC(OLIG2++NeuN-) 핵 집단의 수집을 위한 DAPI 전용 대조군을 사용하여 배경 염색을 정의하기 위한 순차적 FANS 게이팅의 대표적인 예. (g) 수집된 집단의 품질 관리를 위한 범성상세포(GFAP, ALDH1L1), 뉴런(RBFOX3), 및 OPC(PDGFRA) 마커를 사용하는 최소 qPCR 패널(A-G: 병리학이 없는 측두엽 신피질 부검 표본, 12시간 PMI, 100,000개의 사건 표시; 점선은 양성 게이팅된 순차적 집단을 나타냄; 실선은 세포형 농축 집단의 최종 수집을 나타냄). (h) PAX6+ 및 NeuN+ 분류된 집단에서 정준 성상세포 및 뉴런 마커의 발현을 보여주는 행-정규화된 벌크 RNA 시퀀싱 데이터로부터 생성된 히트맵(n=3 부검 사례, 병리가 없는 측두엽 신피질, PMI 12-21 h). (i) 인간 신피질에서 PAX6, GFAP, 및 NeuN의 대표적인 면역형광 이미지. 화살표는 PAX6 및 GFAP를 공동발현하는 성상세포를 나타낸다. 약어: FANS = 형광-활성화 핵 분류; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; NeuN = 뉴런 핵; PAX6 = 짝을 이룬 박스 단백질 6; OLIG2 = 희소돌기아교세포 전사인자 2; OPC = 희소돌기아교세포 전구세포; qPCR = 정량적 중합효소 연쇄 반응; GFAP = 신경교세포 세동 산성 단백질; ALDH1L1 = 10-포르밀테트라하이드로폴레이트 탈수소효소; RBFOX3 = RNA-결합 단백질 FOX-1 상동체 3; PDGFRA = 혈소판 유래 성장 인자 알파; PMI = 사후 간격; SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-A = 전방 산란 영역; SSC-W = 측면 산란 폭; FSC-W = 순방향 산란 폭; NeuN-555 = 마우스 항-NeuN AF555에 컨쥬게이션된; PAX6-APC = 마우스 항-알로피코시아닌에 접합된 PAX6; OLIG2-488 = 마우스 항-OLIG2 접합된 488 nm 레이저 라인에 대해 녹색 형광 염료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PAX6 또는 SOX9 항체를 사용한 성상세포 풍부 집단의 비교 단리. (A-E) DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 및 OLIG2에 대한 단색 대조군은 각각의 형광 채널에서 양성/음성 컷오프를 정의한다. (F-G) (F) NeuN/PAX6 또는 (G) NeuN/SOX9 항체를 사용한 성상세포 농축 단리를 위한 비교 FAN 방법. 성상세포-풍부 게이트 내에서 SOX9에 의해서보다 PAX6에 의해 더 많은 수의 사건들이 포착된다. (A-G: 모든 실험에 사용된 동일한 사후 비병리학적 측두엽 신피질 표본; 12시간 PMI; 10,000 사건 표시). (h) 품질 관리 qPCR 분석은 F-G로부터 PAX6+(NeuN-) 및 SOX9+(NeuN-) 분류된 집단에서 성상세포 마커의 농축 및 비성상세포 마커의 고갈을 확인한다(데이터는 ACTB로 정규화되고 NeuN+ 집단의 배수 변화로서 정량화됨). 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; NeuN = 뉴런 핵; PAX6 = 짝을 이룬 박스 단백질 6; OLIG2 = 희소돌기아교세포 전사인자 2; SOX9 = SRY-박스 전사 인자 9; qPCR = 정량적 중합효소 연쇄 반응; GFAP = 신경교세포 세동 산성 단백질; RBFOX3 = RNA-결합 단백질 FOX-1 상동체 3; PDGFRA = 혈소판 유래 성장 인자 알파; PMI = 사후 간격; NeuN-555 = 마우스 항-NeuN AF555에 컨쥬게이션된; PAX6-APC = 마우스 항-알로피코시아닌에 접합된 PAX6; OLIG2-488 = 마우스 항-OLIG2 접합된 488 nm 레이저 라인에 대해 녹색 형광 염료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성공적인 FANS 실험을 위한 의존적이고 독립적인 지표. (A) 샘플 수집 PMI가 핵의 품질에 미치는 영향: 낮은 PMI는 최대 24시간까지 적절한 결과로 더 많은 수의 온전한 핵을 회복할 수 있게 한다. (B) 항체 인큐베이션 후 세척 단계를 포함해도 FANS 집단을 시각적으로 이동시키는 것으로 보이지 않는다. (c) 뚜렷한 PAX6+(NeuN-) 집단(오른쪽)의 결여와 함께 실패한 FANS 실험의 예는 온전한 핵과 낮은 배경(왼쪽)의 존재에도 불구하고 (사후 측두엽 신피질, 비병리학적, 7시간 PMI). (d) 다른 세포 유형과 비교하여 피질과 SVZ 모두에서 원형질 및 섬유성 성상세포 하위집단에 걸쳐 PAX6 및 2개의 다른 성상세포 핵 인자인 SOX9 및 LHX2의 차등적 발현을 나타내는 성인 인간 sn RNA-seq 데이터의 히트맵 표현(적색 구배는 로그-정규화된 평균 유전자 발현 값의 스펙트럼을 나타내고; n=3개의 별개의 부검 경우, 43,619개의 총 핵). (E) 뚜렷한 뇌 영역 (측두엽 신피질 vs. SVZ 및 아자센트 선조체)는 NeuN/PAX6/OLIG2 분리의 상이한 패턴을 보여준다. 약어: FANS = 형광-활성화 핵 분류; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; NeuN = 뉴런 핵; PAX6 = 짝을 이룬 박스 단백질 6; OLIG2 = 희소돌기아교세포 전사인자 2; GFAP = 신경교세포 세동 산성 단백질; ALDH1L1 = 10-포르밀테트라하이드로폴레이트 탈수소효소; LXH2 = LIM 호메오박스 2; PMI = 사후 간격; SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-A = 전방 산란 영역; NeuN-555 = 마우스 항-NeuN AF555에 컨쥬게이션된; PAX6-APC = 마우스 항-알로피코시아닌에 접합된 PAX6; OLIG2-488 = 488 nm 레이저 라인에 대해 녹색 형광 염료에 접합된 마우스 항-OLIG2; SVZ = 심실 하부 구역; A(p) = 원형질(회색물질) 성상세포; A(f) = 섬유성 (백질) 성상세포; OL = 희소돌기아교세포; OPC = 희소돌기아교세포 전구세포; EN = 흥분성 뉴런; MSN = 중간 스파이니 뉴런; MG = 미세아교세포; BVC = 혈관 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
개략적인 프로토콜에 따른 실험 설계는 몇 가지 생물학적 및 기술적 요인을 고려한 후에 마무리되어야 한다. 출발 조직 샘플은 신선-고정되지 않고 신선하게 동결되고, 바람직하게는 핵 회복을 최대화하기 위해 짧은 사후 수집 간격을 갖는다. 경험에 비추어 볼 때, 최대 24 시간의 PMI는 적절한 핵 회복을 가능하게합니다. 그러나, 12 h 이하의 PMI는 무손상 핵 회복을 최적화하기 위해 바람직하다. 신체 저장 온도 및 조직의 pH 수준을 포함하는 PMI를 제외한 추가 인자는 또한 핵 수율에 영향을 미칠 수 있지만, 이들 연구14에서는 설명되지 않았다. 일화적인 경험으로부터, FANS 회복은 -80°C에서 5년까지 저장되는 동일한 조직과 필적하는 것으로 밝혀졌지만, 세포형 특이적 발현에 대한 저장의 가변성을 평가하기 위해 제어된 실험은 수행되지 않았다. 항체 인큐베이션 후 샘플을 세척하는 것은 고려가 필요할 수 있는 또 다른 변수이다. 일반적으로, 세척 단계는 전체 수율을 감소시키지만, 별개의 면역표지된 집단의 분리를 개선할 수 있다. 이들 연구에서, 사후 항체 세척 단계를 포함하거나 배제할 때 NEUN/PAX6 집단의 분리에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았지만, 이 단계는 다른 일차 및 이차 항체를 사용할 때, 특히 이들이 예비접합되지 않은 경우에 유익할 수 있다.
선별 장비의 감도가 가변적이기 때문에 각 선별 이벤트에서 적절한 제어를 수행해야합니다. 혈구측정기 상에서 시각화할 때 재현탁된 샘플에서 과도한 세포외 파편이 보이는 경우, 샘플은 핵만을 보유하기 위해 40 μm 필터를 통과할 수 있다. 샘플이 제한되는 경우, 적절한 형광단으로 태그된 비드가 또한 단색 및 FMO 제어에 사용될 수 있다. 샘플이 qPCR 또는 시퀀싱 결과에 의해 결정된 바와 같이 원하는 성상세포 집단에 대해 농축되지 않는 것으로 보인다면, 모든 NeuN- 및 PAX6+(NeuN-) 집단을 보다 엄격하게 게이트하는 것이 도움이 될 수 있으며, 양성 및 음성 집단에 대한 게이트 컷오프 사이에 더 많은 공간을 남겨두었다.
여기에 기술된 검증 연구의 대부분은 NeuN 및 PAX6 이외에 OLIG2를 사용하여 수행되었으며, 신경, 성상세포 및 올리고덴드로사이트 전구(OPCs) 핵 집단을 동시에 풍부하게 하였다. OLIG2를 NeuN-분획 내에서 피질 성상세포를 보다 효과적으로 풍부하게 하기 위한 세 번째 계통 마커로서 포함하는 것이 좋다. FITC-컨쥬게이션된 OLIG2의 존재 또는 부재는 PAX6+ 집단을 이동시키는 것으로 보이지 않는다; 따라서, OLIG2를 제외한 실험은 유사한 성상세포 농축을 초래할 것이라는 가정이다. 참고로, 일부 뉴런 집단은 NeuN 및 PAX615 둘 다를 발현하기 때문에 PAX6+ 집단이 NeuN-집단으로부터 게이팅되는 것이 필수적이다. 성상세포는 또한 SOX9 발현에 따라 분류될 수 있고; 그러나, SOX9를 사용한 염색 및 분류는 PAX6에 비해 성상세포의 덜 강력한 농축을 유도한다. 성인 피질에서 신경세포, 성상세포 및 OPC 계통 사이에서 명확한 분리가 관찰되었지만, 성인 SVZ와 인접한 선조체에서 PAX6+와 OLIG2+ 집단 사이에서 유사한 분리가 관찰되지 않았다.
SVZ로부터의 일부 성상세포가 낮은 수준의 OLIG2를 발현할 가능성이 있지만, 수집된 집단은 qPCR에 의해서만 검증되었다(데이터는 나타내지 않음); 따라서, 하류 RNA 시퀀싱은 이들 집단의 순도를 추가로 정의하는데 도움이 될 수 있다. 추가적으로, 이 프로토콜은 집단-특이적 핵 마커를 사용하여 동결된 태아 뇌 조직 및 뇌 종양 조직으로부터 핵을 분리하도록 적응될 수 있다. 이들 조직은 상당히 더 많은 세포성이기 때문에, 핵의 응집을 최소화하기 위해 더 적은 조직으로 시작하는 것이 도움이 될 수 있다. 신생물성 조직으로부터 이수성 핵을 분류할 때, DAPI 게이팅은 잠재적으로 더 높은 형광을 차지하도록 조정된다. 현재 프로토콜은 비 신생물성 샘플에 대해서만 검증되므로 사용자는 신생물 조직에 대해 FANS를 수행하기 전에 신중한 검증을 수행하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 전술한 프로토콜은 뉴런을 풍부하게 하기 위해 이전에 확립된 프로토콜로부터 적응된 농축된 성상세포 집단을 단리하기 위한 검증된 전략을 제시한다. 이 방법론은 추가 분자 분석에 사용하기 위해 정상 및 병든 피질 뇌 조직 모두에서 성상 세포 핵 집단을 효과적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 마운트 시나이 (Mount Sinai)의 이칸 의과 대학 (Icahn School of Medicine)의 병리학 및 신경 외과 회원들에게 비 식별 뇌 조직 조달과 ISMMS의 유세포 측정 CORE에 대한 전문가의 조언을 구해 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.), R61DA048207 (S.A.까지)에 의해 부분적으로 자금을 지원받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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