Summary
ここに記載されるのは、細胞抑制性タンパク質SAMHD1によるHIV−1制限の程度を決定するための確立された方法である。ヒト骨髄系譜U937細胞は、YFPを共発現するSAMHD1発現ベクターで形質導入され、分化され、HIV-RFPでチャレンジされます。制限のレベルは、フローサイトメトリー分析によって決定されます。
Abstract
滅菌αモチーフ/ヒスチジン-アスパラギン酸ドメイン含有タンパク質1(SAMHD1)は、静止骨髄細胞におけるHIV-1の複製を阻害します。U937細胞は、SAMHD1 RNA発現のレベルが低いため、SAMHD1活性を分析するための便利な細胞系として広く使用されており、検出できない内因性タンパク質発現につながります。他のレトロウイルス制限因子を特徴付けるためにストイ研究所で開発された同様のアッセイに基づいて、ビショップラボはU937細胞中のSAMHD1を分析するための2色制限アッセイを開発しました。マウス白血病 SAMHD1を発現するウイルス様粒子は、IRESから発現するYFPとともに、U937細胞を形質導入するために使用されます。次いで、細胞をホルボールミリスチン酸酢酸塩で処理して、静止表現型への分化を誘導する。分化後、細胞は蛍光レポーターを発現するHIV-1ウイルス様粒子に感染する。48時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析します。SAMHD1発現集団におけるHIV感染細胞の割合は、SAMHD1を欠く内部対照細胞におけるそれと比較される。この比較により、制限率が明らかになります。SAMHD1発現は、0.2の制限比に相当するHIV感染の5倍の減少をもたらす。最近、HIV感染のレポーター遺伝子として元のGFPをRFPに置き換えたことで、フローサイトメトリー解析が容易になりました。
このアッセイは、発現ベクターの部位特異的突然変異誘発に由来する、改変されたSAMHD1タンパク質をコードするウイルスで形質導入することにより、SAMHD1制限に対するアミノ酸置換の効果を特徴付けるために首尾よく使用されています。例えば、HD206−7AAの触媒部位置換は、1の制限表現型を示し、制限活性の喪失を示す。同様に、異なるテスターウイルスの感受性を決定することができます。アッセイは、分化状態、代謝状態、およびSAMHD1修飾因子の効果を組み込むようにさらに適合させて、SAMHD1、細胞代謝状態、およびウイルス制限との関係をよりよく理解することができる。
Introduction
滅菌αモチーフ/ヒスチジン-アスパラギン酸ドメイン含有タンパク質1(SAMHD1)は、骨髄系系統の静止細胞におけるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)の複製を妨げます。SAMHD1は、dNTPトリホスホヒドロラーゼとしての酵素活性を介して複製をブロックし、その結果、細胞内dNTPのレベルが低下します。その結果、HIV-1は逆転写のプロセスを効率的に実行できません。この最初の観察から数年で、特にSAMHD1の抗ウイルス活性に対する特定のドメインとアミノ酸の寄与に関して、多くの進歩が見られました。これらの洞察は、生化学的アッセイおよび生理学的に関連する静止骨髄性環境を模倣する細胞系を使用して行われました。U937細胞1 は、SAMHD1活性を解析するための簡便な骨髄系細胞系として広く用いられている。これは、内因性のSAMHD1発現の欠如によるものであり、SAMHD1発現細胞と比較してRNAレベルが低いためと考えられています(進行中の研究分野)。ここで、プロトコルは、HIV-1のSAMHD1制限のメカニズムを調べるために、SAMHD1と黄色蛍光タンパク質(YFP)レポーターを共発現するウイルス様粒子によるU937細胞の一時的な形質導入について説明します。レトロウイルスの制限を調べるためのこのような一過性2色フローサイトメトリーアッセイは、Stoye研究所2で最初に開発され、それ以来、 三者モチーフ(TRIM)タンパク質3を含む他の制限因子を調査するように適応されています。これらのアッセイに触発されて、BishopラボはU937細胞におけるSAMHD1制限を分析するための2色アッセイを開発しました。
実験のワークフローを 図 1 に示します。IRESから発現したYFPと並んでSAMHD1をコードするバイシストロンメッセージを含むマウス白血病ウイルス(MLV)様粒子は、U937細胞を形質導入するために使用されます。次に、細胞をホルボールミリスチン酸酢酸塩(PMA)で処理して、静止表現型への分化を誘導します。細胞は次に、赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するHIV-1ウイルス様粒子に感染する。48時間後、細胞を回収し、2色フローサイトメトリーで分析します。このアッセイは、YFPおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)でも使用されるため、フローサイトメトリー分析に必要な標準的なフィルターの組み合わせが少なくて済みます。HIV-RFPを使用すると、より簡単な補正が可能になり、経験の浅いフローサイトメトリーユーザーでもアッセイにアクセスしやすくなり、ほとんどのサイトメーターで達成できます。
分析中、HIV感染細胞の割合は、SAMHD1発現細胞とSAMHD1を欠く細胞との間で、同じ細胞ウェル内で比較されます。これにより、重要な機能であるウェル/フローサイトメトリーチューブの内部制御が可能になります。形質導入細胞と非形質導入細胞における感染レベルの比較は、制限率を明らかにする。1.0の比率は、形質導入因子が感染力に影響を及ぼさないことを示します。野生型SAMHD1発現は、このアッセイにおけるHIV感染の5倍の減少をもたらし、0.2の制限比に相当する。この効果は、TRIM5などのより古典的な制限因子と比較して控えめですが、それでも効果は再現性があり、修飾SAMHD1発現因子を野生型タンパク質と同等の方法で制限するもの、制限に失敗するもの、および中間表現型を持つものに分類することができます。
このアッセイは、変異SAMHD1配列をコードするウイルスで形質導入することにより、SAMHD1ドメインおよびアミノ酸変異体の制限表現型を特徴付けるために首尾よく使用されています。例えば、HD206-7AAの触媒部位置換は、このアッセイでは制限できない。同様に、異なるテスターウイルスの感受性を決定することができます。例えば、HIV-1逆転写酵素変異体は、SAMHD1媒介制限(例えば、151V4)に対してより感受性である。このプロトコルは、ウイルス様粒子(VLP)産生、SAMHD1発現ベクターによるU937の形質導入、蛍光レポーターを運ぶHIV感染、およびその後のフローサイトメトリーによる分析の詳細を概説しています。この記事では、予想されるデータと、最適ではない結果を回避する方法について説明します。最後に、SAMHD1、dNTPレベル、およびウイルス感染の間の相互作用をより徹底的に理解するために、さまざまなSAMHD1バリアントを調べることに加えて、アッセイの代替用途について概説します。細胞代謝の中心におけるSAMHD1の役割を考えると、癌との関連もあるため、これは引き続き非常に興味深い分野です。
Protocol
このプロトコルには、著者のいずれかが実施した動物または人間の参加者を対象とした研究は含まれていません。このプロトコルのすべてのステップは、それらが実行された機関のガイドラインと実践規範に従って実行されました。
1. VLP産生のための293T細胞のトランスフェクション(SAMHD1発現ベクターとテスターHIV粒子の両方)
注:ウイルス粒子の生産を成功させるための最も重要な要因は、生産者293T細胞の健康状態、トランスフェクション時のコンフルエンシー、および収穫時期です。ラボには通常、レトロウイルス粒子産生のための好ましいトランスフェクション試薬とプロトコルがあります。以下のプロトコルは良質の感染性粒子を生成しますが、同等のプロトコルもこのアプリケーションに適しています。良好な品質の293T細胞を維持するために、一定の増殖速度を維持するために少なくとも週に3回継代する。細胞は、効率的なトランスフェクションのために増殖の対数期に播種する必要があります。
- 1日目:293T細胞のほぼコンフルエントなディッシュから1/4分割して、必要な数の10 cmディッシュに播種し、翌日に約60%のコンフルエンシーを生成します(約5 x 105 セル/ mL)。新しい細胞ストックを扱う場合、翌日のトランスフェクションに適した密度を達成するために、いくつかの密度を播種する必要がある場合があります。
- 2日目(午前):顕微鏡検査で約60%のコンフルエントを確認し、細胞上の培地を10 mLの新鮮なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で穏やかに交換します。
- 2日目(午後、培地交換後少なくとも4時間):VLP制作のためのトランスフェクト。
- 600 μLの無血清DMEMに、 ギャグポル エクスプレッサープラスミド、長末端リピート(LTR)駆動レポータープラスミド、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質(VSV-G)発現プラスミド(合計9 μg、注を参照)をそれぞれ3 μg含むDNA希釈ミックスを構成します。渦と遠心分離機を短時間(15秒、>500 x g)。
- 20 μLのトランスフェクション試薬( 材料の表を参照)、ボルテックス(遠心分離しない)を加え、20°Cで15〜20分間インキュベートします。トランスフェクションミックスをプレートに滴下し、穏やかに旋回させて混合し、インキュベーターに戻します。
注:SAMHD1を発現するMLV VLPには、KB4 5,6(gag-polエクスプレッサープラスミド)、pLGatewaySAMHD1IeYFP1(LTR駆動レポータープラスミド)、およびpczVSV-G7を使用してください。HIV-RFP VLP には、p8.91 8,9 (gag-pol expressor プラスミド)、SCRPSY10 (LTR 駆動レポータープラスミド)、および pczVSV-G を使用してください。代替案については、材料の表で説明します。プラスミド比は、異なるプラスミド/トランスフェクションシステムに合わせて最適化する必要がある場合があります。
- 3日目(深夜):ピペッティングで細胞から培地を注意深く取り出し、5 mLの新鮮なDMEMで洗浄し、5 mLの新鮮なDMEMと交換します。
- 4日目(朝):細胞から上清を集めてウイルスを回収し、5mLの新鮮なDMEMと交換します。VLP含有上清を0.45 nmフィルターに通し、分注して-70°Cに移して保存します。アリコートが計画された実験に適したサイズ(提案として250 μL)であることを確認してください 凍結融解サイクルを繰り返すとウイルス力価が失われるため。
- 5日目(午前):1.5のようにウイルスを採取しますが、上清を採取した後はプレートを廃棄します。
2.使用前に新しいVLPを滴定する
- 1日目:24ウェルプレートの2 x 105 細胞/ウェルで293Tを播種-滴定するウイルス当たり4ウェル、各骨格に対する既知の感染力のウイルスを含む。特定の細胞ストックの播種密度を最適化します。
- 2日目:プレートを観察してコンフルエンシーを確認します(理想的には~70%)。手順1.5および1.6のウイルス含有上清を解凍します。各ウェルに0、10、25、または100 μLを加えます。
- 4日目(午前):フローサイトメトリーによる分析のために細胞を回収します。
- 注意深いピペッティングまたは吸引によってメディアを取り外します。250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗浄します。250 μL PBSで上下にピペッティングしてプレートから細胞を取り除き、マイクロ遠心チューブに移します。250 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます(最終濃度を2%にします)。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。塩素系消毒剤と混合しないでください。 - 500 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄して、細胞ペレットを200 μLのPBSまたは代替フローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。必要に応じて、フローサイトメトリーでRFPまたはYFPを分析します。特定のウイルス株の感染力を、既知の感染力の株の値に対して正規化します。
注:VLPは、p24酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によっても正規化できます。ただし、これは必ずしもVLP感染力の良い指標ではなく、特にVLPストックが異なるトランスフェクションで調製されている場合です。公表されている中央組織培養感染量または感染多重度(TCID50/MOI)法11 も相対定量を提供することができるが、これらはMLVについては十分に確立されていない。相対蛍光は、市販の逆転写酵素ELISA法に代わる費用対効果の高い代替手段を提供します。
- 注意深いピペッティングまたは吸引によってメディアを取り外します。250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗浄します。250 μL PBSで上下にピペッティングしてプレートから細胞を取り除き、マイクロ遠心チューブに移します。250 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます(最終濃度を2%にします)。
3. SAMHD1およびYFPを発現するVLPによるU937の形質導入
注:ステップ3〜6は、制限実験を構成します。計画を容易にするために日数が付けられています。
- 1日目(午後):MLV-野生型SAMHD1-YFP(陽性対照)、MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP(陰性対照)、変異型MLV-SAMHD1-YFP(実験サンプル)を含む形質導入のためにVLPを解凍します。マイクロフュージチューブ内のロズウェルパーク記念研究所1640培地(RPMI)で正規化VLPを最終容量500 μLに希釈し、0.5 μLのポリブレン(10 mg / mL)を加え、フリックして混合します。
- VLPを事前に滴定できない場合は、最初に100 μLを使用してください。VLPとRPMIの比率を最大1:1にして、VLP誘発毒性を制限します。約30%の形質導入を目指します。
- 5 x 105 U937細胞を、形質導入条件ごとに滅菌マイクロフュージチューブに分注します。ペレットを500 x g で5分間遠心分離することにより、上清を除去した(フローサイトメトリー用の形質導入されていない対照として2つの追加のチューブを含む)。細胞ペレットを500 μLの希釈VLP(または形質導入されていないコントロールの場合はRPMI)に再懸濁し、24ウェルプレートの1ウェルに移します。
- 卓上遠心分離機で800 x g 、20°Cで90分間スピンします。 1 mLの37°C RPMIをウェルに加え、37°Cのインキュベーターで3日間回収します。
4. 形質導入型U937の分化
- 4日目(午前):穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、350 μLを12ウェルプレートの4つのウェルのそれぞれに移します。150 nM PMAを含む37°C RPMIを700 μLずつ各ウェルに加え、最終濃度100 nMとし、3日間分化させます。
注:PMAは粉末として購入され、DMSOで1 mMに再懸濁し、暗所で保管する必要があります。100 μMの作業ストックは、1 mMストックから1/10をDMSOで希釈することによって調製する必要があります。
5.分化したSAMHD1発現U937のHIV-RFP感染
- 7日目:顕微鏡で細胞を観察します。細胞が接着していることを確認します。すべてのウェルから培地を吸引し、4つの各セットのウェル1に1 mLのRPMIを追加して、形質導入されていない、感染していないコントロールとシングルカラーコントロールを可能にします。約10 μLのHIV-1-RFP(ガイドとして約10 ng p24)を含む0.5 mLのRPMIを他のすべてのウェルに戻します。約50%の感染を目指します。
- 8日目(朝):感染した各ウェルに0.5 mLのRPMIを追加します。
6. フローサイトメトリー解析
注:フローサイトメトリーパイプラインに生死染色剤を含めることをお勧めします。ただし、U937細胞の品質が良好な場合は、ダウンストリーム分析に悪影響を与えることなく、このステップを省略できます。トリプシン処理された細胞の穏やかなピペッティングは、単一の細胞懸濁液を容易にするはずです。
- 10日目(午前):ウェルから培地を吸引し、PBSで1回洗浄します。300 μLの細胞解離酵素(またはトリプシン)を5〜10分間加えます。さらに300 μLのPBSを追加し、すべての細胞がプレートから外れたことを確認して完全に再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
- 300 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます(最終濃度を2%にします)。500 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄して、細胞ペレットを200 μLのPBSまたは代替フローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリーで分析します。
注:以下の手順はFortessa分析装置用ですが、RFPおよびYFP蛍光を読み取ることができる任意の分析装置を使用して同等の分析を実現できます。フローサイトメトリー分析を設定する前に、地域のフローサイトメトリーサポートまたは他の経験豊富な研究者に相談してください。同時に多くのサンプルをスクリーニングする必要がある場合は、ハイスループットサンプラーが適切な場合があります。この場合、より大きなセル数と体積が推奨されます。
7. フローサイトメトリー解析
- 必要になる10分前にサイトメーターの電源を入れ、コンピューターの電源を入れます。廃棄物が空であり、シースタンクがいっぱいであることを確認してください。
- マシンにログインし、解析ソフトウェアを開きます。
- アームを横に動かし、ウォーターチューブを外し、流量を 高 に設定して プライムを押します。ライトが消えるのを待って、さらに3回繰り返します。
- 水を戻し、3分間ハイで走らせてから、 ロー に切り替えて、取得に進むまで スタンバイ を押します。
- その間、ソフトウェア内で実験を設定します。
- [実験] / [新しい実験] を選択します (地域のガイダンスに従って名前が付けられます)。インスペクターで、不要な蛍光色素を削除し、青色レーザー530/30と黄色レーザー610/20、またはマシンのYFPとRFPに推奨されるレーザーとフィルターの組み合わせを残します。
- 実験を右クリックし、[サイトメーター設定]/[ アプリケーション設定]/[ワークシートの作成]を選択します。ワークシートで、対応するアイコンをクリックし、軸ラベルをクリックして軸を変更して、前方散乱面積(FSC-A)/側方散乱領域(FSC-A)ドットブロットとYFPヒストグラム、RFPヒストグラム、およびGFP / YFPドットブロットを作成します。
- 実験をもう一度右クリックして、新しい標本を追加します。必要に応じて名前を変更します。プラス記号をクリックして試験片を開き、新しいチューブを表示します。
- Viewから取得ダッシュボードを開き、感染していないトランスデュースされていないコントロールをロードして、[取得]を押します。ダッシュボードでFSC電圧とSSC電圧を調整して、セルを左下の象限に配置します(軸にセルはありません)。この人口P1の周りのゲート。他のプロットを右クリックし、P1を表示を選択して、後続の解析から破片を除去します。
- YFP用の単色コントロール(野生型SAMHD1のみ)をロードして取得します。ダッシュボードのYFP電圧を調整して、ほとんどの蛍光セルが検出器の範囲内(軸の端ではない)になるようにします。単色 RFP コントロールについても繰り返します。
- 変換されていない、感染していない、単色のコントロールを使用して自動補正を実行します。
- メニューから [補正設定>実験] > [補正コントロールの作成 ] を選択して、通常のワークシートに切り替えます。染色されていない通常のワークシートを選択し、 染色 されていないコントロールの実行と取得を押します。
- 無傷のセル(P1)の周りにゲートを描き、記録します。チューブを取り外し、マシンを スタンバイ状態にします。 P1を右クリックし、[ すべての報酬コントロールに適用]をクリックします。
- RFP 標準ワークシートに切り替えて、[ 実行] を押します。単色 RFP コントロールを記録し、マシンをスタンバイ状態にします 。 ソフトウェアは、陽性の母集団を自動的に選択する必要があります。
- YFPシングルカラーコントロールについても繰り返します。[ 補正設定>実験] > [補正の計算] > リンクして保存 を選択します。
- グローバル ワークシートに切り替えます。HIV-RFPに感染した野生型SAMHD1で形質導入された細胞を取得し、YFPとRFPでそれぞれ垂直方向と水平方向に整列した象限の隅に4つの異なる集団が見られることを確認します。チューブを取り外し、 スタンバイを押します。
- トランスデュースされていない、感染していないサンプルをリロードし、 実行 を押して、P1を停止ゲートとして30,000イベントを 記録 します。残りのサンプル(他のコントロールを含む)についても繰り返します。実行中または 事後サンプルの名前を変更します。一度エクスポートすると、ファイルの名前を変更することはできません。
- データを .fcs ファイルとしてエクスポートし、ローカルの指示に従って流路系をクリーニングします。
8.データ分析
注: 以下の手順は、FlowJo v10 での分析に対応しています。ただし、同等の手順は、他の分析ソフトウェアでも簡単に実行できます。
- ソフトウェアを開き、すべての.fcsファイルをダッシュボードにドラッグします。報酬コントロールを選択し、補正サブフォルダーにドラッグします。トランスデュースされていない、感染していないチューブのファイルをダブルクリックすると、FSC-A / SSC-Aプロットが表示されます。
- ポリゴン ツールを選択し、左下隅の破片を除く無傷のセル集団にゲートします。このセルに名前を付けます。このゲートを「 すべてのサンプル 」バーのチューブの母集団全体にドラッグします。水平矢印ボタンを使用して個々のサンプルをスクロールし、ゲーティングが各チューブに適していることを確認します。
- 形質導入されていない、感染していないサンプルの 細胞 集団をダブルクリックし、軸をFSC高さ(H)とFSC面積(A)に調整します。ダブレットを除外するには、長方形のゲートを使用して単一の大きな母集団を選択します。ソフトウェアは自動的にこの単一セルに名前を付けることを提案します。
- このゲートをすべての 細胞 集団にドラッグし、ゲーティングがすべてのサンプルに適していることを確認します。感染していない、形質導入されていないサンプルの 単一細胞 集団を選択し、軸を補正された青色レーザー(y 、YFP)と補償された黄色レーザー(x、 RFP)に変更します。軸上で T キーを押し、x と y の [双指数スケール ] を選択します。
- 象限ゲーティングツールを選択し、負の細胞集団の右上端をクリックします。この予備ゲーティングをすべての単一細胞集団に適用するには、すべてのサンプルバーにドラッグします。象限ゲートが母集団を十分に分離しない場合は、図 2 のように、ポリゴン ツールを使用して個々の象限をゲートする必要がある場合があります。
- 野生型SAMHD1のみのサンプル(YFPのみ)までスクロールし、非転写(YFP陰性)とYFP陽性の間のゲーティングが正しいことを確認します。輪郭図に切り替えて、陰性と薄暗いYFPセルを区別するのに役立つ場合があります。最上部のYFP + veセルが大きく広がっている場合は、垂直上部のゲートを右に調整します。
- すべてのサンプルをスクロールして、YFP陽性率に関するゲーティングを確認します。すべてのサンプルに有効なYFP陰性と正の間の最良の分割を使用します。
注:補償は、野生型SAMHD1 YFP発現レベルに基づいて計算されます。異なるSAMHD1-YFP形質導入細胞間で感染レベルが大きく異なる場合は、補償を調整する必要があるかもしれません。したがって、YFP VLPは使用前に正規化することが好ましい。 - 形質導入されていないHIV-RFP感染チューブまでスクロールし、感染していないRFP陰性と感染したRFP陽性の間のゲーティングが正しいかどうかを確認します。必要に応じて等高線ビューを使用して調整し、残りのサンプルをスクロールして、ゲーティングがすべてのサンプルに対して有効であることを確認します。
- 各サンプルには、ダブルネガティブ(Q4:左下、形質導入されていない、感染していない)、YFP陽性(Q1:左上、SAMHD1発現、感染していない)、RFP陽性(Q3:右下、形質導入されていない、HIV感染)、およびダブルポジティブ(Q2:右上、SAMHD1発現HIV感染)が必要です。アイコンをクリックしてテーブルエディタを開き、4つの象限ゲートをダッシュボードにドラッグします。 [Excelエクスポート ]を選択し、[ テーブルの作成]をクリックします。生成されたスプレッドシートをローカルファイルの命名規則に従って保存します。
- プロットとゲーティング戦略の表現をエクスポートするには、 レイアウトエディタ アイコンをクリックします。各母集団を選択し、必要な軸、ラベリング、間隔を指定してエディターにドラッグします。
- すべてのサンプルに対して同じプロットが表示されているレイアウトを作成するには、1つの列を選択して バッチを押します。[ 幅に合わせて拡大縮小 ]を押してから、 改ページを避けます。必要なファイル形式で保存します。
- エクスポートしたスプレッドシートで、YFP-ves のパーセンテージ RFP の列 (RFP+ve / (二重否定 + RFP+ve)) と YFP+ves のパーセント RFP (二重陽性 / (二重陽性 + YFP+ve)) の列を生成し、次に (YFP+ve の %RFP / YFP-ve の %RFP) の列を生成して、制限率を計算します ( 図 1 を参照)。各SAMHD1コンストラクトの複製データを平均し、適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、テストされたSAMHD1バリアントの制限値が野生型および/または206-7AAと有意に異なるかどうかを計算します。
Representative Results
上記の分析の結果、野生型SAMHD1陽性対照では0.25以下、陰性対照では1.0の制限比が得られるはずです。これら2つの品質管理チェックが有効である場合は、結果の統計的有意性を考慮してください。したがって、野生型との有意差を示さないSAMHD1変異体は、この文脈でのSAMHD1制限に影響を与えない置換を有する。野生型と有意に異なるものは、制限障害を示す。これらがネガティブコントロールと有意に異ならない場合、このコンテキストで制限する能力が欠けています(図4 の左側のパネル)。
野生型SAMHD1制限値が0.3より大きい場合、テスターウイルスの結果は指標となる可能性がありますが、信頼することはできません。野生型タンパク質による無効な制限は、再構成からの回復後早すぎる(2週間以内)、またはU937細胞が古すぎる(>2〜3か月)ときにU937細胞を使用することに起因する可能性があります。これらのパラメータは、所与の細胞ストックに対して経験的に決定する必要があるかもしれない。典型的には、継代が低いほど、細胞はより確実に分化し、したがってSAMHD1制限のための適切な環境を提供する。SAMHD1-YFPまたはHIV-RFPのいずれかによる不適切な感染レベルも、補償と制限率の下流の決定の両方を困難にする可能性があります。図 4 の右側のパネルに例を示します。
ネガティブコントロールが1.0から逸脱している場合(0.9〜1.2の範囲外)、これは、感染細胞の割合、ゲーティング戦略、または細胞の健康状態がアッセイに影響を与えている分析に問題があることを示している可能性があります。上記の注を参照してください。
図1:概略図のアウトラインプロトコル。 VLP、ウイルス様粒子、PMA、ホルボールミリスチン酸アセテート。番号付きのステージは、プロトコルのステージに対応します。BioRender.com を使用して作成された図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:レトロウイルスプラスミドの概略図 。 (A)パッケージングベクター (B)転写ベクター (C)VSV-Gエンベロープエクスプレッサー。主要なコーディングと規制要素が示されています。詳細については、 材料表を参照してください。CMV IE:サイトメガロウイルス即時早期プロモーター、BGH:ウシ成長ホルモン、pA:ポリA、RRE:Rev応答要素、CMV-LTR:複合CMV-HIV-1 LTRプロモーター、Psi:HIV-1パッケージングシグナル、cPPT / CTS:中央ポリプリン管/中央終結シーケンス、SV40:サル空胞化ウイルス40。BioRender.com を使用して作成された図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。 (A)補償コントロール:左パネルは、形質導入されていない、感染していないコントロールのインタクト細胞に対するFSC-A / SSC-Aゲーティングを示しています。中央と右のパネルには、YFP(中央)とRFP(右)の単色補正コントロールのスクリーンショットが表示され、補正されていないデータは黒、補正データは青で表示されます。(B)上記の報酬コントロールの対応する報酬マトリックスとプロット。(C)ゲーティング戦略。デブリは、FSC-A/SSC-A(左パネル)によるすべての細胞の分析によって除去されます。ダブレットは、FSCの高さと面積(中央パネル)のゲーティングによって除外されます。右パネルは、野生型SAMHD1によるHIV-1制限の例を示す。軸は、それぞれYFP(SAMHD1)およびRFP(HIV)陽性細胞に対応する補償された青色および黄色のレーザー蛍光を示す。象限ゲートは、RFPとYFPのネガティブコントロールと単色コントロールの比較によって描画されます。数字は親の人口の割合を示します。GFPを使用したYFPの補正値ははるかに高くなりますが、適切なフィルターセットを使用して識別することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:期待される結果:理想的なデータと次善のデータ。 (A)最適(左)データと次善(右)データの代表的なYFP/RFPプロット。数字は親の人口の割合を示します。右側のパネルでは、HIV感染が低すぎて、補償とゲーティングが困難になっています。制限率は0.5と予想以上に高い。(B)統計ソフトウェアを使用して生成された野生型(WT、赤)または陰性対照(HD206-7AA、黒)に対するSAMHD1の変異体の制限比のプロット。各ポイントはレプリケート値を表します。平均と標準偏差が表示されます。各群間の対応のあるt検定は、示されたすべての場合において有意であった。左:理想的なデータ-WTは約0.2の期待制限を示し、負の値は1.0を示します。バリアントR372D(灰色)はWTとは有意に異なりますが、陰性対照とは有意ではないため、制限する能力が失われています。右:次善のデータ。ここでは、陰性は期待どおりに動作しますが、感染率が低いため、6つの反復すべてでWTは0.5の制限比しか示していません。グループ内の分散が低いということは、R143HがWTと統計的に異なる中間表現型を示し、負であることを意味しますが、G209Sは制限しません。ただし、ポジティブコントロールは期待される制限比を与えていないため、これは新鮮な細胞で繰り返す必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
上記のノートで説明したように、プロトコルの重要な側面は、VLP産生のための正しい細胞表現型を保持し、SAMHD1制限を観察するための適切な環境を作成することを中心にしています。第一に、2色フローサイトメトリーによる制限の正確な分析は、プロットの各領域に分析のために十分な細胞が存在するように、形質導入細胞と感染細胞の適切な比率を達成することに依存しています。そのため、研究者は1未満のMOIを目指す必要があります( プロトコルを参照)。形質導入率と感染率が高すぎたり低すぎたりすると、感染していない細胞や二重に感染した細胞がないため、分析に問題が発生します。同様に、比較するSAMHD1ベクターの同様の形質導入速度は、同じ補償マトリックスとゲーティングを実験全体に適用できるようにするための鍵であり、その後の分析の信頼性を高めます。
第二に、使用されるU937細胞の年齢は、それらがうまく分化するかどうかの重要な要素です。鑑別の成功は、アドヒアランスの観察、分化後の経時的な培地の酸性化の減少、およびアッセイにおける野生型ポジティブコントロールによる適切な制限を通じて監視できます。最大5日間の鑑別が成功しています。
このアッセイの主な利点の1つは、その柔軟性です。SAMHD1の様々な改変バージョン(ドメイン、アミノ酸、種配列)は、ベクターの単純な部位特異的突然変異誘発またはクローニングを介して試験することができる。同様に、テスターウイルスの亜種を調べることができます。このアッセイは、dNTPに結合する能力が低下したHIV-1逆転写酵素変異体がSAMHD1制限に対してより敏感であることを実証するために以前に使用されてきました。同じ原理を使用して、SAMHD1による他のウイルスの制限をテストできます。さらに、細胞内dNTP濃度の分化条件の変化または人為的な操作を使用して、細胞内条件とSAMHD1活性との間の相互作用をさらに調査することができ、これはビショップ研究室で活発な研究分野です。SAMHD1と様々なヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との相互作用も記載されており、初代細胞で使用するために改変されたこのアッセイを用いて示されたSAMHD1の効果12、13、14、15。
初代細胞で使用するためのプロトコルの適応は、形質転換細胞における代謝表現型を調べることによってもたらされる制限を克服する。ただし、既存のフォーマットでは、特にハイスループットサンプラーを備えたフローサイトメーターを使用する場合、ハイスループット分析のための便利で技術的に難しいプロトコルが可能になります。プロトコルを適応させる際には、内部で形質導入されていない細胞のバイスタンダー効果(例えば、免疫シグナル伝達)に対する感受性を考慮する必要があります。
細胞生物学の多くの側面と同様に、そのようなアッセイは、所与の現象を理解するための全体論的アプローチの一部として使用されることが不可欠です。SAMHD1活性16の生化学的アッセイの並行使用、細胞内dNTPプールの定量、およびヒト、 ex vivo 、および動物モデル(世界中のラボで実施されており、この号に記載されているものもあります)におけるSAMHD1変異表現型の観察は、この複雑なタンパク質の進化する理解の鍵です。
Disclosures
オープンアクセスの目的のために、著者は、この提出から生じる著者受理原稿バージョンにCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しました。表明された見解は著者のものであり、必ずしもNIHRまたは保健社会福祉省の見解ではありません。
Acknowledgments
この研究は、Cancer Research UK(FC001042およびFC001162)、UK Medical Research Council(FC001042およびFC001162)、Wellcome Trust(FC001042およびFC001162)からコア資金を受けているFrancis Crick Institute、およびJPSのWellcome Trust Investigator Award(108012/Z/15/Z)の支援を受けた。ケンブリッジ大学での研究は、NIHRケンブリッジ生物医学研究センター、エブリントラスト(16/21)、ローズツリートラスト(M590)、および英国医学研究評議会(MR / S009752 / 1)によって共同資金提供されました。後者の英国資金による賞は、欧州連合が支援するEDCTP2プログラムの一部です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
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