Summary
Här beskrivs en etablerad metod för att bestämma omfattningen av HIV-1-begränsning av det cellulära hämmande proteinet SAMHD1. Mänskliga myeloida U937-celler transduceras med en SAMHD1-uttrycksvektor som uttrycker YFP, differentieras och utmanas sedan med HIV-RFP. Restriktionsnivån bestäms genom flödescytometrianalys.
Abstract
Sterilt α-motiv/histidin-aspartat-domäninnehållande protein 1 (SAMHD1) hämmar replikation av HIV-1 i vilande myeloida celler. U937-celler används ofta som ett bekvämt cellsystem för att analysera SAMHD1-aktivitet på grund av en låg nivå av SAMHD1-RNA-uttryck, vilket leder till omätbart endogent proteinuttryck. Baserat på liknande analyser som utvecklats i Stoye-laboratoriet för att karakterisera andra retrovirala begränsningsfaktorer, utvecklade Bishop-laboratoriet en tvåfärgsbegränsningsanalys för att analysera SAMHD1 i U937-celler. Murin leukemi Virusliknande partiklar som uttrycker SAMHD1, tillsammans med YFP uttryckt från en IRES, används för att transducera U937-celler. Celler behandlas sedan med phorbol myristate acetat för att inducera differentiering till en vilande fenotyp. Efter differentiering infekteras celler med HIV-1-virusliknande partiklar som uttrycker en fluorescerande reporter. Efter 48 h skördas celler och analyseras med flödescytometri. Andelen HIV-infekterade celler i den SAMHD1-uttryckande populationen jämförs med den i interna kontrollceller som saknar SAMHD1. Denna jämförelse visar ett begränsningsförhållande. SAMHD1-uttryck leder till en femfaldig minskning av HIV-infektion, vilket motsvarar ett restriktionsförhållande på 0,2. Vår senaste ersättning av RFP för den ursprungliga GFP som reportergen för HIV-infektion har underlättat flödescytometrianalys.
Denna analys har framgångsrikt använts för att karakterisera effekten av aminosyrasubstitutioner på SAMHD1-begränsning genom att transducera med virus som kodar för förändrade SAMHD1-proteiner, härledda från platsstyrd mutagenes av uttrycksvektorn. Till exempel visar de katalytiska platssubstitutionerna HD206-7AA en restriktionsfenotyp av 1, vilket indikerar en förlust av restriktionsaktivitet. På samma sätt kan mottagligheten hos olika testvirus bestämmas. Analysen kan anpassas ytterligare för att införliva effekten av differentieringsstatus, metabolisk status och SAMHD1-modifierare för att bättre förstå förhållandet mellan SAMHD1, cellmetaboliskt tillstånd och viral begränsning.
Introduction
Sterilt α-motiv/histidin-aspartat-domäninnehållande protein 1 (SAMHD1) hindrar replikation av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) i vilande celler i myeloida härstamning. SAMHD1 blockerar replikation genom sin enzymatiska aktivitet som en dNTP-trifosfohydrolas, vilket resulterar i minskade nivåer av intracellulära dNTP. Som ett resultat kan HIV-1 inte utföra processen med omvänd transkription effektivt. Stora framsteg har gjorts under de få år som gått sedan denna första observation, särskilt när det gäller bidraget från specifika domäner och aminosyror till SAMHD1:s antivirala aktivitet. Dessa insikter har gjorts med hjälp av biokemiska analyser samt cellsystem som efterliknar den fysiologiskt relevanta vilande myeloida miljön. U937-celler1 används ofta som ett bekvämt myeloiskt cellsystem för analys av SAMHD1-aktivitet. Detta beror på brist på endogent SAMHD1-uttryck, som tros bero på låga RNA-nivåer jämfört med SAMHD1-uttryckande celler (ett område med pågående forskning). Här beskriver protokollet den övergående transduktionen av U937-celler med virusliknande partiklar som samuttrycker SAMHD1 och en gul fluorescerande protein (YFP) reporter för att undersöka mekanismen för SAMHD1-begränsning av HIV-1. Sådana övergående tvåfärgade flödescytometrianalyser för att undersöka retrovirala begränsningar utvecklades först i Stoye-laboratoriet2 och har sedan dess anpassats för att undersöka andra restriktionsfaktorer, inklusive trepartsmotiv (TRIM) proteiner3. Inspirerad av dessa analyser utvecklade Bishop-labbet en tvåfärgsanalys för att analysera SAMHD1-begränsning i U937-celler.
Arbetsflödet för experimentet visas i bild 1. Murine Leukaemia Virus (MLV)-liknande partiklar som innehåller ett bi-cistroniskt meddelande som kodar för SAMHD1 tillsammans med YFP uttryckt från en IRES används för att transducera U937-celler. Celler behandlas sedan med phorbol myristate acetat (PMA) för att inducera differentiering till en vilande fenotyp. Celler infekteras därefter med HIV-1-virusliknande partiklar som uttrycker rött fluorescerande protein (RFP). Efter 48 h skördas cellerna och analyseras med tvåfärgad flödescytometri. Denna analys används också med YFP och grönt fluorescerande protein (GFP), vilket kräver mindre standardfilterkombinationer för flödescytometrianalys. Användning av HIV-RFP möjliggör enklare kompensation och därmed är analysen mer lättillgänglig för mindre erfarna flödescytometrianvändare och kan uppnås med de flesta cytometrar.
Under analysen jämförs andelen HIV-infekterade celler mellan SAMHD1-uttryckande celler och de som saknar SAMHD1 i samma cellbrunn. Detta ger en intern kontroll i brunns-/flödescytometrirör, vilket är en nyckelfunktion. Jämförelsen av infektionsnivåer i transducerade och otransducerade celler avslöjar ett begränsningsförhållande. Ett förhållande på 1,0 indikerar att den transducerade faktorn inte har någon effekt på smittsamheten. Vild typ SAMHD1-uttryck leder till en femfaldig minskning av HIV-infektion i denna analys, vilket motsvarar ett restriktionsförhållande på 0,2. Även om denna effekt är blygsam i jämförelse med mer klassiska restriktionsfaktorer som TRIM5, är effekten ändå reproducerbar och gör det möjligt att klassificera modifierade SAMHD1-expressorer i de som på ett likvärdigt sätt begränsar till proteinet av vildtyp, de som inte begränsar och de med en mellanliggande fenotyp.
Denna analys har använts framgångsrikt för att karakterisera SAMHD1-domän- och aminosyramutanters restriktionsfenotyper genom att transducera med virus som kodar för mutanta SAMHD1-sekvenser. Till exempel kan de katalytiska platssubstitutionerna HD206-7AA inte begränsas i denna analys. På samma sätt kan mottagligheten hos olika testvirus bestämmas. Till exempel är HIV-1 omvända transkriptasmutanter mer mottagliga för SAMHD1-medierad begränsning (t.ex. 151V4). Detta protokoll beskriver detaljerna i virusliknande partikel (VLP) produktion, transduktion av U937 med SAMHD1-uttrycksvektorer, infektion med HIV som bär en fluorescerande reporter och den efterföljande analysen med flödescytometri. I den här artikeln beskrivs vilka data du kan förvänta dig och hur du undviker suboptimala resultat. Slutligen beskrivs alternativa användningsområden för analysen, förutom att undersöka olika SAMHD1-varianter för att förstå samspelet mellan SAMHD1, dNTP-nivåer och virusinfektion mer noggrant. Med tanke på SAMHD1: s roll i centrum för cellmetabolismen, med ytterligare kopplingar till cancer, fortsätter detta att vara ett område av intensivt intresse.
Protocol
Detta protokoll innehåller inga studier med djur eller mänskliga deltagare utförda av någon av författarna. Alla steg i detta protokoll utfördes enligt riktlinjerna och uppförandekoderna för de institutioner där de genomfördes.
1. Transfektion av 293T-celler för VLP-produktion (både SAMHD1-uttrycksvektorer och test-HIV-partiklar)
OBS: De viktigaste bidragsgivarna till framgångsrik produktion av viruspartiklar är hälsan hos producentens 293T-celler, sammanflöde vid transfektion och skördetid. Laboratorier har vanligtvis sina föredragna transfektreagenser och protokoll för retroviral partikelproduktion. Följande protokoll ger smittsamma partiklar av god kvalitet, men motsvarande protokoll skulle också vara lämpliga för denna applikation. För att upprätthålla 293T-celler av god kvalitet, passera minst tre gånger per vecka för att upprätthålla en konstant tillväxttakt. Celler bör fröas i loggfasen av tillväxt för effektiv transfektion.
- Dag 1: Frö det önskade antalet 10 cm skålar med en 1/4 split från en nästan sammanflytande skål med 293T-celler för att ge cirka 60% sammanflöde följande dag (cirka 5 x 105 celler / ml). Flera densiteter kan behöva sås för att uppnå en lämplig densitet för transfektion följande dag när man arbetar med ett nytt cellbestånd.
- Dag 2 (morgon): Kontrollera om det finns cirka 60% sammanflöde genom mikroskopi och byt försiktigt ut media på celler med 10 ml färskt Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM).
- Dag 2 (eftermiddag, minst 4 timmar efter mediebyte): Transfekt för VLP-produktion.
- Fyll på DNA-utspädningsblandningen innehållande 3 μg vardera av gag-pol-expressorplasmid, långterminal upprepning (LTR)-driven reporterplasmid och vesikulär stomatitvirus G-protein ( VSV-G ) expressorplasmid (totalt 9 μg, se OBS) i 600 μl serumfri DMEM. Vortex och centrifug kort (15 s, >500 x g).
- Tillsätt 20 μl transfektreagens (se materialförteckning), virvel (centrifugera inte) och inkubera vid 20 °C i 15–20 minuter. Tillsätt transfektionsblandningen droppvis till plattan, virvla försiktigt för att blanda och återgå till inkubatorn.
OBS: För MLV VLP som uttrycker SAMHD1 använd KB4 5,6 (gag-pol expressorplasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-driven reporterplasmid) och pczVSV-G7. För HIV-RFP VLP, använd p8.91 8,9 (gag-pol expressorplasmid), SCRPSY10 (LTR-driven reporterplasmid) och pczVSV-G. Alternativ diskuteras i materialförteckningen. Plasmidförhållanden kan behöva optimeras för olika plasmid/transfektionssystem.
- Dag 3 (sen morgon): Ta försiktigt bort mediet från cellerna genom pipettering, tvätta med 5 ml färsk DMEM och ersätt med 5 ml färsk DMEM.
- Dag 4 (morgon): Skörda viruset genom att samla supernatanten från cellerna och ersätt med 5 ml färsk DMEM. För den VLP-innehållande supernatanten genom ett 0,45 nm-filter, alikvotera och överför till -70 °C för lagring. Se till att alikvoterna är av en storlek som är lämplig för planerade experiment (250 μl som förslag) eftersom upprepade frys-upptiningscykler kommer att resultera i förlust av viral titer.
- Dag 5 (morgon): Skörda viruset som i 1,5 men kassera plattorna efter att ha samlat supernatanten.
2. Titulering av ny VLP före användning
- Dag 1: Frö 293T vid 2 x 105 celler per brunn i en 24-brunnsplatta - 4 brunnar per virus som ska titreras, inklusive ett virus med känd smittsamhet för varje ryggrad. Optimera sådddensiteten för ett givet cellbestånd.
- Dag 2: Observera plattan för att kontrollera sammanflödet (helst ~ 70%). Tina den virusinnehållande supernatanten från steg 1.5 och 1.6. Tillsätt 0, 10, 25 eller 100 μL till varje brunn.
- Dag 4 (morgon): Skörda cellerna för analys med flödescytometri.
- Ta bort media genom noggrann pipettering eller aspiration. Tvätta cellerna försiktigt med 250 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort cellerna från plattan genom att pipettera upp och ner med 250 μL PBS och överför till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 250 μl 4% paraformaldehyd (med slutlig koncentration till 2%).
VARNING: Paraformaldehyd är giftigt. Det ska inte blandas med klorbaserade desinfektionsmedel. - Pellera cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 μl PBS eller alternativ flödescytometribuffert. Analysera för RFP eller YFP efter behov med flödescytometri. Normalisera smittsamheten hos ett givet virusbestånd mot värden för ett bestånd med känd smittsamhet.
OBS: VLP kan också normaliseras genom p24-enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA); Detta är dock inte nödvändigtvis en bra indikator på VLP-smittsamhet, särskilt när VLP-lager bereds i olika transfektyrer. Publicerade medianmetoder för vävnadsodling infektiös dos eller multiplicitet av infektion (TCID50/MOI)11 kan också ge relativ kvantifiering, även om dessa inte är väl etablerade för MLV. Relativ fluorescens ger ett kostnadseffektivt alternativ till kommersiella ELISA-metoder med omvänd transkriptas.
- Ta bort media genom noggrann pipettering eller aspiration. Tvätta cellerna försiktigt med 250 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort cellerna från plattan genom att pipettera upp och ner med 250 μL PBS och överför till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 250 μl 4% paraformaldehyd (med slutlig koncentration till 2%).
3. Transduktion av U937 med VLP som uttrycker SAMHD1 och YFP
OBS: Steg 3-6 utgör begränsningsexperimentet. Dagarna är räknade för att underlätta planeringen.
- Dag 1 (eftermiddag): Tina VLP för transduktion inklusive MLV-Wild-typ SAMHD1-YFP (positiv kontroll), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA) -YFP (negativ kontroll) och variant MLV-SAMHD1-YFP (experimentella prover). Späd den normaliserade VLP till en slutlig volym på 500 μL med Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) i ett mikrofugerör, tillsätt 0,5 μL polybrene (10 mg / ml) och blanda genom att snärta.
- Om VLP inte kan titreras i förväg, använd först 100 μL. Använd maximalt 1:1-förhållande mellan VLP och RPMI för att begränsa VLP-inducerad toxicitet. Sikta på cirka 30% transduktion.
- Alikvotera 5 x 105 U937-celler i ett sterilt mikrofugerör för varje transduktionstillstånd. Pellet genom centrifugering vid 500 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten (inkludera ytterligare två rör som otransducerade kontroller för flödescytometri). Återsuspendera cellpelleten i 500 μl utspädd VLP (eller RPMI för otransducerade kontroller) och överför till en brunn på en 24-brunnsplatta.
- Spinokulera i en bordscentrifug vid 800 x g i 90 minuter vid 20 °C. Tillsätt 1 ml 37 °C RPMI till brunnen och låt återhämta sig i en 37 °C inkubator i 3 dagar.
4. Differentiering av transducerad U937
- Dag 4 (morgon): Suspendera cellerna igen genom att försiktigt pipettera och överföra 350 μL till var och en av 4 brunnar i en 12-brunnsplatta. Tillsätt 700 μl 37 °C RPMI innehållande 150 nM PMA till varje brunn, vilket ger en slutlig koncentration på 100 nM och låt differentiera i 3 dagar.
OBS: PMA köps som ett pulver och ska återsuspenderas till 1 mM i DMSO och förvaras i mörker. Ett arbetslager på 100 μM bör beredas genom att späda ut 1/10 från 1 mM-beståndet med DMSO.
5. Infektion av differentierad, SAMHD1-uttryckande U937 med HIV-RFP
- Dag 7: Observera cellerna med mikroskopi. Se till att cellerna är vidhäftande. Aspirera media från alla brunnar, lägg till 1 ml RPMI till brunn 1 av varje uppsättning av 4 vilket möjliggör otransducerad, oinfekterad kontroll samt enfärgskontroller. Lägg tillbaka 0,5 ml RPMI som innehåller ungefär 10 μL HIV-1-RFP (cirka 10 ng p24 som vägledning) till alla andra brunnar. Sikta på cirka 50% infektion.
- Dag 8 (morgon): Lägg till 0,5 ml RPMI till var och en av de infekterade brunnarna.
6. Analys av flödescytometri
OBS: Det är bra att inkludera en levande död fläck i flödescytometrirörledningar. Men om U937-cellerna är av god kvalitet kan detta steg utelämnas utan negativa konsekvenser för nedströmsanalys. Skonsam pipettering av trypsiniserade celler bör lätt resultera i en enda cellsuspension.
- Dag 10 (morgon): Aspirera media från brunnarna och tvätta en gång med PBS. Tillsätt 300 μl celldissociationsenzym (eller trypsin) i 5-10 min. Tillsätt ytterligare 300 μL PBS, återsuspendera noggrant och se till att alla celler har lossnat från plattan och överför till flödescytometrirör.
- Tillsätt 300 μl 4% paraformaldehyd (med slutlig koncentration till 2%). Pellera cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 μl PBS eller alternativ flödescytometribuffert. Analysera med flödescytometri.
OBS: Stegen nedan är för en Fortessa-analysator, men motsvarande analys kan uppnås med vilken analysator som helst som kan läsa RFP- och YFP-fluorescens. Konsultera stöd för lokal flödescytometri eller annan erfaren forskare innan du ställer in någon flödescytometrianalys. När många prover behöver screenas samtidigt kan en provtagare med hög dataflöde vara lämplig. I detta fall rekommenderas ett större cellnummer och volym.
7. Analys av flödescytometri
- Slå på cytometern 10 min innan den behövs och slå på datorn. Kontrollera att avfallet är tomt och att manteltanken är full.
- Logga in på maskinen och öppna analysprogramvaran.
- Flytta armen åt sidan, ta av vattenröret, ställ in flödeshastigheten på Hög och tryck på Prime. Vänta tills ljuset slocknar och upprepa tre gånger till.
- Sätt på vattnet igen och kör på högt i 3 minuter och byt sedan till Låg och tryck på Standby tills du fortsätter till förvärv.
- Under tiden ställa in experimentet i programvaran:
- Välj Experiment/ Nytt experiment (namn enligt lokal vägledning). Ta bort de fluorokromer som inte krävs i inspektören och lämna Blue Laser 530/30 och Yellow Laser 610/20 eller de rekommenderade laser- och filterkombinationerna för YFP och RFP för maskinen.
- Högerklicka på experimentet och välj Cytometerinställningar / Programinställningar / Skapa kalkylblad. I kalkylbladet skapar du en FSC-A-punktsarea (Forward Scatter-Area)/Side Scatter Area (FSC-A) punktfläck och YFP-histogram, RFP-histogram och GFP/YFP-punktfläck genom att klicka på motsvarande ikon och ändra axlarna genom att klicka på axeletiketten.
- Högerklicka igen på Experiment och lägg till nytt exemplar. Byt namn efter behov. Öppna provet genom att klicka på plustecknet för att avslöja ett nytt rör.
- Öppna instrumentpanelen för förvärv från Visa, läs in den oinfekterade, otransducerade kontrollen och tryck på Hämta. Justera FSC- och SSC-spänningar i instrumentpanelen för att placera celler i den nedre vänstra kvadranten (inga celler på axlarna). Porten runt denna befolkning P1. Högerklicka på andra tomter och välj visa P1 för att ta bort skräp från efterföljande analys.
- Läs in enfärgskontrollen för YFP (endast samhd1 av vild typ) och hämta. Justera YFP-spänningen i instrumentbrädan så att de mest fluorescerande cellerna ligger inom detektorns område (inte på kanten av axeln). Upprepa för enfärgad RFP-kontroll.
- Kör automatisk kompensation med hjälp av de otransducerade, oinfekterade och enfärgade kontrollerna.
- Välj Experiment > kompensationsinställningar > Skapa kompensationskontroller på menyn för att växla till ett normalt kalkylblad. Välj ofärgat normalt kalkylblad, tryck på Kör och skaffa för den ofärgade kontrollen.
- Rita en grind runt de intakta cellerna (P1) och spela in. Ta bort röret och sätt maskinen i vänteläge. Högerklicka på P1, klicka på Apply to All Compensation Controls.
- Växla till det vanliga kalkylbladet RFP och tryck på Kör. Spela in RFP-kontrollen med en färg och sätt maskinen i vänteläge. Programvaran ska automatiskt välja den positiva populationen.
- Upprepa för YFP-enfärgskontroll. Välj Experiment > kompensationsinställningar > Beräkna kompensation > länka och spara.
- Växla till det globala kalkylbladet. Skaffa cellerna transducerade med vild typ SAMHD1, infekterade med HIV-RFP och kontrollera att fyra distinkta populationer kan ses i hörnen av kvadranterna som är inriktade vertikalt och horisontellt för YFP respektive RFP. Ta bort röret och tryck på Standby.
- Ladda om det otransducerade, oinfekterade provet, tryck på Kör och spela in 30 000 händelser med P1 som stoppgrind. Upprepa för de återstående proverna (inklusive andra kontroller). Byt namn på exemplen medan du kör eller post hoc. När filerna har exporterats kan de inte byta namn.
- Exportera data som .fcs-filer och rengör fluidiken enligt lokala instruktioner.
8. Dataanalys
OBS: Stegen som följer motsvarar analys i FlowJo v10; Motsvarande steg kan dock enkelt utföras i annan analysprogramvara.
- Öppna programvaran och dra alla .fcs-filer till instrumentpanelen. Välj kompensationskontrollerna och dra dem till undermappen kompensation. Öppna filen för det otransducerade, oinfekterade röret genom att dubbelklicka, vilket kommer att visa FSC-A / SSC-A-diagrammet.
- Välj polygonverktyget och grinden på den intakta cellpopulationen, exklusive skräp i det nedre vänstra hörnet. Namnge dessa celler. Dra den här grinden till hela populationen av rör i fältet Alla prover . Bläddra igenom varje enskilt prov med hjälp av de horisontella pilknapparna för att säkerställa att grinden är lämplig för varje rör.
- Dubbelklicka på cellpopulationen för det otransducerade, oinfekterade provet och justera axlarna till FSC-höjd (H) vs FSC-område (A). Välj den enda stora populationen med en rektangulär grind för att utesluta dubbletter. Programvaran föreslår automatiskt att du namnger dessa enskilda celler.
- Dra den här grinden till alla cellpopulationer och kontrollera igen att grinden är lämplig för alla prover. Välj populationen Single Cells för det oinfekterade, otransducerade provet, ändra axlarna till kompenserad blå laser (y , YFP) kontra kompenserad gul laser (x, RFP). Tryck på T på axeln och välj Biexponentiell skala för x och y.
- Välj kvadrantens gatingverktyg och klicka längst upp till höger i den negativa cellpopulationen. Tillämpa den här preliminära gating på alla Single Cell-populationer genom att dra till fältet Alla exempel. Om kvadrantgrindarna inte separerar populationerna på ett tillfredsställande sätt kan det vara nödvändigt att grinda enskilda kvadranter med hjälp av polygonverktyget, som i figur 2.
- Bläddra till samhd1-exemplet av vildtyp (endast YFP) och kontrollera att grinden mellan det otranducerade (YFP-negativa) och YFP-positiva är korrekta. Det kan hjälpa att byta till konturvy för att skilja negativa från svaga YFP-celler. Om de översta YFP +ve-cellerna är brett spridda, justera den övre vertikala porten till höger.
- Bläddra igenom alla prover och kontrollera grinden med avseende på YFP-positivitet. Använd den bästa uppdelningen mellan YFP-negativ och positiv som gäller för alla prover.
OBS: Kompensationen kommer att ha beräknats baserat på SAMHD1 YFP-uttrycksnivån av vild typ. Om infektionsnivåerna är mycket olika mellan olika SAMHD1-YFP-transducerade celler kan kompensationen behöva justeras. Det är därför att föredra att YFP VLP normaliseras före användning. - Bläddra till det otransducerade, HIV-RFP-infekterade röret och kontrollera om grinden mellan oinfekterad RFP-negativ och infekterad RFP-positiv är korrekt. Justera efter behov, använd konturvyn om det behövs och bläddra igenom de återstående proverna för att kontrollera att grinden är giltig för alla prover.
- Varje prov kräver dubbla negativ (Q4: nedre vänstra, otransducerad, oinfekterad), YFP-positiv (Q1: övre vänstra, SAMHD1-uttryckande, oinfekterad), RFP-positiv (Q3: nedre högra, otransducerad, HIV-infekterad) och dubbel positiv (Q2: uppe till höger, SAMHD1 uttrycker HIV-infekterad). Öppna tabellredigeraren genom att klicka på ikonen och dra de fyra kvadrantportarna till instrumentpanelen. Välj Excel-export och klicka på Skapa tabell. Spara det genererade kalkylbladet enligt lokala namngivningskonventioner för filer.
- För att exportera representationer av tomter och grindstrategier, klicka på ikonen Layout Editor . Markera varje population och dra in i redigeraren med de axlar, etiketter och avstånd som krävs.
- Om du vill skapa en layout med samma diagram som visas för alla exempel markerar du en kolumn och trycker på Batch. Tryck på Skala till bredd och undvik sedan sidbrytningar. Spara i det filformat som krävs.
- I det exporterade kalkylbladet beräknar du begränsningsförhållandet genom att generera kolumner med procentuell RFP för YFP-ves (RFP + ve / (dubbla negativ + RFP + ve)) och procentandel RFP för YFP + ves (dubbla positiva / (dubbla positiva + YFP + ve)) och sedan en sista kolumn med (% RFP för YFP + ve / % RFP för YFP-ve), se figur 1. Beräkna medelvärdet av replikatdata för varje SAMHD1-konstruktion och beräkna om restriktionsvärdena för testade SAMHD1-varianter skiljer sig avsevärt från vildtyp och/eller 206-7AA med hjälp av lämplig dataanalysprogramvara.
Representative Results
Resultaten av analysen ovan bör ge ett restriktionsförhållande på 0,25 eller lägre för den positiva kontrollen av vildtyp SAMHD1 och 1,0 för den negativa kontrollen. Om dessa två kvalitetskontrollkontroller är giltiga, överväga den statistiska signifikansen av resultaten. SAMHD1-varianter som inte visar någon signifikant skillnad från vild typ har därför substitutioner som inte påverkar SAMHD1-begränsningen i detta sammanhang. De som skiljer sig avsevärt från vild typ visar nedsatt begränsning. Om dessa inte skiljer sig signifikant från den negativa kontrollen, saknar de förmågan att begränsa i detta sammanhang (figur 4 vänstra paneler).
Om SAMHD1-begränsningsvärdet av vildtyp är större än 0,3 kan resultaten för testvirus vara vägledande men kan inte åberopas. Ineffektiv begränsning av protein av vildtyp kan bero på att U937-celler används för tidigt efter återhämtning från beredning (inom 2 veckor), eller när de är för gamla (>2-3 månader). Dessa parametrar kan behöva bestämmas empiriskt för ett givet cellbestånd. Vanligtvis, ju lägre passage, desto mer tillförlitligt skiljer cellerna och ger därför lämplig miljö för SAMHD1-begränsning. Olämplig infektionsnivå med antingen SAMHD1-YFP eller HIV-RFP kan också leda till svårigheter med både kompensation och nedströms bestämning av restriktionsförhållandet. Ett exempel illustreras i de högra panelerna i figur 4.
Om den negativa kontrollen avviker från 1,0 (utanför intervallet 0,9-1,2) kan detta indikera ett problem med analysen, antingen andelen infekterade celler, grindstrategi eller cellernas hälsa påverkar analysen. Se ANMÄRKNINGAR ovan.
Bild 1: Schematiskt beskrivningsprotokoll. VLP, virusliknande partiklar, PMA, phorbol myristate acetat. Numrerade steg motsvarar steg i protokollet. Figur producerad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk över retrovirala plasmider . (A) Förpackningsvektorer (B) Överföringsvektorer (C) VSV-G-kuvertexpressor. Viktiga kodnings- och regleringselement visas. Mer information finns i materialförteckningen. CMV IE: cytomegalovirus omedelbar-tidig promotor, BGH: bovint tillväxthormon, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: komposit CMV-HIV-1 LTR promotor, Psi: HIV-1 förpackningssignal, cPPT / CTS: central polypurinkanal / central avslutningssekvens, SV40: simian vakuolerande virus 40. Figur producerad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gating-strategi för flödescytometrianalys. (A) Kompensationskontroller: vänster panel visar FSC-A / SSC-A-grind på in-taktceller för den otransducerade, oinfekterade kontrollen. Centrala och högra paneler visar skärmdumpar av enfärgade kompensationskontroller för YFP (mitten) och RFP (höger) med okompenserade data i svart och kompenserade i blått. (B) Motsvarande kompensationsmatris och diagram för kompensationskontroller ovan. (C) Gating strategi. Skräp elimineras genom analys av alla celler av FSC-A/SSC-A (vänster panel). Dubbletter utesluts genom att grinda på FSC-höjd kontra yta (centralpanel). Höger panel visar ett exempel på HIV-1-begränsning av vildtyp SAMHD1. Axlar visar kompenserad blå och gul laserfluorescens motsvarande YFP (SAMHD1) respektive RFP (HIV)-positiva celler. Kvadrantgrindar ritas genom jämförelse av negativa och enfärgade kontroller för RFP och YFP. Siffror anger procentandel av föräldrapopulationen. Kompensationsvärdena för YFP med GFP kommer att vara mycket högre men möjliga att diskriminera med hjälp av lämpliga filteruppsättningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Förväntade resultat: idealiska kontra suboptimala data. (A) Representativa YFP/RFP-diagram för optimala (vänster) och suboptimala (höger) data. Siffror anger procentandel av föräldrapopulationen. I den högra panelen är HIV-infektion för låg vilket skapar svårigheter med kompensation och gating. Restriktionskvoten är högre än väntat vid 0,5. (B) Diagram över restriktionskvoter för varianter av SAMHD1 med avseende på vild typ (WT, röd) eller negativ kontroll (HD206-7AA, svart) som genereras med hjälp av statistisk programvara. Varje punkt representerar ett replikeringsvärde. Medelvärde och standardavvikelse visas. Parade t-tester mellan varje grupp var signifikanta i alla fall förvänta sig där de visades. Vänster: Ideala data - WT visar den förväntade begränsningen på cirka 0,2, negativ visar 1,0. Varianten R372D (grå) skiljer sig signifikant från WT men är inte signifikant från den negativa kontrollen och har därmed förlorat förmågan att begränsa. Höger: Suboptimala data. Här beter sig det negativa som förväntat men i alla sex replikat visar WT bara ett restriktionsförhållande på 0,5 på grund av låg infektionshastighet. Den låga variansen inom grupperna innebär att R143H visar en mellanliggande fenotyp som statistiskt skiljer sig från WT och den negativa, medan G209S inte begränsar; Detta bör dock upprepas med färska celler eftersom den positiva kontrollen inte har gett det förväntade restriktionsförhållandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Som diskuterats i anteckningarna ovan handlar de kritiska aspekterna av protokollet om att behålla rätt cellfenotyp för VLP-produktion och för att skapa lämplig miljö för att observera SAMHD1-begränsning. För det första är den exakta analysen av begränsning med tvåfärgsflödescytometri beroende av att uppnå lämpliga proportioner av transducerade och infekterade celler så att det finns tillräckligt med celler i varje område av diagrammet för analys. Som sådan bör forskaren sikta på en MOI på mindre än 1 (se protokoll). Transduktions- och infektionshastigheter som antingen är för höga eller för låga leder till problem med analys på grund av brist på oinfekterade eller dubbelt infekterade celler. På samma sätt är en liknande transduktionshastighet för SAMHD1-vektorer som ska jämföras nyckeln till att samma kompensationsmatris och gating kan tillämpas på hela experimentet, vilket ökar förtroendet för den efterföljande analysen.
För det andra är åldern på de använda U937-cellerna en nyckelfaktor för om de skiljer sig framgångsrikt. Framgångsrik differentiering kan övervakas genom observation av följsamhet, en minskad försurning av mediet över tid efter differentiering och adekvat begränsning av den vilda typen positiv kontroll i analysen. Differentiering på upp till 5 dagar har varit framgångsrik.
En av de viktigaste fördelarna med denna analys är dess flexibilitet. En mängd modifierade versioner av SAMHD1 (domäner, aminosyror, artsekvenser) kan testas via enkel platsstyrd mutagenes av vektorn eller kloning. På samma sätt kan varianter av testviruset utforskas. Analysen har tidigare använts för att visa att HIV-1 omvända transkriptasmutanter med minskad kapacitet att binda dNTP är mer känsliga för SAMHD1-begränsning. Samma princip kan användas för att testa begränsningen av andra virus med SAMHD1. Dessutom kan varierande differentieringsförhållanden eller artificiell manipulation av intracellulära dNTP-koncentrationer användas för att ytterligare undersöka interaktionen mellan intracellulära förhållanden och SAMHD1-aktivitet, ett område med aktiv forskning i Bishop-laboratoriet. Interaktionen mellan SAMHD1 och olika nukleosid omvända transkriptashämmare har också beskrivits, och effekten av SAMHD1 visas med hjälp av denna analys modifierad för användning i primära celler12,13,14,15.
Anpassning av protokollet för användning i primära celler övervinner begränsningen genom att undersöka metaboliska fenotyper i transformerade celler. Det befintliga formatet möjliggör dock ett bekvämt och mindre tekniskt utmanande protokoll för analys med hög genomströmning, särskilt med användning av en flödescytometer med en provtagare med hög genomströmning. Vid anpassning av protokollet bör de internt otransducerade cellernas mottaglighet för åskådareffekter (t.ex. immunsignalering) beaktas.
Som med många aspekter av cellbiologi är det viktigt att sådana analyser används som en del av ett helhetsgrepp för att förstå ett givet fenomen. Den parallella användningen av biokemiska analyser för SAMHD1-aktivitet16, kvantifiering av intracellulära dNTP-pooler och observation av SAMHD1-mutantfenotyper hos människor, ex vivo och i djurmodeller (utförs av laboratorier runt om i världen, några som beskrivs i denna fråga) är nyckeln till den utvecklande förståelsen av detta komplexa protein.
Disclosures
För Open Access har författarna tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författare accepterade manuskriptversioner som härrör från detta bidrag. De åsikter som uttrycks är författarens/författarnas och inte nödvändigtvis NIHR:s eller Department of Health and Social Cares.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Francis Crick Institute, som får sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (FC001042 och FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 och FC001162) och Wellcome Trust (FC001042 och FC001162) och av en Wellcome Trust Investigator Award till JPS (108012/Z/15/Z). Arbetet vid University of Cambridge samfinansierades av NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) och UK Medical Research Council (MR/S009752/1). Det senare brittiska finansierade priset är en del av EDCTP2-programmet som stöds av Europeiska unionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
