Summary
Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell'eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell'OCT con LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell'approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l'accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all'incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l'analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l'OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell'OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell'OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l'estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l'analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.
Introduction
Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia 1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l'invasione cellulare e le metastasi, l'angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I difetti nella regolazione del metabolismo degli sfingolipidi contribuiscono all'inizio e alla progressione dei tumori, determinano quanto siano aggressivi i tumori e come i tumori rispondano e sviluppino resistenza alla terapia 3,10. Pertanto, a causa di questi ampi impatti sull'eziologia della malattia, i metodi analitici che possono stabilire con precisione le alterazioni degli sfingolipidi specifici della malattia sono strumenti importanti. La spettrometria di massa (MS) è il metodo più accurato e affidabile per analizzare le alterazioni degli sfingolipidi.
I campioni umani che possono essere utilizzati per l'analisi delle alterazioni degli sfingolipidi possono essere ottenuti prospetticamente dalla suite chirurgica o retrospettivamente dai biodepositi tissutali. I tessuti freschi della chirurgia sono vantaggiosi perché possono essere analizzati direttamente dalla SM o da altri metodi analitici. Tuttavia, l'acquisizione prospettica di tessuti presenta ostacoli amministrativi, tecnici e logistici e la raccolta di campioni sufficienti per raggiungere il potere statistico può essere difficile. Ottenere tessuti da biorepository è vantaggioso perché possono essere acquisiti retrospettivamente, in gran numero, e i biorepository confermano istologia e patologia, utilizzano procedure operative standard per conservare e conservare criogenicamente i tessuti e possono fornire dati clinicopatologici che possono essere utilizzati per analisi di correlazione. Tuttavia, per preservare le caratteristiche molecolari e strutturali, i biorepository possono crioconservare i tessuti incorporandoli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), che abbiamo dimostrato interferisce con i saggi di normalizzazione dei dati e la quantificazione degli sfingolipidi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS)11 . È stato inoltre dimostrato che l'alcol polivinilico e il glicole polietilenico, i componenti primari del composto OCT, determinano la soppressione ionica in altre piattaforme di analisi della SM12,13,14,15. Pertanto, il composto OCT deve essere rimosso dai tessuti prima dell'analisi sfingolipidomica mediante SM.
In un precedente rapporto, abbiamo convalidato un protocollo per la rimozione del composto OCT da campioni umani per l'analisi LC-ESI-MS/MS11 e la metodologia utilizzata per la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati11. Qui, descriviamo in dettaglio le fasi del protocollo di rimozione del composto OCT sfingolipidomico (sOCTrP) e mostriamo dati rappresentativi da tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e normali tessuti adiacenti non coinvolti.
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Protocol
I tessuti polmonari umani de-identificati sono stati ottenuti dal Tissue and Data Acquisition and Analysis Core della Virginia Commonwealth University (VCU) nell'ambito di un protocollo approvato (#HM2471) dal comitato di revisione interno (IRB). L'uso di topi per la ricerca e la raccolta di tessuti di topi è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della VCU (IACUC).
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti un giorno prima del lavaggio dei tessuti.
- Pre-etichettare e pesare provette da centrifuga in polipropilene da 1,5 ml con codici identificativi concisi ma chiari per ciascun campione che verrà elaborato il giorno successivo. Utilizzare un marcatore permanente resistente agli agenti chimici (vedere la tabella dei materiali) che non sbiadisca sotto la manipolazione ripetuta del tubo.
- Apri un foglio di calcolo elettronico ed etichetta colonne consecutive con le seguenti intestazioni di colonna: identificatore del tubo (ID), tubo da solo, tubo con tessuto e tessuto totale. Immettere gli identificatori del tubo che verranno elaborati nella colonna denominata ID tubo.
- Pre-calibrare e azzerare una bilancia analitica. Posizionare un matraccio Erlenmeyer pulito da 10 mL al centro della piastra della bilancia (il matraccio fungerà da portatubi). Chiudere lo sportello della camera di pesata e tarare la bilancia con il pallone.
- Pesare provette da centrifuga da 1,5 ml. Posizionare con cautela il tubo nel pallone e chiudere lo sportello della camera di pesatura. Lasciare che il peso si stabilizzi e registrare il peso nel tubo etichettato a colonna da solo.
NOTA: Evitare di spostare il matraccio Erlenmeyer da 10 mL durante la pesatura dei provette. Se il matraccio viene spostato, ricentrare il matraccio e ricalibrare la bilancia. Posizionare i tubi chiusi in una griglia e conservare fino al momento del bisogno. - Pre-etichettare tubi e tappi di vetro con tappo a vite 13 x 100 mm con i codici identificativi e riempirli con 2 ml di metanolo di grado LC-MS. Metterli in una griglia per tubi, tapparli e conservarli in frigorifero (4 °C) fino all'uso.
NOTA: Utilizzare un dosatore di solvente con tappo di bottiglia (vedere la tabella dei materiali). Se non è disponibile, utilizzare pipette di vetro per evitare l'uso di materie plastiche durante l'erogazione di solventi organici. - Pre-etichettare provette in vetro 13 x 100 mm. Coprire e conservare le provette a temperatura ambiente.
- Fiale di autoiniettori pre-etichettati con codici identificativi. Coprire e conservare i flaconcini dell'autoiniettore a temperatura ambiente fino all'uso.
- Preparare stoppini per asciugare i tessuti.
- Inizia pulendo le forbici chirurgiche immergendole in metanolo di grado LC-MS per 5 minuti, quindi puliscile con un tessuto pulito da laboratorio.
- Utilizzando guanti senza polvere, ruotare l'estremità di un tessuto di laboratorio (vedi Tabella dei materiali) fino a formare uno stoppino finemente rastremato di 30-40 mm.
- Usando le forbici pulite a metanolo, tagliare lo stoppino sull'estremità spessa. Metti gli stoppini in una scatola di cartone pulita. Raddoppiare il numero di stoppini di quanto sarà necessario per elaborare tutti i campioni.
- Preparare punte per pipette accorciate da 1 ml. Utilizzando forbici chirurgiche pulite con metanolo, tagliare 4-5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 1 mL e riposizionare la punta nel supporto della punta. Prepara il doppio delle punte rispetto ai campioni da elaborare.
NOTA: Questi saranno utilizzati nel recupero dei tessuti lavati dai tubi. Non toccare l'estremità della punta. - Soluzione salina tamponata con tampone fosfato (PBS) di grado biologia molecolare pre-freddo a 4 °C (0,5 L è sufficiente). Questo sarà usato per recuperare i campioni. Per ogni campione che verrà lavorato, pre-chill (4 °C) 60 ml di acqua deionizzata ultrapura.
- Preparare standard interni di spettrometria di massa. Sciogliere i seguenti lipidi in etanolo:metanolo:acqua (7:2:1; v/v/v) ad una concentrazione di 25 nmol/mL: d17:1-sfingosina, (2S,3R,4E)-2-amminoeptadec-4-ene-1,3-diolo; D17:1-sfingosina-1-fosfato, eptadecasphing-4-enina-1-fosfato; C12-ceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sfingo-4-enina; C12-sfingomielina (d18:1/C12:0), N-(dodecanoil)-sphing-4-enina-1-fosfocolina; C12-glucosilceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glucosil-sphing-4-eine; C12-lattosilceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-lattosil-sphing-4-ene.
2. Lavaggio dei tessuti
NOTA: Il completamento di tutti i passaggi della sezione 1 un giorno prima consente a un ricercatore esperto di elaborare fino a 40 campioni al giorno e ai principianti ~ 10-15 campioni al giorno. Iniziare la mattina presto e non fermarsi fino al completamento di tutti i passaggi delle sezioni 2.1-3.8.
- Il giorno in cui i tessuti saranno lavorati, preparare l'area di lavoro dell'armadio di biosicurezza dotandolo di un vortice, un pipettor sierologico completamente carico e un vassoio per il ghiaccio. Per tutti i passaggi di questa sezione, indossare DPI appropriati, tra cui un camice da laboratorio, un doppio strato di guanti e occhiali protettivi. ATTENZIONE: I tessuti e i fluidi umani devono essere considerati e trattati come materiali biopericolosi.
- Pre-raffreddare (4 °C) una centrifuga a secchio oscillante, eventuali adattatori necessari per contenere tubi conici da centrifuga da 15 ml e coperchi di biocontenimento della centrifuga. Pre-chill (4 °C) una centrifuga ad angolo fisso in grado di contenere provette da centrifuga da 1,5 ml.
- Se i tessuti non sono aliquotati in provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml, utilizzare una spatola pulita con metanolo (pulita per ogni nuovo campione di tessuto) per trasferirli in provette di polipropilene pre-etichettate da 15 ml. Etichettare anche i tappi da 15 ml.
- Posizionare una griglia portatubi in grado di contenere 15 mL di provette da centrifuga in una vaschetta per il ghiaccio e riempire la vaschetta con ghiaccio. Scongelare i tessuti che verranno lavorati quel giorno mettendoli nel rack sul ghiaccio.
NOTA: Un minimo di 3-4 mg di tessuto deve essere richiesto al biorepository per l'elaborazione poiché è stato precedentemente dimostrato che i protocolli di lavaggio e pesatura dei tessuti sono accurati e affidabili a questi pesi11.
- Posizionare una griglia portatubi in grado di contenere 15 mL di provette da centrifuga in una vaschetta per il ghiaccio e riempire la vaschetta con ghiaccio. Scongelare i tessuti che verranno lavorati quel giorno mettendoli nel rack sul ghiaccio.
- Spostare la vaschetta del ghiaccio con i campioni nell'armadio di biosicurezza.
- Eseguire tre cicli sOCTrP11 come discusso di seguito (ad esempio, eseguire i passaggi 2.5.1-2.5.5 tre volte).
- Aggiungere 10 ml di acqua deionizzata ultrapura ghiacciata ghiacciata a ciascun tubo e coprirli ermeticamente. Lasciare incubare i tubi per 10 minuti.
- Vortice vigorosamente ogni tubo per 10-20 s o fino a quando tutto il tessuto depositato sulle pareti del tubo, o un pellet di tessuto, è completamente sospeso.
NOTA: Nei cicli sOCTrP 2-3, è fondamentale che il pellet venga risospeso in modo che qualsiasi OCT nel pellet venga diluito nella soluzione di lavaggio. - Trasferire i tubi nella centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata (4 °C). Centrifugare i campioni a 4.000-5.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: Evitare la generazione e l'esposizione ad aerosol biopericolosi generati durante la centrifugazione sigillando i portacentrifughi con un coperchio di biocontenimento (vedere Tabella dei materiali). - Prelevare i campioni dalla centrifuga e trasferirli nella vaschetta del ghiaccio. Posizionare il vassoio in un armadio di biosicurezza e aprire i tubi. Salva i tappi.
- Aspirare con cura la soluzione di lavaggio. Evitare di aspirare il materiale tissutale nel pellet lasciando ~ 0,5 ml di surnatante nel tubo. Tappare i tubi ed evitare la contaminazione incrociata abbinando i tappi etichettati con i tubi.
NOTA: La soluzione di lavaggio (il surnatante) nella fase 2.5.5 è un materiale biopericoloso; maneggiarlo e smaltirlo seguendo le linee guida sulla biosicurezza appropriate per gli esemplari di origine umana.
3. Pesatura dei tessuti (per la normalizzazione dei dati)
- Dopo l'ultimo ciclo di lavaggio sOCTrP, aspirare con cura la maggior parte della soluzione di lavaggio evitando di disturbare il pellet. Lasciare ~ 0,5 ml della soluzione di lavaggio nel tubo.
- Utilizzando le punte delle pipette accorciate (preparate al punto 1.9), prelevare 500 μL di PBS ghiacciato e aggiungerlo al tubo.
- Utilizzando la stessa punta, risospendere delicatamente il pellet e recuperare tutto il tessuto. Evitare il pipettaggio turbolento per ridurre la perdita di tessuto grazie alla sua aderenza alle pareti del tubo e della punta della pipetta.
- Aggiungere il tessuto risospeso al corrispondente tubo da centrifuga da 1,5 mL pre-etichettato e pre-pesato e posizionare il tubo sul ghiaccio. Ripetere l'operazione per tutti i tessuti nel set di dati.
- Mettere i tubi da 1,5 mL in una centrifuga pre-refrigerata e pellettare i tessuti a 7.000 x g per 5-7 minuti e 4 °C.
- Recuperare i tubi e aspirare con cura la maggior parte del PBS possibile senza disturbare il pellet. Rimettere il tubo sul ghiaccio.
- Centrifugare le provette per altri 3 minuti a 7.000 x g per garantire che i tessuti siano ben pellettati. Trasferire i tubi sul ghiaccio.
NOTA: La fase di centrifugazione aggiuntiva è importante per prevenire la perdita di tessuto quando si rimuove tutta la soluzione di lavaggio e la traspirante. Se si elaborano più di cinque campioni, ripetere la fase di centrifugazione di 3 minuti e 7.000 x g dopo che ogni quinto campione è stato elaborato per garantire che i tessuti rimangano pellettati. - Utilizzando gli stoppini preparati al punto 1.8, rimuovere delicatamente la soluzione di lavaggio rimanente. Utilizzare uno stoppino pulito per ogni campione. È accettabile tamponare delicatamente il tessuto con lo stoppino, che aiuterà a rimuovere la maggior parte della soluzione di lavaggio ma eviterà di perdere qualsiasi tessuto aderendo allo stoppino. Chiudere il tubo e metterlo sul ghiaccio.
- Pesare ogni tubo nella bilancia analitica recentemente calibrata, nastrata e azzerata.
- Posizionare ciascun tubo nel pallone Erlenmeyer di vetro e chiudere lo sportello della camera. Quando il peso si è stabilizzato, registrarlo nella colonna del foglio elettronico etichettata tubo w / tessuto.
- Dopo la pesatura, riposizionare il tubo sul ghiaccio.
- Aggiungere 300 μL di PBS ghiacciato. Utilizzando una punta di pipetta accorciata (punto 1.9), recuperare con cura tutto il tessuto e depositarlo in un tubo di vetro con tappo a vite preetichettato (preparato al punto 1.5) contenente 2 ml di metanolo LC-MS ghiacciato (aggiungere il tessuto al metanolo, non sul lato del tubo).
- Calcola la quantità di tessuto che è stata lavata sottraendo il tubo da solo dal tubo con valore di tessuto. Registrare questo numero nella colonna totale del tessuto. Il valore totale del tessuto sarà utilizzato per normalizzare i dati di spettrometria di massa nella fase 6.12.
- Conservare i campioni a -80 °C fino al momento di eseguire le fasi 4.1-4.15.
NOTA: Questo è un buon punto di sosta e i campioni possono essere conservati in modo sicuro per un paio di settimane a -80 °C. Per altri metodi di normalizzazione tissutale, come la concentrazione proteica o il contenuto di fosfati lipidici, fare riferimento a Rohrbach et al.11.
4. Estrazione dei lipidi
NOTA: è importante iniziare questi passaggi al mattino, in particolare quando verranno elaborati molti campioni. Prima di iniziare, preriscaldare a bagnomaria o incubatore a 48 °C.
- Prelevare dal congelatore i campioni preparati al punto 3.8 e gli standard lipidici della SM (preparati al punto 1.11). Lasciare che si equilibrino a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Vortice e immergere la soluzione standard interna in un bagno d'acqua ad ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) per 2-3 minuti o fino a quando gli standard lipidici MS sono completamente sciolti prima dell'erogazione nei campioni. Ciò eviterà errori nella normalizzazione dei dati.
- Utilizzando una pipetta ripetuta, aggiungere 250 pmol (10 μL dalla soluzione da 25 nmol/mL preparata al punto 1.11) di standard di spettrometria di massa interna a ciascuna provetta. Ri-caprare leggermente i tubi.
- Per facilitare l'omogeneizzazione, regolare il volume di metanolo a 2 ml. Utilizzare solo metanolo di grado LC-MS/MS.
- Lavorando un tubo alla volta, utilizzare un omogeneizzatore per triturare il tessuto fino a quando non sono visibili grumi (in genere 5-20 s). Spostare la punta dell'omogeneizzatore con un movimento circolare e premere delicatamente contro la parete del tubo per aiutare la triturazione. Ri-tappo il tubo.
NOTA: Assicurarsi che tutti i tessuti siano finemente triturati massimizzerà l'estrazione dei lipidi. Non aggiungere cloroformio ai campioni prima dell'omogeneizzazione poiché le punte dell'omogeneizzatore monouso sono fatte di plastica che si dissolverà in soluzioni contenenti cloroformio. - Immergere il tubo con un angolo di 45° in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 5-10 s.
- Se non si formano grumi di tessuto durante l'immersione nel bagno ad ultrasuoni, coprirlo e passare al tubo successivo.
- Se si formano grumi di tessuto quando il tubo è immerso nel bagno ad ultrasuoni, riomogeneizzare e indirizzare i grumi.
- Ripetere questo processo (omogeneizzazione / immersione in un bagno ad ultrasuoni) in modo iterativo fino a quando tutti i grandi grumi di tessuto sono rotti.
- In una cappa aspirante, aggiungere cloroformio e metanolo di grado LC-MS a ciascun tubo (utilizzare un dosatore per bottiglie) per ottenere un rapporto di 2:1:0.1 metanolo:cloroformio:acqua. Utilizzando tappi puliti, sigillare ermeticamente i tubi e lasciare sul banco fino alla fine della giornata.
- Per i tessuti di peso pari o inferiore a 50 mg, utilizzare un volume totale di estrazione di 4 ml e regolare utilizzando questo rapporto (soluzione di estrazione 50 mg:4 ml) per campioni più grandi.
- Prima di partire la sera, collocare i tubi ben coperti in un bagnomaria o in un'incubatrice a 48 °C e incubarli durante la notte.
NOTA: È fondamentale che i tubi siano ben chiusi in modo che i rapporti del solvente non cambino a causa dell'evaporazione. - La mattina seguente, prelevare i campioni dal bagno d'acqua a 48 °C e pellettare eventuali detriti insolubili in solvente mediante centrifugazione a 4.000-5.000 x g a 4 °C per 20 minuti.
- Lavorando in una cappa aspirante, decantare accuratamente il surnatante nelle provette di vetro borosilicato pre-etichettate 13 x 100 mm. Inclinare il tubo di 13 x 100 mm con un angolo di 30-45° per facilitare la decantazione.
NOTA: Se si trattano più di 12 campioni, non lasciare che i tubi centrifugati rimangano per lunghi periodi di tempo poiché i pellet si ammorbidiranno e i detriti insolubili verranno trasferiti durante l'esecuzione del passaggio 4.10. Per evitare ciò, estrarre solo 12 tubi dalla centrifuga alla volta e continuare a centrifugare gli altri tubi fino a quando non si è pronti a decantarli. - Trasferire i tubi in un concentratore di vuoto in grado di contenere tubi da 13 x 100 mm. Far evaporare tutto il solvente con una fase di riscaldamento iniziale di 1 ora (40 °C) e passare sotto il vuoto massimo.
- Rimuovere i tubi dal concentratore di vuoto e aggiungere 500 μL di metanolo di grado LC-MS (utilizzare un dosatore con tappo di bottiglia) a ciascun tubo.
- Risospendere gli estratti lipidici essiccati mediante vortice per 5-10 s, seguito da tubi di immersione con un angolo di 45 ° in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 2 minuti durante la rotazione del tubo. Ri-vortice per 5 s e immergere nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per un minuto aggiuntivo.
NOTA: Questo è un passaggio fondamentale per garantire il massimo recupero dei lipidi estratti. Non andare avanti fino a quando tutto il materiale essiccato sulla parete del tubo non è stato risospeso. - Porre i tubi da 13 x 100 mm in una centrifuga pre-raffreddata (4 °C) e rimuovere eventuali detriti insolubili mediante centrifugazione a 4.000-5.000 x g a 4 °C per 20-30 minuti.
- Decantare accuratamente il surnatante chiarificato in un flaconcino di autoiniettore pre-etichettato. L'inclinazione del flaconcino dell'autoiniettore con un angolo di 30-45° faciliterà la decantazione. Assicurarsi che l'intero contenuto del tubo da 13 x 100 mm sia decantato nel flaconcino del caricatore automatico.
- Tappare ermeticamente i tubi e conservarli a -80 °C fino all'analisi con LC-ESI-MS/MS.
5. Analisi LC-ESI-MS/MS
NOTA: la seguente procedura utilizza un sistema di pompa binario accoppiato a un autoiniettore, un degasatore e un sistema LC-MS/MS che opera in modalità triplo quadrupolo. La temperatura della colonna è stata mantenuta utilizzando un forno a colonna. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sulle attrezzature utilizzate.
- Preparare la fase mobile A1 (CH 3 OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, con formiato di ammonio 5 mM) e la fase mobile B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, con formiato di ammonio 5 mM). Utilizzare solo solventi, acqua e reagenti di grado LC-MS.
- Per ogni set di campioni, preparare quattro flaconcini con caricatore automatico Blank contenenti 500 μL di metanolo LC-MS.
- Per ogni set di campioni preparare due flaconcini di autoloader standard interno (etichetta come IS) diluendo 10 μL (250 pmol totali per ogni standard) della soluzione standard interna preparata al punto 1.11 in 500 μL di metanolo di grado LC-MS.
- Impostare la temperatura del forno a colonna su 60 °C e la temperatura della sorgente ionica su 500 °C.
- Per l'analisi MS/MS, utilizzare la modalità triplo quadrupolo dello spettrometro. Impostare il primo quadrupolo (Q1) per far passare gli ioni precursori, mentre impostare il terzo quadrupolo (Q3) per far passare ioni prodotto molecolarmente distintivi (o una scansione attraverso più m / z in Q1 o Q3) usando N2 per indurre collisionalmente dissociazioni nel quadrupolo 2 (Q2), che è sfalsato da Q1 di 30-120 eV.
- Impostare la finestra di rilevamento delle coppie di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) su 120 s con un tempo di scansione target di 1,0 s. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco di coppie MRM, energie di ionizzazione ed energie di collisione.
- Utilizzare i seguenti parametri per risolvere gli sfingolipidi nella fase LC: utilizzando una portata di 0,7 mL/min, equilibrare una colonna di fase inversa C18 di 2,1 (i.d) x 50 mm per 0,5 minuti con una miscela di solvente composta al 95% dalla fase mobile A1 e dalla fase mobile B1 al 5%.
- Dopo l'iniezione del campione, mantenere il rapporto di fase mobile A1/B1 a 95/5 per 2,25 minuti, seguito da un gradiente lineare al 100% B1 su 1,5 minuti, che viene quindi mantenuto al 100% B1 per 5,5 minuti, seguito da un ritorno del gradiente di 0,5 minuti a 95/5 A1/B1.
- Dopo la corsa, riequilibrare la colonna con una miscela di 95/5 A1/B1 per 0,5 min.
- Utilizzare le seguenti impostazioni per il caricatore automatico di esempio: volume di risciacquo, 500 μL; corsa dell'ago, 52 mm (deve essere regolata in base alle dimensioni e al volume del flaconcino in ciascun flaconcino); velocità di risciacquo, 35 μL/s; velocità di campionamento, 5,0 μL/s; tempo di immersione di risciacquo, 2 s; modalità di risciacquo, prima e dopo l'aspirazione; tempo di risciacquo,2 s.
- Posizionare i campioni preparati al punto 4.15 su un vassoio del caricatore automatico nel seguente ordine: Vuoto; È; Vuoto; campioni preparati nella fase 4.15; Vuoto, È, Vuoto.
- Analizzare 5-10 μL di ciascun campione mediante LC-ESI-MS/MS. Analizzare lo stesso volume per tutti i campioni nel set di dati.
6. Elaborazione, integrazione e normalizzazione dei dati
NOTA: Sebbene i seguenti passaggi delineino una procedura per software specifico (vedere Tabella dei materiali), procedure simili su strumenti e software LC-MS equivalenti possono essere utilizzate per integrare coppie MRM per le classi lipidiche analizzate e gli standard interni corrispondenti.
- Aprire il software di quantificazione. Nella scheda Quantitate fare doppio clic su Quantitation Wizard. Nella finestra pop-up, nell'area di lavoro più a sinistra, passare al set di dati corretto e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su di esso. Gli esempi disponibili verranno visualizzati nell'area di lavoro centrale.
- Evidenziare i campioni da analizzare, quindi fare clic sulla freccia per destra per aggiungere campioni all'area di lavoro Campioni selezionati . Fare clic su Avanti per passare alla schermata delle impostazioni e delle query in cui vengono in genere utilizzate le impostazioni predefinite.
- Premere Avanti per passare alla schermata di selezione del metodo di integrazione. Selezionare un metodo di integrazione appropriato contenente coppie di transizione MRM per i lipidi da analizzare. Fare riferimento alla Tabella 1 per le coppie di transizione MRM. Premi Fine.
NOTA: i tempi di conservazione variano a seconda della strumentazione e delle singole impostazioni e devono quindi essere verificati per ogni singola configurazione. - Nella barra di spostamento fare clic sul riquadro Peak Review per ispezionare le coppie di Gestione record di messaggi. Per facilitare la revisione, fare clic con il pulsante destro del mouse sul riquadro Peak Review, modificare lo zoom automatico al 100% del picco più grande e una finestra di zoom di 1,00 - 2,00 minuti.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra Visualizzazione quantificazione e selezionare Analita e lo sfingolipide desiderato da esaminare. Verificare che non vi siano picchi nei campioni vuoti e che il picco corretto sia stato integrato nei campioni IS.
- Inizia a integrare campioni sconosciuti. Lavorando una classe di sfingolipidi alla volta, ispezionare il tempo di ritenzione per la coppia MRM dello standard interno (ad esempio, C12: 0 ceramide) e assicurarsi che il software abbia integrato il picco corretto.
- Continuare sugli analiti della stessa classe lipidica (cioè C14:0 ceramide, C16:0-ceramide, ecc.), iniziando con il lipide a catena più corta della classe. Verificare per ogni lipide di lunghezza della catena che la routine software abbia integrato il picco di coppia MRM corretto.
- Quando tutti gli analiti sono stati integrati, creare un foglio elettronico per ogni specie di sfingolipidi analizzata (ad esempio, ceramidi, sfingomieline, ecc.). Etichettare le intestazioni delle colonne in modo che corrispondano all'ordine degli analiti e delle lunghezze delle catene nel software di quantificazione LC-MS/MS. Includi anche un'intestazione di colonna per l'ID campione e i pesi di normalizzazione del campione determinati nel passaggio 3.9.
NOTA: Come descritto in precedenza11, altre misure di normalizzazione comuni includono il contenuto totale di fosfato lipidico o la quantità di proteine. - Esporta o copia le aree di picco per tutti gli analiti e gli standard interni nel foglio di calcolo elettronico.
- Normalizzare i dati dividendo l'area del picco integrata di ciascuna specie di lunghezza della catena per una data classe di sfingolipidi per l'area del picco del suo standard interno corrispondente. Ad esempio, C14:0 ceramide, C16:0 ceramide, ceramide C18:1, ecc., Dovrebbero essere divisi ciascuno per il C12:0 Ceramide Area di picco standard interna.
- Convertire l'area del picco in moli di lipidi recuperati moltiplicando l'area del picco normalizzata (calcolata nel punto 6.10) per la quantità di standard interno, in picomoli, che è stata aggiunta al campione nel punto 4.3. In questo protocollo, questa quantità è di 250 pmol.
- Per ottenere la quantità relativa di lipidi in ciascun campione, dividere i picomoli di ciascuna lunghezza della catena lipidica per il peso del tessuto determinato al punto 3.9. Questo darà unità di picomoli di lipidi per mg di tessuto.
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Representative Results
In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un metodo per rimuovere l'OCT dai tessuti umani crioconservati e pesare i tessuti per l'analisi mediante LC-ESI-MS / MS. I materiali necessari per questa procedura sono elencati nella tabella dei materiali. Mostrati nella Figura 1 sono i risultati di un tipico esperimento in cui 10 tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e 10 tessuti normali adiacenti sono stati lavati per rimuovere l'OCT e analizzati da LC-ESI-MS / MS. È importante sottolineare che, come abbiamo precedentemente mostrato11, ci sono varie specie di ceramidi a catena (Figura 1A) e monoesosil-ceramidi (Figura 1B) che sono significativamente elevate nei tumori dell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai normali tessuti adiacenti non coinvolti.
Negli esperimenti di controllo per valutare l'effetto dell'OCT sulle fasi di estrazione dei lipidi descritte nella sezione 4, 200 mg di fegati di topi (C57BL6; maschi; 14-16 settimane) sono stati risospesi in 2 ml di soluzione salina tamponata fosfato e omogeneizzati fino a triturazione fine. La sospensione epatica fine risultante è stata quindi ampiamente sonicata con un sonicatore sonda (tre cicli di 1 min di sonicazione su ghiaccio, 1 min di riposo sul ghiaccio, 60% di potenza; microtip). Da questa soluzione sono state preparate sei repliche omogeneate di fegato da 300 μL. A tre repliche, sono stati aggiunti 200 mg di OCT (quantità media trovata nei campioni di biorepository11) e 200 μL di acqua sono stati aggiunti agli altri tre. I campioni sono stati quindi elaborati in parallelo seguendo i passaggi descritti nella sezione 4. È importante sottolineare che, dopo la centrifugazione della soluzione monofase Bligh-Dryer, i campioni contenenti OCT erano torbidi mentre i campioni di controllo contenenti acqua erano limpidi (Figura 2A). La torbidità nella soluzione di estrazione lipidica monofase persisteva anche dopo un aumento della centrifugazione e un'ampia sonicazione (non mostrata). Dopo che il solvente è stato evaporato, i campioni contenenti OCT avevano pellet di grandi dimensioni (Figura 2B), che non potevano essere ricostituiti in metanolo anche sotto vigoroso vortice e sonicazione estesa. I campioni contenenti OCT hanno anche mostrato una grande perdita di segnale per gli standard interni di tutte le specie analizzate (Figura 3A-G). Abbiamo anche precedentemente dimostrato che i campioni contenenti OCT hanno mostrato perdita di segnale per molti degli sfingolipidi analizzati11.
Tipicamente, ci si aspetta che gli standard degli sfingolipidi eluiscano sequenzialmente, come mostrato nella Figura 4 nel seguente ordine: d17:1 sfingosina, d17:1 sfingosina-1-fosfato, C12:0 lattosil-ceramide, C12:0 monoesosil-ceramide, C12:0 sfingomielina e C12:0 ceramide. Per ciascuna di queste specie di sfingolipidi, utilizzando il gradiente e le impostazioni della strumentazione descritte nella sezione 5 e in precedenza 11, ci sarà uno spostamento di circa +0,15 minuti nel tempo di ritenzione per ogni aumento di 2 atomi di carbonio nella lunghezza della catena. Ad esempio, come mostrato nella Figura 5, C14:0-ceramide (Figura 5B) eluirà circa +0,15 minuti dopo C12:0-ceramide (Figura 5A). Un doppio legame nell'acido grasso spesso provoca uno spostamento di -0,15 nel tempo di ritenzione, quindi C16: 0-ceramide (Figura 5C) avrà un tempo di ritenzione simile a C18: 1-ceramide (Figura 5D). Tuttavia, i lipidi a catena più lunga (cioè C24: 0, C26: 0) possono avere spostamenti di tempo di ritenzione più grandi (Figura 5I, K, rispettivamente).
Figura 1: Profili sfingolipidici degli adenocarcinomi polmonari e dei tessuti polmonari adiacenti non coinvolti. I tessuti sono stati immagazzinati criogenicamente in OCT, scongelati, elaborati con tre cicli di sOCTrP, pesati e analizzati mediante LC-ESI-MS / MS. I livelli sono in pmol per mg di tessuto. Le specie di lunghezza della catena acilica indicate di ceramide (A), monoesosilceramide (B), sfingomielina (C), lattosilceramide (D) e sfingosina (E; Sph), sfingosina-1-phopshate (F; Sono stati quantificati S1P), diidro-Sph (E) e diidro-S1P (F). n = 10 tumori e n = 10 tessuti adiacenti non coinvolti. I grafici delle caselle mostrano mediane (linea nera) e baffi da min a max. ns, non significativi; , p≤0,005; , p ≤ 0,0005. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di campioni estratti con e senza OCT. I fegati di topo sono stati omogeneizzati e sonicati, suddivisi in sei campioni identici: 200 mg di OCT sono stati aggiunti a tre campioni e acqua agli altri tre. (A) Dopo che metanolo e cloroformio sono stati aggiunti per ottenere un rapporto di 2:1:0.1 metanolo:cloroformio:acqua (v:v:v), incubazione notturna a 48 °C, seguita da centrifugazione, i surnatanti dei campioni che contenevano OCT erano torbidi e non potevano essere chiariti mediante sonicazione, vortice o centrifugazione. (B) Dopo l'evaporazione del solvente, è stato recuperato un pellet di grandi dimensioni da campioni contenenti PTOM che non è stato possibile ricostituire completamente in 0,5 ml di metanolo dopo un'estesa sonicazione e vortice. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione LC-ESI-MS/MS degli standard degli sfingolipidi in presenza o assenza di OCT. I fegati di topo sono stati omogeneizzati, sonicati e divisi in sei campioni identici. A tre dei sei campioni sono stati aggiunti 200 mg di OCT, mentre agli altri tre è stata aggiunta acqua. Dopo l'aggiunta di standard interni, metanolo e cloroformio, i campioni sono stati elaborati in modo identico e i lipidi estratti sono stati analizzati da LC-ESI-MS / MS. Sono mostrate coppie di monitoraggio di reazione multipla (MRM) dei lipidi indicati (A-F) e corrispondenti aree di picco integrate (G). Abbreviazioni: Sph, sphingosine; S1P, sfingosina-1-fosfato. Le frecce nere indicano la coppia MRM corretta per lo sfingolipide indicato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Tempi di ritenzione relativi per coppie di monitoraggio delle reazioni multiple LC-ESI-MS/MS degli standard degli sfingolipidi. I fegati di topo sono stati omogeneizzati e sonicati; standard interni, metanolo e cloroformio aggiunti; e lipidi estratti e analizzati da LC-ESI-MS/MS. Sono riportati i tempi di ritenzione di coppie multiple di monitoraggio delle reazioni dei lipidi indicati (A-F). Si noti l'ordine relativo in cui i lipidi eluiscono durante il gradiente della cromatografia liquida. Abbreviazioni: Sph, sphingosine; S1P, sfingosina-1-fosfato; SM, sfingomielina. L'asse X è il tempo di ritenzione della coppia MRM in minuti. L'asse Y è l'intensità del segnale per le coppie MRM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Spostamento dipendente dalla lunghezza della catena acilica nel tempo di ritenzione delle coppie LC-ESI-MS/MS MRM. I fegati di topo sono stati omogeneizzati e sonicati; standard interni, metanolo e cloroformio aggiunti; e lipidi estratti e analizzati da LC-ESI-MS/MS. Sono mostrati i tempi di ritenzione e le coppie MRM dei lipidi indicati. Si noti lo spostamento del tempo di ritenzione con l'aumentare della lunghezza della catena acilica per vari lipidi (A-K), che in genere corrisponde a un tempo di ritenzione di +0,15 minuti per aumento di 2 atomi di carbonio. Un doppio legame comporterà uno spostamento del tempo di ritenzione di -0,15 minuti (D, H, J). Tuttavia, per i lipidi a catena più lunga, l'aumento relativo del tempo di ritenzione può essere più lungo (G-K). L'asse X è il tempo di ritenzione della coppia MRM in minuti. L'asse Y è l'intensità del segnale per le coppie MRM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: coppie MRM, parametri di ionizzazione ed energie di collisione per l'analisi LC-ESI-MS/MS. DP, potenziale di declustering; CE, energia di collisione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l'OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS 11. L'OCT nei tessuti crioconservati può anche interferire con i metodi di normalizzazione dei tessuti come la pesatura e i saggi di quantificazione delle proteine come Bradford e BCA11. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rimuovere l'OCT dai tessuti umani e successivamente essere analizzato mediante spettrometria di massa. Il protocollo può essere modificato per utilizzare altre fonti di tessuto che non sono polmonari o da tessuti di topi come abbiamo precedentemente descritto11. Inoltre, possono essere utilizzate altre strategie di normalizzazione dei dati di spettrometria di massa, comprese quelle che abbiamo precedentemente descritto11, nonché altri metodi convalidati.
Un limite importante di questo protocollo è che non è adeguato per l'analisi di tessuti che sono stati precedentemente fissati con formaldeide o un altro agente fissante. È adeguato solo per i tessuti che non sono stati fissati e sono stati crioconservati nell'OCT. Inoltre, questo metodo non è adeguato per la lavorazione di tessuti che pesano meno di 1-2 mg in quanto vi è sempre una certa perdita di tessuto durante le fasi di sOCTrP e trasferimenti tra provette. Sarà difficile pesare tessuti così piccoli utilizzando una scala analitica standard e qualsiasi PBS residuo non rimosso durante la fase di traspirazione contribuirà notevolmente all'errore sperimentale. Di seguito sono riportate altre considerazioni importanti quando si lavano i tessuti per rimuovere l'OCT con questo metodo.
Per garantire la corretta esecuzione di questo protocollo, in particolare se verranno elaborati molti campioni, è necessario eseguire in anticipo le fasi descritte nella sezione 1, tra cui la pre-etichettatura e la pre-pesatura di tubi da 1,5 ml, la pre-etichettatura di tubi e tappi a vite da 13 x 100 mm, tubi di coltura da 13 x 100 mm e flaconcini di autoiniettori, preparazione di tutti gli stoppini, pre-accorciamento delle punte delle pipette da 1 ml, e soluzioni di lavaggio pre-raffreddamento. Ciò eviterà che le procedure dispendiose in termini di tempo debbano essere eseguite il giorno in cui i tessuti saranno lavati, il che può portare a ritardi. In generale, scopriamo che se molti di questi passaggi vengono eseguiti il giorno prima, un ricercatore esperto può lavare 30-40 campioni in una normale giornata lavorativa. Tuttavia, poiché il primo punto di arresto suggerito è dopo che tutti i tessuti sono stati lavati, pesati e posti in metanolo e conservati a -80 °C, non eseguire in anticipo 1,5 ml di pre-pesatura ed etichettatura avrà un impatto sull'efficienza e prolungherà il tempo necessario per lavare 30-40 tessuti.
La pesatura dei tessuti è uno dei passaggi più importanti, poiché errori o negligenza influiranno sulla qualità dei dati in quanto si trasferiranno nella normalizzazione dei dati. È fondamentale che la bilancia analitica utilizzata per la pesata sia calibrata, azzerata correttamente e registrata. Di conseguenza, quando si utilizzano stoppini, è importante rimuovere il più possibile la soluzione di lavaggio, specialmente per i tessuti di peso inferiore a 5 mg. A questi pesi dei tessuti, la soluzione di lavaggio residua renderà la pesatura imprecisa di una grande percentuale e verrà trasferita come errore nella normalizzazione dei dati. Quando si rimuove la soluzione di lavaggio, scopriamo che i tessuti possono essere toccati delicatamente con lo stoppino per diversi secondi per rimuovere quanta più soluzione di lavaggio possibile senza portare a perdite significative di tessuto per adesione allo stoppino. Tuttavia, ogni tipo di tessuto lavato dovrebbe essere testato per l'adesione agli stoppini e questi passaggi nel protocollo regolati di conseguenza.
Per facilitare il flusso di lavoro di lavaggio dei tessuti, si raccomanda di richiedere trucioli di tessuto al biorepository in provette di polipropilene da 15 ml. Ciò ridurrà la manipolazione dei tessuti prima del lavaggio.
Quando si lavano i tessuti, se si osserva un materiale gelatinoso sul fondo di un tubo dopo il terzo ciclo di sOCTrP, ciò è indicativo del fatto che non tutti gli OCT sono stati rimossi e sono necessari più cicli di sOCTrP. Tenere traccia di quanti cicli sono necessari e, per coerenza, eseguire lo stesso numero di cicli sOCTrP in tutti i campioni nel set di dati. Abbiamo precedentemente valutato fino a 9 cicli di sOCTrP e non abbiamo riscontrato alcun effetto sulla deplezione degli sfingolipidi nei tessuti11.
Quando si utilizzano stoppini per rimuovere la soluzione di lavaggio, tamponando delicatamente il fazzoletto si assicurerà che tutta la soluzione di lavaggio venga rimossa. Ciò aumenta l'accuratezza della stima del peso tissutale. Tuttavia, è necessario prestare molta attenzione con tessuti molto piccoli in quanto questi possono aderire allo stoppino e provocare la perdita di campione. È utile utilizzare diversi stoppini per lo stesso tubo per rimuovere quanta più soluzione possibile. Per evitare la contaminazione del campione incrociato, utilizzare sempre uno stoppino nuovo e pulito per ogni campione. Quando si producono stoppini, utilizzare tessuto di qualità di laboratorio (vedi Tabella dei materiali) poiché li abbiamo precedentemente testati e abbiamo scoperto che contengono una quantità trascurabile di sfingolipidi contaminanti11. Gli stoppini di altri materiali possono essere utilizzati se sono testati come descritto11.
Quando si recuperano campioni da provette da 1,5 ml dopo la pesatura, è fondamentale che tutto il tessuto venga recuperato. In caso contrario, si verificheranno errori nella normalizzazione dei dati. Se è necessario più PBS per recuperare tutto il tessuto, aggiungere la quantità equivalente di PBS utilizzata a tutte le altre provette per evitare differenze nell'efficienza di estrazione che potrebbero derivare da campioni contenenti diverse quantità di PBS. Regolare i volumi di cloroformio e metanolo per tenere conto di qualsiasi aumento del volume d'acqua per mantenere un rapporto metanolo:cloroformio:acqua di 2:1:0.1.
Quando si scongelano i campioni, è importante che questo passaggio sia fatto sul ghiaccio per evitare la degradazione di lipidi labili come la sfingosina-1-fosfato. Anche lo scongelamento completo dei campioni fino a quando l'PTOM è allo stato liquido ne faciliterà la rimozione, in quanto sarà più facilmente sciolto nella soluzione di lavaggio a freddo piuttosto che rimanere come pellet durante le prime fasi di lavaggio.
Occasionalmente, specialmente quando si lavano i tessuti polmonari, ci saranno frammenti che non pellettiranno e galleggeranno sopra la soluzione di lavaggio dopo la centrifugazione. Con cura, immergere la punta di aspirazione sotto i tessuti galleggianti per rimuovere la soluzione di lavaggio può prevenire la perdita durante l'aspirazione.
Non aggiungere cloroformio ai campioni prima dell'omogeneizzazione poiché le punte dell'omogeneizzatore monouso sono di plastica e si dissolveranno in soluzioni contenenti cloroformio. Ciò può avere un impatto significativo sulla quantificazione LC-MS/MS dei lipidi nei campioni. Pertanto, in generale, l'uso di materie plastiche non resistenti ai solventi dovrebbe essere evitato quando si erogano cloroformio e metanolo. Questi solventi sono anche tossici e devono essere maneggiati in un'apposita cappa aspirante. Indossare DPI appropriati quando si maneggiano solventi come metanolo e cloroformio.
I tessuti umani devono essere trattati in un armadio di biosicurezza appropriato (ad esempio, Classe II). Gli utilizzatori dovrebbero essere addestrati alla manipolazione di materiali e fluidi biopericolosi di origine umana e seguire protocolli di sicurezza quali indossare adeguati dispositivi di protezione individuale e decontaminare qualsiasi superficie o attrezzatura che entri in contatto con i campioni. Gli utenti devono disinfettare accuratamente (vedere la tabella dei materiali per il decontaminante suggerito) qualsiasi superficie o attrezzatura (centrifughe, portacentrifughe e adattatori, pipettatori, vortici, superfici delle cappe aspiranti, bilance, bicchieri, vassoi per il ghiaccio, tastiere dei computer, mouse per computer, ecc.) utilizzati durante la procedura di lavaggio. I membri del laboratorio non devono utilizzare attrezzature o cappucci utilizzati per il lavaggio dei tessuti fino a quando non sono stati accuratamente disinfettati. Evitare l'uso di candeggina su superfici in acciaio ed elettronica.
Quando si elaborano molti campioni, prestare attenzione per prevenire la contaminazione incrociata utilizzando tappi puliti nelle fasi di ri-tappatura durante le fasi di estrazione dei lipidi. I tappi possono anche essere riutilizzati se sono etichettati. Tuttavia, in pratica, troviamo che i marcatori risaltano male sui cappucci neri e le etichette adesive cadono dai tubi durante l'incubazione notturna a 48 ° C.
Gli sfingolipidi hanno dimostrato importanti attori nell'eziologia della malattia e dei tumori umani. Pertanto, vi è un grande interesse nel definire con precisione le alterazioni del metabolismo degli sfingolipidi in queste malattie in quanto possono rivelare bersagli terapeutici. Tuttavia, molti dei tessuti che sono facilmente accessibili ai ricercatori sono crioconservati in OCT, che non è compatibile con l'analisi della spettrometria di massa. Pertanto, il protocollo dettagliato qui descritto amplierà il repertorio di tessuti adeguati per l'analisi sfingolipidomica quantitativa, e quindi contribuirà ad aumentare la nostra comprensione della biologia delle alterazioni del metabolismo lipidico nelle malattie umane e nel cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I servizi e il supporto del progetto di ricerca sono stati forniti dal VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e dal VCU Lipidomics and Metabolomics Core, che sono supportati in parte con il finanziamento del NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
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