Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62620
Automatic Translation
*1, *2, 1,2
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura
* These authors contributed equally

Summary

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

Abstract

הצומת הנוירו-שרירי (NMJ) הוא נקודת מגע מיוחדת בין עצב המנוע לשריר השלד. סינפסה היקפית זו מציגה פלסטיות מורפולוגית ותפקודית גבוהה. בהפרעות רבות במערכת העצבים, NMJ הוא יעד פתולוגי מוקדם וכתוצאה מכך כשל עצבי, חולשה, ניוון, ואפילו במוות סיבי שריר. בשל הרלוונטיות שלה, האפשרות להעריך כמותית היבטים מסוימים של היחסים בין רכיבי NMJ יכול לעזור להבין את התהליכים הקשורים ההרכבה שלה / פירוק. המכשול הראשון בעת עבודה עם השרירים הוא להשיג את המומחיות הטכנית לזהות ולנתח במהירות מבלי לפגוע בסיבים שלהם. האתגר השני הוא להשתמש בשיטות זיהוי באיכות גבוהה כדי להשיג תמונות NMJ שניתן להשתמש בהן לביצוע ניתוח כמותי. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לנתח את שרירי הדיגיטאורום שלוונגוס וסולאוס מחולדות. זה גם מסביר את השימוש אימונופלואורסצנטיות כדי לדמיין אלמנטים pre and postsynaptic של NMJs הר שלם. התוצאות שהושגו להוכיח כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי להקים את האנטומיה המיקרוסקופית של הסינפסיס ולזהות שינויים עדינים במצב של חלק מרכיביה בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים.

Introduction

צומת היונקים הנוירו-שריריים (NMJ) הוא סינפסה משולשת כולינרגית גדולה המורכבת מסוף עצבי הנוירון המוטורי, הממברנה הפוסט-סינפטית על סיבי שריר השלד, ותאי Schwann מסוף1,2,3. סינפסה זו מציגה פלסטיות מורפולוגית ותפקודית גבוהה4,5,6,7,8, אפילו במהלך הבגרות כאשר NMJs יכול לעבור שינויים מבניים דינמיים. לדוגמה, כמה חוקרים הראו כי קצות עצב מוטוריים משנים ללא הרף את צורתם בסולם המיקרומטר9. כמו כן דווח כי המורפולוגיה של NMJ מגיבה לדרישות פונקציונליות, שימוש שונה, הזדקנות, פעילות גופנית או וריאציות בפעילות לוקומוטור4,10,11,12,13,14,15. לכן, אימון וחוסר שימוש מייצגים גירוי חיוני כדי לשנות כמה מאפיינים של NMJ, כגון גודלו, אורכו, פיזור של שלטים וקולטנים סינפטיים, כמו גם מסוף עצבים המסתעף14,16,17,18,19,20.

יתר על כן, הוכח כי כל שינוי מבני או ניוון של צומת חיוני זה עלול לגרום למוות תא נוירון מוטורי ניוון שריר21. הוא גם חשב כי תקשורת שונה בין עצבים ושרירים יכול להיות אחראי לשינויים NMJ הקשורים לגיל הפיזיולוגי ואולי להרס שלה במצבים פתולוגיים. פירוק צומת נוירו-שרירי ממלא תפקיד מכריע בפתיחת טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS), מחלה נוירודגנרטיבית המהווה את אחת הדוגמאות הטובות ביותר ליחסי שריר-עצבלקויים 3. למרות המחקרים הרבים שנערכו על תפקוד לקוי של נוירון מוטורי, עדיין מתלבט אם ההידרדרות שנצפתה ב- ALS מתרחשת עקב הנזק הישיר לנויר העצב המוטורי ולאחר מכן משתרעת על תחזיות קורטיקו-עמוד השדרה22; או אם זה צריך להיחשב אקסונאופתיה דיסטלית שבו ניוון מתחיל בקצות העצבים ומתקדם לכיוון הנוירון המוטורי סומה23,24. בהתחשב במורכבות של פתולוגיה ALS, הגיוני לשקול כי תערובת של תהליכים עצמאיים מתרחשת. כמו NMJ הוא השחקן המרכזי של יחסי הגומלין הפיזיופתולוגיים בין שריר לעצב, חוסר היציבות שלה מייצג נקודה מרכזית במקור המחלה הרלוונטית לניתוח.

מערכת היונקים הנוירו-שרירית מאורגנת תפקודית ליחידות מוטוריות נפרדות, המורכבות מתא עצב מוטורי וסיבי השריר המופניים באופן בלעדי על ידי מסוף העצבים שלה. לכל יחידה מוטורית יש סיבים עם תכונות מבניות ופונקציונליות דומות או זהות25. גיוס סלקטיבי נוירון מוטורי מאפשר אופטימיזציה תגובת שריר לדרישות פונקציונליות. עכשיו ברור כי שרירי השלד של היונקים מורכבים מארבעה סוגי סיבים שונים. חלק מהשרירים נקראים על פי המאפיינים של סוג הסיבים הנפוץ ביותר שלהם. לדוגמה, הסוליה (שריר אחורי של הגפה האחורית המעורבת בשמירה על תנוחת הגוף) נושאת רוב של יחידות עווית איטיות (סוג 1) ומוכרת כשריר איטי. במקום זאת, extensor digitorum longus (EDL) מורכב למעשה מיחידות עם תכונות עווית מהירות דומות (סיבים מסוג 2) וידוע כשריר מהיר המתמחה בתנועות פאזיות הדרושות לתנועה. במילים אחרות, למרות שהשרירים הבוגרים הם פלסטיק בטבע בשל ההשפעות ההורמונליות והעצבים, הרכב הסיבים שלו קובע את היכולת לבצע פעילויות שונות, כפי שניתן לראות בסולאוס שחווה פעילות מתמשכת בעצימות נמוכה ו- EDL המציג עווית בודדת מהירה יותר. תכונות אחרות המשתנות בין סוגים שונים של סיבי שריר קשורות למבנה שלהם (תוכן מיטוכונדריאלי, הרחבה של רשתית סרקופלסמית, עובי קו Z), תוכן ATPase מיוסין, והרכב שרשרת כבד מיוסין26,27,28,29.

עבור NMJs מכרסמים, ישנם הבדלים משמעותיים בין השרירים28,29. ניתוחים מורפומטריים שבוצעו בסולאוס וב- EDL מחולדות חשפו מתאם חיובי בין האזור הסינפטי לקוטר הסיבים (כלומר, האזור הסינפטי בסיבים איטיים סולאוס גדול יותר מאשר בסיבים מהירים של EDL) אך היחס בין אזור NMJ וגודל הסיבים דומה בשני השרירים30,31. כמו כן, ביחס למסופי העצבים, האזורים המוחלטים של לוח הקצה בסיבים מסוג 1 היו נמוכים יותר מאשר בסיבים מסוג 2, ואילו הנורמליזציה בקוטר סיבים הפכה אזורים של מסופי עצבים בסוג 1 סיבים הגדוליםביותר 32.

עם זאת, מעט מאוד מחקרים מתמקדים בניתוח מורפומטרי כדי להראות את הראיות לשינויים בחלק מרכיבי NMJ33,34. לכן, בשל הרלוונטיות של NMJ בתפקוד של האורגניזם, אשר מורפולוגיה ופיזיולוגיה משתנים בפתולוגיות שונות, חשוב לייעל פרוטוקולי ביתור של סוגים שונים של שרירים עם איכות מספיק כדי לאפשר הדמיה של כל מבנה NMJ. כמו כן יש צורך להעריך את המופע של שינויים לפני או פוסטינפטי במצבים ניסיוניים שונים או תנאים כגון הזדקנות או פעילות גופנית35,36,37,38. בנוסף, זה יכול להיות מועיל כדי להעיד על שינויים עדינים יותר ברכיבי NMJ כגון זרחן neurofilament שונה בקצות העצבים מסוף כפי שדווח ב ALS39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות חוק הלאום N° 18611 לטיפול בבעלי חיים המשמשים למטרות ניסיוניות. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (CEUA IIBCE, פרוטוקול מספר 004/09/2015).

1. ניתוח שרירים (יום 1)

הערה: לפני שתתחיל, לעשות 40 מ"ל של 0.5% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4 מלוחים פוספט של Dulbecco (DPBS). לחלופין, לעשות 20 מ"ל של 4% PFA. הכן 5 mL aliquots ולהקפיא ב -20 °C (5 °F). ביום הניתוח, להפשיר aliquot 4% ולהוסיף 35 מ"ל של DPBS כדי להשיג 40 מ"ל של 0.5% PFA.

  1. בידוד של EDL (שריר עווית מהיר)
    1. להרדים חולדה. מניחים את החיה עם הבטן פונה כלפי מעלה. לבצע חתך ראשוני באמצעות להב כירורגי בין בהונות לכיוון הגפה האחורית.
      הערה: במקרה זה, הזרקה תוך-גופית של 90:10 מ"ג/ק"ג קטמין:קסילאצין ניתנה כדי להרדים את החולדה, אך אפשרויות אחרות של הרדמה מותרות גם.
    2. לקלף את העור, מושך אותו כלפי מעלה עד הברך חולדה נחשף.
    3. כדי למצוא את EDL, בצע את גידים כף הרגל עד הרצועה הטבעתית. הרצועה הזו מקיפה שני גידים. חותכים את הרצועה בין שני הגידים עם מספריים חד-סרט (או דומה). זהה את גיד ה- EDL על ידי הרמת שניהם ובחר את זה שגורם לבהונות לנוע כלפי מעלה.
    4. חותכים את הגיד עם מספריים חד-סרט. לאחר מכן, בעודם מחזיקים את הגיד עם פינצטה ביולוגית משובחת, מתחילים להפריד לאט את שריר ה-EDL מההתחלה של טיביאליס, מהפרונוס ברוויס ופרונוס לונגו40 (ראו איור 1A).
      הערה: ודא שהשריר מופרד ללא כל נזק. לעשות זאת על ידי חיתוך שאר השרירים לרוחב כדי לפתוח נתיב ביניהם (EDL אין מיקום שטחי) תוך החזקה והרמה של שריר EDL.
    5. כדי לבודד לחלוטין את השריר, לחתוך את הגיד מחובר לברך החולדה עם מספריים חד-סרט.
    6. לטבול את השריר ניתח ב 5 מ"ל של 0.5% PFA ולהשאיר עבור 24 שעות ב 4 °C (5 °F). לחלופה, להדק את השריר בחתיכת קרטון ולהפוך אותו עם השריר פונה כלפי מטה. ואז לטבול אותו לחלוטין 8 מ"ל של הפתרון הקיבווני. שלב זה מסייע בשמירה על השריר מוארך במהלך תהליך הקיבעון.
  2. בידוד של סולאוס (שריר עווית איטי)
    1. הפוך את החיה (הבטן פונה כעת כלפי מטה). דרך העור, לחתוך את הגיד קלצנלי באמצעות להב כירורגי.
    2. בעזרת פינצטה ביולוגית ומספריים חד-סרט, להפריד את שריר gastrocnemius מן העצמות, יצירת "מכסה שרירים". הסוליה תהיה בצד הפנימי של המכסה השרירי. זה יכול להיות מזוהה כי זה אדום בצבע ויש לו מורפולוגיה שטוחה.
    3. עם זוג פינצטה ביולוגית, להגיע ולהרים את גיד הסולאוס שנמצא מעל gastrocnemius (ראה איור 1B).
    4. חותכים את הגיד עם מספריים חד-סרט. הרם את כל השריר תוך חיתוך חלק מנקודות החיבור החלשות (כלומר, אלמנטים נוירווסקולריים). לבסוף, כדי לשחרר לחלוטין את שריר הסוליה, לחתוך את fascicle הסוליה היוצרת את הגיד קלצנאלי עם מספריים חד סרט.
    5. חזור על שלב 1.1.6 כדי לתקן את שריר הסולאוס נותח.

2. הכנת סיבים מתגרה (יום 2)

  1. לאחר 24 שעות של קיבעון, לשטוף את השרירים עם 6 מ"ל של פתרון DPBS 3x במשך 10 דקות כל אחד לפני בידוד סיבי השריר.
  2. כדי לבודד את הסיבים, לשים שריר על שקופית מיקרוסקופ. באמצעות סטריאומיקוסקופ, בעדינות להחזיק את אחד הגידים עם זוג אחד של פינצטה ביולוגית. לאחר מכן, עם פינצטה ביולוגית אחרת, להתחיל לצבוט את הגיד לאט כדי להפריד את סיבי השריר. לאחר מכן למשוך לאט את הרקמה צבט כלפי מעלה לכיוון גיד השריר הנגדי. יהיה צורך לחזור על פעולה זו מספר פעמים עד לקבלת חבילות קטנות ומבודדות מרובות.
  3. מניחים אותם בזהירות על שקופית מטופלת מראש (סילאן). יש צורך לשמור את כל הסיבים כדי, כך שהם לא חופפים. בשלב זה, אוויר יבש הסיבים עבור 24 שעות.

3. אימונופלואורסצנטיות

  1. דגירה ראשונית של נוגדנים (יום 3)
    הערה: כל השלבים בוצעו בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. הדרך היעילה ביותר להסיר את הפתרונות השונים מבלי לנתק סיבים מהשקופית היא להשתמש במזרק אינסולין.
    1. כדי להתחיל את תהליך החיסונים, להקיף את סיבי השריר המבודדים המיובשים עם עט פאפ כדי ליצור מחסום עמיד למים.
    2. כדי לחות את סיבי השריר, להוסיף 200 μL של מים מזוקקים במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשנות את המים ל 200 μL של DPBS עבור הדגירה הבאה 5 דקות. בשלב זה, להתחיל את תיוג אימונופלואורסצנטיות.
    3. סיבים מדגרת עם 300 μL של מאגר חסימה (BB) המכיל 50 mM גליצין, 1% BSA, ו 1% טריטון X-100 במשך 30 דקות.
    4. החלף BB בנוגדן הראשי בריכוז המוצע על ידי היצרנים. השתמש BB לדלל את הנוגדן. ניסוי זה השתמש 400 μL של SMI 32 או SMI 31 שזיהה לא זרחן (Nf) או זרחן (Phos-Nf) נוירופילמנט H ב 1/800 דילול כדי לזהות את הרכיב presynaptic NMJ.
      הערה: כאשר מחליטים לזהות את כל האלמנט presynaptic במקום להעריך זרחן neurofilament, לבחור נוגדנים נגד סינפסין, סינפטופיסין או SV2a כי הועסקו בהצלחה בעבר.
    5. לדגור את הסיבים עם דילול הנוגדנים העיקרי ב 4 °C (4 °C) לילה (אופציונלי, דגירה יכולה להתבצע ב 37 °C (1 שעה). בשני המקרים, יהיה חשוב לבצע את הדגירה באמצעות תא לח.
  2. אימונופלואורסצנטיות: דגירה משנית של נוגדנים (יום 4)
    1. הסר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את הסיבים 3x במשך 10 דקות כל אחד עם 500 μL של DPBS ואת הפעם האחרונה עם BB.
    2. הסר את הכביסה האחרונה והוסף את הנוגדן המשני המסומן באופן פלואורסצנטי מדולל ב- BB. לניסוי זה, 500 μL של עז נגד עכבר אלכסה פלור 488 ב 1/1000 דילול ב BB שימש. כדי להציג את האלמנט postsynaptic של NMJs, 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) ביוטין-XX מצומד נוספה לדילול הנוגדנים המשני.
      הערה: התוספת של Btx-biotin XX מאפשרת תמונות אות לרעש טובות יותר לאחר שזוהו עם סטרפטווידין שמגביר את האות. בנוסף, הטיות סטרפטאבין לפלורופורים שונים הגדילו את שילובי הצבעים בבדיונים מתואמים. לחלופין, Btx עם תווית פלואורסצנטית מאפשר לקבל תמונות באיכות דומה.
    3. לדגור את הנוגדן המשני ואת Btx במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או 1 שעה ב 37 °C (50 °F) מוגן מפני אור.
    4. הסר את הנוגדן המשני ואת Btx. לשטוף 3x במשך 10 דקות כל אחד עם 500 μL של DPBS ואת השטיפה האחרונה עם BB.
    5. דגירה עם 500 μL של סטרפטאבידין אלכסה פלור 555 ב 1/1000 דילול עם BB עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. בשלב זה, אם תרצה, להוסיף בדיקה כדי להסיט את הגרעינים, כגון diaminophenylindole בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל.
    6. הסר את פתרון הדגירה לשטוף סיבים 3x במשך 10 דקות כל אחד עם 500 μL של DPBS. לאחר מכן, לעלות על הסיבים.
  3. הרכבה
    1. הנח 4 נקודות של לק שקוף על שקופית המיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע. תן להם להתייבש 1-2 דקות. אלה יהיו הנקודות שבהן כיסויי יתנו, עוזר למנוע ריסוק רקמות.
    2. הסר את שטיפת DPBS האחרונה ולהוסיף מספיק מדיה הרכבה (~ 200 μL) כדי לכסות את הסיבים; הימנע ייבוש.
      הערה: כדי להכין 10 מ"ל של תערובת המדיה הרכבה, להשתמש Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: גליסול ב 4:1 (v:v).
    3. השתמש 200 μL pipette קצה כדי להפיץ בזהירות את המדיה הרכבה על הסיבים כדי להבטיח טבילה מלאה של כולם. לפני הנחת זכוכית הכיסוי, להסיר בועות אוויר.
    4. מניחים את כיסוי על הדגימות מנסה למנוע את הדור של בועות אוויר. תנועה זו יכולה להיעשות בעזרת מלקחיים.

4. מיקרוסקופיה וניתוח מורפומטרי

  1. תמונה תכשירי סיבים מתגרה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.
  2. קח סדרה של מקטעים אופטיים (ערימות Z של 30 מיקרומטר) לאורך הסינפסה כולה באמצעות מרווח זמן של מיקרומטר אחד. כדי להגדיר את המחסנית, השתמש באות Btx. תמונה לפחות 15-20 NMJs עבור כל מצב שריר עם רזולוציה 2048 px x 2048 px. שיטה זו נבחרה כדי לקבל תמונות עם איכות אופטית מספיקה ורזולוציה לניתוח מורפומטרי.
  3. כדי לבצע את המדידות, השתמש בתמונות ההקרנה של ערימות עם כל תוכנת ניתוח.
    הערה: למרות הניתוח המורפומטרי הסביר נעשה באופן ידני, ישנם שני כלים מבוססי תמונה J שפותחו לאחרונה ללימוד היבטים רבים ושונים של מורפולוגיה NMJ pre ופוסט-סינפטי33,34.
  4. לקבלת ערכי אזור סה"כ NMJ, בחרו בגבול החיצוני (קו מתאר חיצוני של האזור המוכתם, ראו איור 2) של לוחית הקצה בעזרת הכלי לאסו מגנטי של Photoshop וקביעו את מספר הפיקסלים שנבחרו בחלון היסטוגרמה. לאחר מכן, ניתן להמיר את אזורי הפיקסלים למיקרומטרים מרובעים באמצעות קנה המידה שצוין על-ידי תוכנת הקונפוקלי.
  5. בעזרת אותו כלי לאסו, בחרו את הגבול הפנימי (קווי המתאר של האזור המוכתם בתוך לוחית הקצה, ראו איור 2)וקבעו את האזור הלא מוכתם בכל המבנה (או שטח ריק) כמפורט לעיל (שלב 4.4). ערכי האזור Postsynaptic יתקבלו לאחר הפחתה של השטח הכולל מהאזור הריק של כל NMJ.
  6. להשיג את האזור Presynaptic, המוגדר כאזור עם אימונופלואורסצנטיות אנטי נוירופילמנט, באופן דומה כי אזור NMJ הכולל.
    הערה: כל הפרמטרים הללו שימשו לקביעת מדד הצפיפות הפוסט-סינפטית (אזור פוסט-סינפטי/אזור כולל) ואת כיסוי NMJ (אזור פרסינפטי/אזור פוסט-סינפטי). מדד צפיפות פוסטינפטי גבוה יותר מרמז על לוחית קצה צפופה יותר - או קומפקטית יותר, ואילו כיסוי NMJ קטן יותר משקף אינטראקציה גרועה בהרבה בין מסוף עצבים לבין לוחית קצה (שניהם תואמים לתהליך denervation). במקרה המוצג כאן, מאז צורות זרחן ולא זרחן של neurofilaments זוהו ברמת מסוף העצב, זרחן / לא זרחן יחס אות presynaptic ואת יחס כיסוי זרחן / לא זרחן היו מחושבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מציע שיטה פשוטה לבודד ולחסן סיבי שריר משני סוגים שונים של שרירים (שרירים מהירים ואיטיים, ראו איור 1). באמצעות הסמנים הנכונים ו / או בדיקות, רכיבי NMJ ניתן לזהות ולהעריך מאז נקודת מבט כמותית כדי להעריך חלק מהשינויים המורפולוגיים שיכולים להתרחש כתוצאה מהתקדמות המחלה או טיפול תרופתי ספציפי. במחקר הנוכחי, רכיבים פרסינפטיים ופוסט-סינפטיים של NMJ תויגו באופן פלואורסצנטי באמצעות נוגדנים נגד Nf או אנטי-פוס-Nf ו- Btx בהתאמה(איור 2,לוחות עליונים). כל תמונה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של NMJ שהושגה לאחר השימוש בחיסון כדי לקבוע את המדידות והאינדקסים המורפומטריים שצוינו במקטע פרוטוקול (טבלה 1) החלת הפרמטרים המתוארים בחלוניות התחתונות של איור 2.

כדי להדגים שהכנת NMJ כולה שמרה בצורה מושלמת על ארכיטקטורת הסינפסה, ואפשרה הדמיה של ההשפעה שיש עליה מחלת מערכת עצבים מתקדמת, סיבים מתגרה של חולדות מהונדסות המבטאות את הגן האנושי SOD1G93A (מודל ALS) חוסלו באמצעות הפרוטוקול (איור 3). המיזוג תמונות של אותות טרום ופוסט-סינפטיים עם הגרעינים מוכתמים ב- DAPI הראה כי ההבדלים בין ה- NMJs בין בעלי חיים מהונדסים ולא מהונדסים תואמי גיל נראים בבירור ותואמים לתוצאות הצפויות מהספרות.

בנוסף, איכות התמונות אפשרה לכמת את השינויים שנצפו על ידי ביצוע הניתוח המורפומטרי. לדוגמה, איור 4 מראה ראיות לכך שהאות הפוסט-סינפטי בבעלי חיים מהונדסים נראה קומפקטי יותר (כ-20%), בעיקר בשל צמצום השטח הכולל של NMJ.

מאידך גיסא, איור 5 מראה כי גם האזור הטרזינפטי של ה-NMJs בבעלי חיים מהונדסים מצטמצם. האיכות של הכנה זו של כל ההר NMJ הוכח על ידי ניתוח היקף הנסיגה מסוף העצב ועל ידי גילוי שינויים לגבי מצבי זרחן neurofilament. עובדה זו תהיה חשובה כדי לקבל תובנה עמוקה עבור תהליך פירוק NMJ הקשור למחלת ALS במודל המועסק. האזור הטרוסינפטי הקטן ביותר שזוהה היה זה שכותרתו עם נוירופילמנט אנטי זרחן(איור 5B, E, C, F).

השימוש במדד הכיסוי(איור 6)איפשר לקבוע כי ה-NMJs הטרנסגניים הוקפאו חלקית. כמו כן, זה יכול לקבוע כי מדדי הכיסוי של neurofilament זרחן נמוכים יותר מזה המתקבל עם neurofilament שאינו זרחן. תוצאות אלה מראות את הנוגע למצב של NMJ הר שלם וכי זה יכול להיות שימושי כדי להציג את המחקר של נוירופילמנט מצב זרחן (דטרמיננטה חשובה של פלסטיות חוט ויציבות) באמצעות הכנה זו של כל הר NMJ.

לבסוף, שיטות המוצגות בעבודה זו מציעות את האיכות הגדולה ביותר של NMJ לזהות, להעריך ולהעריך אפילו שינויים עדינים ב- NMJ בכללותו או באחד ממרכיביו.

Figure 1
איור 1: ציוני דרך אנטומיים של EDL ו-Soleus. הדגשת תמונה (A) EDL ו - (B) מיקום סוליאוס בין השרירים האחרים של הגפה האחורית התחתונה של החולדה. Insets להראות תוכניות של שרירי הגפיים האחוריות קרוב EDL (אדום) וסולאוס (ירוק) שרירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צומת נוירו-שרירי שלם של סיבי שריר EDL. (A)רכיב פוסט-סינפטי של NMJ זוהה באמצעות אלפא-בנגרוטוקסין (Btx, מגנטה), בדיקה שנקשרת במיוחד לקולטני האצטילכולין (AChR). (B)מסוף מנוע זוהה באמצעות anti-neurofilaments (אנטי Nf, ירוק). (C,D) רכיבים סינפטיים מסוכמים על מנת להמחיש את הפרמטרים (גבולות חיצוניים ופנימיים) שהגדירו את המדידות (אזור כולל, אזור פרסינפטי ופוסטינפטי) המשמשות לניתוח המורפומטרי המפורט בפרוטוקול. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שינויים מוקדמים ופוסט-סינפטיים שנצפו ב-NMJs של מודל ALS. תמונות קונפוקליות מייצגות שהתקבלו מ- NMJs הר שלם שהושגו בהכנות מסיבי שריר EDL מוכתמים כדי לזהות neurofilaments (ירוק), AChR (מגנטה), וגרעין (כחול) מחולדות לא מהונדסות (-/-) או מהונדסות (hSOD1G93A/-). (A,C) לחולדות לא מהונדסות יש מורפולוגיה רגילה של NMJ (צורת בייגלה) הן כאשר הקצה המוטורי מדמיין באמצעות אנטי-פוס-Nf (A) או אנטי-Nf (C). (B,D) חולדות מהונדסות מציגות אזור פוסט-סינפטי קומפקטי יותר ומסופים פר-סינפטיים קטנים יותר עם ירידה באות הזרחן הנוירופילמנטי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

Figure 4
איור 4: הערכה מורפומטרית של היסוד הפוסט-סינפטי של NMJ בשרירי ה-EDL החל מ-180 ימים של חולדות hSOD1G93A זכריות. תמונות קונפוקליות מייצגות של רכיבים פוסט-סינפטיים ב- (A,D)בעלי חיים מהונדסים ו -B,E. הערכה של (C)אזור postsynaptic ו -( F) מדד צפיפות פוסטינפטית ב- NMJs של בעלי חיים לא מהונדסים (עמודות מוצקות) ו transgenic (עמודות מפוספסות). בעוד שהאזור הפוסט-סינפטי צומצם מעט בבעלי חיים מהונדסים, המדד הפוסט-סינפטי עלה בשיעור גדול יותר המדגיש את מידת דחיסת NMJ כפי שצוין על ידי שטח כולל מופחת בבעלי חיים מהונדסים כפי שמוצג בטבלה 1. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הנתונים המיוצגים הם ממוצעים ± SEM( *) ו- (***) שצוינו p<0.05 ו- p<0.001, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הערכה מורפומטרית של האלמנט הטרזינפטי של NMJ בשרירי ה-EDL מ-180 ימים של חולדות hSOD1G93A זכריות. בהתחשב בחשיבות של פירוק NMJ במחלת ALS, איכות ההכנה הוערכה על ידי ניתוח, לא רק את היקף הנסיגה מסוף העצב, אלא גם את האפשרות לזהות שינויים בזרחן של אלמנט presynaptic NMJ. תמונות קונפוקליות מייצגות של הרכיב presynaptic ב (A,D)חיות מהונדסות ו -B,E)מהונדסות זוהו באמצעות (A,B)אנטי Phos-Nf או (D,E)נוגדנים נגד Nf. הערכה של אזור פרסינפטי מופרד על ידי (C) זרחן ו -( F) neurofilaments שאינם זרחניים ב- NMJs של בעלי חיים לא מהונדסים (עמודים מוצקים) ו transgenic (עמודים מפוספסים). שים לב כי אזורים אלה דומים מאוד בבעלי חיים שאינם מהונדסים ואילו הם מציגים ירידה משמעותית NMJs של בעלי חיים מהונדסים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הנתונים המיוצגים הם ממוצעים ± SEM( ****) שצוין p<0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הערכת מצב הפנימיות ב-NMJs של סיבי EDL hSOD1G93A. מדד הכיסוי נמצא בשימוש נרחב להערכת מצב הפנימיות. זה נחשב כי NMJs "פנימי לחלוטין" להציג מדד כיסוי Equation 1 50%, בעוד אלה "פנימי חלקית" יש כיסויים בין ≥20% ו -≤50% ואלה פנויים נחשבים "denervated". תמונות קונפוקליות מייצגות של NMJs לא מהונדסים(A,D)ולא מהונדסים (B,E) המציגים אלמנטים פרסינפטיים ופוסטינפטיים שזוהו באמצעות נוגדני אנטי-פוס-Nf(A,B)או (D,E)אנטי-Nf כדי לצפות במסוף המנוע. הערכת הכיסוי באמצעות (C) זרחן ו -( F) neurofilaments שאינם זרחניים ב- NMJs של בעלי חיים לא מהונדסים (עמודות מוצקות) ובעלי חיים מהונדסים (טורים מפוספסים). התמונות והגרפיקה מראות ראיות לכך ש- NMJs מבעלי חיים מהונדסים מציגים מדד כיסוי נמוך יותר מאשר אלה שאינם מהונדסים. בנוסף, בבעלי חיים מהונדסים, מדדי הכיסוי של נוירופילמנטים זרחניים נמוכים Equation 1 יותר (18%) מזה המתקבל כאשר זוהתה הצורה הלא Equation 1 זרחתית (25%). עובדה זו מאומתת עם הקשר בין שני האינדקסים כפי שמוצג בטבלה 1. יש לציין כי איכות ההכנות מאפשרת קבלת Equation 1 50% ממדד הכיסוי שנקבע עבור ה-NMJs הצפויים כ"פנימיים לחלוטין". סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הנתונים המיוצגים הם ממוצעים ± SEM ( ***) ו- (****) המצוינים p<0.001 ו- p<0.0001, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. פרמטרים ויחסים מורפומטריים המתקבלים מ- NMJs של הר שלם של סיבי EDL לא מהונדסים ומהנדסים. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח של שני שרירי השלד חולדה (אחד עווית איטית והשני עווית מהירה), בידוד שריר סיבים וזיהוי immunofluorescence של סמנים טרום ופוסט-סינפטי כדי להעריך באופן כמותי שינויים NMJ, כמו גם תהליכי הרכבה / פירוק. סוג זה של פרוטוקול יכול להיות שימושי במודלים מכרסמים41,42 כדי להעריך NMJ במהלך תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים כפי שמודגם כאן במודל של ניוון נוירון מוטורי כגון נמצא בחולדות ALS hSOD1G93A.

כדי להשיג הצלחה ותוצאות מועילות, יש צורך לזכור כמה טיפים. לדוגמה, הפרוטוקול המתואר מאפשר שימוש מיידי בשרירים ניתחו. עם זאת, בעת הצורך כדי לשמר את השריר זמן רב יותר את השימוש DPBS עם 0.05% נתרן אזיד בתוספת 4 °C אחסון מאפשר הארכת שימור שרירים מעולה עד 4 שבועות. בעת שימוש באפשרות זו, יש לבצע שטיפות נרחבות עם DPBS (5x, 10 דקות כל אחת) לפני תחילת תהליך ההכתמות. אפשרות מועילה נוספת להשגת תמונות באיכות טובה כוללת הורדת ריכוז ה- PFA ב -0.5% מכיוון שהיא הפחיתה את האוטופלואורסצנטיות של השריר. זה חייב להיות מלווה קיבעון ארוך יותר עד 24 שעות ב 4 °C (50 °F).

לגבי בידוד סיבים, קבוצות קטנות יותר של סיבים לייצר תכונות חיסוניות טובות יותר. הסיבים המיובשים על שקופיות סילאניות חייבים לשמש תוך 2 עד 3 ימים. לאחר זמן זה, החיסונים אינם באיכות טובה.

חלופה אחת לסיבים יבשים על שקופיות סילאניות היא ליצור קבוצה של סיבים מבודדים חלקית המוחזקים יחד על ידי רקמת הגיד באחד הסיבים בקצה ("tuft" של סיבי שריר) ולבצע דגירות בצינורות microcentrifuge בשיטת "צף חופשי". שימוש באפשרות זו יש צורך להגדיל את זמני הדגירה נוגדנים על ידי מספר שעות (24-48 שעות) כמו גם את מספר שטיפות (לפחות 6 מתוך 10 דקות כל אחד).

ביחס לבידוד סיבים ללא נזק, יש צורך לבצע את "להקניט" על ידי הסרת הקצוות שבהם הגיד מושך בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי להשיג הפרדת סיבים.

צעד קריטי נוסף לשיפור החיסון הוא תוספת של 1% טריטון X-100 ו 50 mM גליצין ב BB. זה חשוב להשיג הכנות שיש להם כתמים הומוגניים וקצת רקע. ראוי גם להזכיר כי בעל קצת רקע יכול להיות מועיל כאשר סיבים לא נגועים צריך להיות תדמית. קוטר הסיבים טוב להימדד הרחק משדה NMJ שכן הוא מתואר כי זה עשוי להיות מוגבר ברמה זו. לכן, לקבוע את קוטר הסיבים במרחק שווה לערך של פרופיל NMJ.

באמצעות ההליך שהוצג ניתן לזהות ולהוות רכיבי NMJ בתנאים פיזיולוגיים. זה גם מאפשר ללמוד אירועים פתולוגיים מפתח מוקדם כמו פירוק NMJ24 ואובדן נוירופילמנט זרחן בסוף סופני39 כמתואר ALS פתוגנזה. מסיבה זו, הפרוטוקול המתואר מציע גישה חלופית ופשוטה כדי לעזור לקבל הבנה טובה יותר של שיפוץ NMJ, מציע כי תכונות מורפולוגיות חזותיות יכול להיות כלים שימושיים כדי לאבחן מצב מתנוון של NMJs או להעריך גישות טיפוליות שונות. זה חל גם על מודלים אחרים של מחלות כגון אלה של Charcot-Marie-Tooth41 ניוון שרירי עמוד השדרה42 המציגים הפרעה NMJ.

בנוסף, גישות המתוארות בעבודה זו ניתן להשתמש כדי לזהות את התאים Schwann המשלבים סינפסה משולשת זו ובסופו של דבר כדי להעריך חלק מתפקידיה במהלך שיפוץ NMJ43. מחקרים יכולים להיעשות ביילודים עד מבוגרים, בתנאים פיזיולוגיים או כתגובה לטיפולים שונים המשפיעים על המערכת הנוירו-שרירית.

לבסוף, למרות הטיפול המצוין הדרוש כדי לנתח ולתייג דגימות יחד עם הזמן הנצרך כדי לבצע מדידות ידניות, המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת תיוג אופטימלי של רכיבי NMJ שונים בגלל חדירה קלה של נוגדנים וגשושיות. למרות חדירה טובה יותר ניתן להשיג בתכשירי שרירים חלקיים, מתגרה משמר את השלמות המורפולוגית 3D של כל הרכיבים הסינפטיים שניתן לאבד בחלקי שרירים. זה גם נמנע מכל ההכנה הדרושה כדי להפוך חלקים כגון הכללת חתיכת השריר ואחזור אנטיגן נוסף כדי לקבל הכרה אפשרית. יתר על כן, בהשוואה לתכשירי הר שלמים המשמרים את דפוסי הפנימיות המלאים, הקניט מאפשר חקר סיבים מבודדים. זה יכול להיות יתרון משמעותי בעת הצורך כדי להעריך את הטרוגניות סיבים שדווחו בתנאים פתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

תודה רבה ל- CSIC ול- PEDECIBA על התמיכה הכספית שניתנה לעבודה זו; לנטליה רוזאנו על תיקוני כתב היד שלה; למרסלו קזקוברטה שעושה את הסרטון ולניקולאס בולאטו על כך שהעניק את קולו עבורו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope with cool light illumination Nikon SMZ-10A
Rocking platform Biometra (WT 16) 042-500
Cover glasses (24 x 32 mm) Deltalab D102432
Premium (Plus) microscope slides PORLAB PC-201-16
Tweezers F.S.T 11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm E.M.S 77910-26
Disponsable surgical blades #10 Sakira Medical 1567
Disponsable sterile syringe (1 ml) Sakira Medical 1569
Super PAP pen E.M.S 71310
100 μl or 200 μl pipette Finnpipette 9400130
Confocal microscope Zeiss LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats Taconic 2148-M
1X PBS (Dulbecco) Gibco 21600-010
Paraformaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Amresco 167
BSA Bio Basic INC. 9048-46-8
Glycerol Mallinckrodt 5092
Tris Amresco 497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody BioLegend 801601 Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody BioLegend 801701 Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) Thermo Scientific A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate Invitrogen B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen S32355
Diaminophenylindole (DAPI) Sigma D8417

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
  3. Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
  4. Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
  5. Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
  6. Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
  7. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
  8. Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
  9. Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
  10. Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
  11. Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
  12. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
  13. Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
  14. Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
  15. Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
  16. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
  17. Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
  18. Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
  19. Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
  20. Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
  21. Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
  22. Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
  23. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
  24. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
  25. Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
  26. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  27. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  28. Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
  29. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
  30. Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
  31. Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
  32. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
  33. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
  34. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
  35. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
  36. Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
  37. Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
  38. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
  39. Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
  40. Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
  41. Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
  42. Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
  43. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 174 צומת עצבי-שרירי סיבי שריר השלד סיבים מתגרה סולאוס מסלן דיגטורום לוגוס ניתוח אימונופלואורסצנטיות הר שלם ניתוח מורפומטרי
ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolatto, C., Olivera-Bravo, S.,… More

Bolatto, C., Olivera-Bravo, S., Cerri, S. Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (174), e62620, doi:10.3791/62620 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter