Summary
성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.
Abstract
Tgfß/Nodal 또는 뼈 형태유전학 단백질(Bmp) 리간드로 표현되는 변형 성장 인자 ß(Tgfß) 슈퍼 패밀리의 두 팔은 배아 발달과 성인 항상성에서 필수적인 역할을 합니다. Tgfß 가족의 구성원은 내시경 망상 내에서 이산화 하고 접는 비활성 전구체로 만들어집니다. 전구체는 이어서 리간드 및 프로도메인 조각으로 갈라진다. 비록 디메라 리간드만 Tgfß 수용체를 참여시키고 다운스트림 신호링을 활성화할 수 있지만, 프로도메인 모이티가 리간드 활동에 기여한다는 인식이 증가하고 있습니다. 이 문서에서는 Tgfß 전구체 단백질의 활성화 중에 생성된 분열 제품을 식별하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. Tgfß 전구체를 코딩하는 RNA는 X. laevis 배아로 처음으로 마이크로 주입됩니다. 다음 날, 분열 제품은 가스트룰라 단계 배아의 blastocoele에서 수집되고 서양 얼룩에서 분석됩니다. 이 프로토콜은 비교적 빨리 완료 될 수 있으며 고가의 시약을 필요로하지 않으며 생리적 조건하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공합니다.
Introduction
변형 성장 인자 ß (Tgfß) 슈퍼 패밀리의 구성원은 비활성, 이질 전구체 단백질로 합성된다. 전구체는 그 때 분비 통로 내 또는 세포의 외부proprotein 변환기 (PC) 가족의 일원에 의해 갈라지는 것입니다. 이렇게 하면 활성 이황화물 결합 리간드 디머와 두 개의 프로도메인 조각1이생성됩니다. 30년 이상 알려져 왔지만 Tgfß 가족 전구체의 프로도메인이 활성 리간드2를생성하는 데 필요하며, 프로도메인이 리간드 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해는 불완전합니다.
Tgfß 가족 구성원의 프로테오리틱 활성화 과정에 대한 이해는 불완전하지만, 특정 세포 외 또는 세포 외 구획에서분열이 발생하는지 여부, 그리고 프로 도메인이 크리브 리간드3와공유 또는 비일관성으로 연관되어 있는지 여부에 대한 이해에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여러 연구는 프로 도메인이 분열4,5전에 리간드 접이식을 안내 할뿐만 아니라, 또한 성장 인자 안정성과 작용의 범위에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다6,7,8,9,호모이머 또는 이성애자의 형성을 구동10,리간드 대기 시간을 유지하기 위해 세포 외 매트릭스에 리간드 를 고정11,어떤 경우에는, 자신의 오른쪽에 리그간드로 역할을 신호12. Tgfß 가족의 많은 구성원의 프로 도메인 내에서 이종점 돌연변이는 눈, 뼈, 신장, 골격 또는인간3의다른 결함과 관련이 있다. 이 사실 인정은 활성 리간드를 생성하고 유지하는 데 있어 프로도메인의 중요한 역할을 강조하고 Tgfß 가족 전구체의 프로테오리틱 성숙 중에 개발 된 분열 제품의 역할을 식별하고 해독하는 것의 중요성을 강조합니다.
여기에서 우리는 X. laevis 배아의 blastocoele에서 Tgfß 가족 선구자의 성숙 도중 생성된 분열 제품을 심는 다음 면역 blot에 그(것)들을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 전구체 단백질에서 하나 이상의 PC 컨센서스 모티프가 생체10,13에서갈라졌는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 각 모티프(13)를 갈라지는 내인성 PC(들)를 식별할 수있다.,14,Tgfß 가족 homodimers의 생체 형성에서 이성애자(10)를 비교하거나 Tgfß 전구체에서 인간 질병 관련 포인트 돌연변이가 기능성 디메릭 리간드를 형성하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 분석한다.
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Protocol
설명된 모든 절차는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받습니다. 개구리는 IACUC 승인 시설에 보관됩니다. 수컷 개구리는 심장의 심실을 클리핑하여 트리카인에 침수하여 안락사됩니다. 암컷 개구리는 달걀 수집을 허용하기 위해 산란의 호르몬 유도다음 최대 24 시간 동안 실험실에 보관된 다음 치료 시설로 돌아갑니다.
1. X. laevis 고의 컬렉션
- 동물이 발톱 핀치에 반응하지 않을 때까지 30-40 분 동안 0.2 % 트리카인(표 1)에서성적으로 성숙한 남성을 마취합니다.
- 무딘 집게를 사용하여 피부가 바디 월에서 멀리 당겨. 수술 가위를 사용하여 하복부를 가로 질러 피부에 수평 절개를합니다. 기본 바디 월에서 평행 절개를 한 다음, 흉곽을 통해 바디 벽을 통해 세 번째 수직 절개를 합니다.
- 결과 플랩을 다시 접어 심장의 심실을 찾아 서 발굴 하 고 죽음을 보장 하기 위해 기지를 잘라.
- 무딘 집게로 복부에서 노란 지방 시체를 당기고 각 면의 고환을 찾아 지방 몸의 기본을 찾습니다. 각 고환을 제거 하 여 지방 몸 과 수술 가위를 사용 하 여 부착 된 내장에서 멀리 클리핑 하 여.
- 1x 수정 된 바스 솔루션 (MBS)(표1)이들어있는 페트리 접시로 고환을 옮기습니다. 헹도 부린 혈관 또는 부착 된 내장을 제거하십시오.
- 1개의 고환을 함유한 35mm 페트리 접시에 즉시 사용하여 다른 한 쪽을 고환 버퍼로 채워진 10mL 원뿔튜브에 저장하여 나중에 사용할 수 있도록 한다. 고환은 사용하지 않을 때 4 °C에 저장되어야하며 적어도 2 주 동안 실행 가능한 상태로 유지됩니다.
참고: 고환 격리 사진은 참조 15에서 찾을 수 있습니다.
- 1개의 고환을 함유한 35mm 페트리 접시에 즉시 사용하여 다른 한 쪽을 고환 버퍼로 채워진 10mL 원뿔튜브에 저장하여 나중에 사용할 수 있도록 한다. 고환은 사용하지 않을 때 4 °C에 저장되어야하며 적어도 2 주 동안 실행 가능한 상태로 유지됩니다.
2. X. 래비스 계란의 수집 및 수정
참고 : 개구리는 개구리를 처리하기 전과 후에 씻어 비닐 장갑이나 손으로 처리해야합니다. 라텍스 장갑, 로션 및 인간의 손에 세제 잔류물은 개구리의 깨지기 쉬운 피부를 손상시킬 것입니다.
- 산란 전날 저녁, 인간 융골 생식선(표1)의0.3mL(1200 IU)을 2~3개의 성숙한 X. 라예비스 암컷에 26G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용한다. 각 주사에 새 바늘을 사용하십시오.
- 주입 후, 18°C 생물학적 인큐베이터에 여성을 밀봉 용기(밀폐가 아닌)에 놓습니다. 산란은 일반적으로 14-16 시간 후에 시작됩니다.
참고: 뚜껑에 구멍이 뚫려 있는 플라스틱 서랍이나 플라스틱 용기는 하룻밤 사이에 암컷을 잡는 데 적합합니다. 개구리가 인큐베이터에서 탈출하고 건조되는 것을 방지하기 위해 뚜껑이 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. - 1x MBS가 들어있는 100mm 페트리 접시 위에 암컷을 잡고 개구리의 복부에 부드러운 압력을 가하여 계란을 접시에 추방합니다.
- 면도날을 사용하여 작은 고환(~1/5)을 자르고 1x MBS의 ~500 μL을 포함하는 1.5mL 튜브로 옮킨다. 펠릿 페젤 또는 조직 균질화제로 분쇄하십시오. 같은 날에 후속 수정을 위해 얼음 또는 4 °C에 생성 된 정자 현탁액을 저장합니다.
- 100mm 페트리 접시를 기울여 1x MBS를 가능한 한 많이 붓고 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 나머지를 제거합니다. 정자 현탁액의 약 100 μL을 적용, 0.1 x MBS의 약 1 mL을 추가하고 혼합 소용돌이.
- 5분 후, 탈염수수 또는 0.1x MBS로 접시를 가득 채우고 30분 동안 방치하십시오.
참고: 물은 필터 또는 시립 수돗물을 사용하여 탈염될 수 있어 종래의 염소가 물에 첨가되는 지역에서 염소가 소멸될 수 있도록 적어도 24시간 동안 방치될 수 있다. 식수를 소독하기 위해 클로라민을 첨가하는 지역에서는 물을 대신 클로라민을 분해할 수 있는 시판되는 컨디셔너로 처리해야 합니다.
참고: 계란은 고염 용액(1x MBS)으로 수집되어 젤리 코트의 형성을 방지하여 수정에 대한 장벽을 제공합니다. 수정 후, 낮은 염액 (탈염 된 물 또는 0.1 x MBS)는 젤리 코트 형성을 허용하고 계란은 서로 와 접시를 부착합니다. 수정된 계란은 색소화된 동물 극이 30분 이내에 위쪽으로 향할 수 있도록 회전합니다. 이것이 일어나지 않고 계란이 현미경의 밑에 건강해 보이는 경우에, 정액 생존은 의심되고 새로운 고환을 수확하는 것이 필요할 지도 모릅니다.
- 5분 후, 탈염수수 또는 0.1x MBS로 접시를 가득 채우고 30분 동안 방치하십시오.
- 계란을 덮는 용액을 붓고 페트리 접시를 신선하게 준비한 2% 시스테인 용액(표1)으로채웁니다. 젤리 코트가 녹아 계란이 더 이상 서로 또는 접시에 집착하지 않도록 3-5 분 동안 접시에 용액을 소용돌이.
- 접시를 기울이고 시스테인 용액을 조심스럽게 부어 넣거나 플라스틱 파이펫으로 제거하십시오. 1x DeBoer의 연못수(표 1)로교체하십시오. 헹도 헹기 위해 소용돌이치십시오.
- DeBoer의 용액으로 한 번 씻기, 하나는 0.1x MBS로 반복하고 0.1x MBS로 접시를 다시 채웁니다. 젤리 코트를 제거 한 후, 계란은 더 깨지기 쉬워지고 공기 액체 인터페이스에 노출되어서는 안됩니다.
- 수정란을 16°C 의 생물학적 인큐베이터로 이동하거나 실온에서 벤치에 둡니다. 실온에서 방치하면, 첫 번째 골짜기는 수정 후 1-1.5h가 발생하고, 후속 분열은 약 30분마다 발생합니다. 대조적으로, 배아가 15-16°C에서 배양되는 경우에, 분열은 대략 매시간 생깁니다 및 주어진 산란에서 태아의 더 많은 수를 주입하는 것이 가능할 것입니다.
3. X. laevis 배아의 미세 주입
- 다음 설정이 있는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관을 미세 한 지점으로 가열하고 당깁니다: 2단계 당김; 열 1: 67.4°C; 열 2 : 62 ° C.
참고: 이러한 설정은 여기에 사용되는 마이크로 파이펫 풀러 및 유리 모세 혈관(재료의 표)에특정합니다. - 해부 현미경에서, Dumont #5 집게를 사용하여 끝에 가까운 당겨진 바늘의 끝을 잘라. 바늘은 날카롭지만 너무 얇아서 배아에 닿을 때 팁이 구부러지지 않아야합니다. 도 1은 미세 주입(A)과 잘린 바늘(B)을 위해 잘린 적이 없는 적절하게 당겨진 바늘의 예를 나타낸다.
- 마이크로인젝터에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. 바늘 홀더를 미세 조작기에 부착합니다. Tgfß 전구체 단백질을 인코딩하는 캡된 합성 RNA의 2-4 μL을 해부 현미경하에서 파라필름의 작은 조각에서 분석한다.
- 미세 조작기를 사용하여 바늘을 드롭으로 낮추고 마이크로 인젝터의 충진 기능을 사용하여 RNA를 바늘로 흡인시합니다. 바늘을 낙하의 표면 아래에 유지하고 현미경으로 진행 상황을 지켜야바늘에 공기를 심는 것을 피하십시오.
참고: 분석될 Tgfß 전구체의 프로도메인 및/또는 리간드 도메인을 인식하는 항체가 제공되지 않는 경우, 에피토프 태그(예를 들어, V5, myc, Flag)를 인코딩하는 서열은 RNA 전사를 위한 템플릿으로 사용될 cDNA에 프레임 내 삽입될 수 있다. 태그된 단백질의 생체 내 생체 활성은 에피토프가 적절한 접이식, 분열 또는 활동을 방해하지 않도록 태그가 없는 단백질과 비교되어야 합니다.
- 미세 조작기를 사용하여 바늘을 드롭으로 낮추고 마이크로 인젝터의 충진 기능을 사용하여 RNA를 바늘로 흡인시합니다. 바늘을 낙하의 표면 아래에 유지하고 현미경으로 진행 상황을 지켜야바늘에 공기를 심는 것을 피하십시오.
- RNA 용액의 방울을 공기 중으로 배출하고 주입 단계 또는 현미경의 안구에 장착된 마이크로미터를 사용하여 낙하 크기를 측정합니다. 낙하 크기를 마이크로인젝터의 시간 및 압력 제어를 활용하여 약 10nL로 조정합니다.
참고: 5-20 ng/μL 범위의 RNA 농도는 각 배아에 RNA의 50-200 pg를 전달하기에 적합합니다. RNA의 이 양은 일반적으로 10-20 배아에서 흡인에서 분열 제품을 검출하기에 충분합니다. 면역 blot에 검출 가능한 신호를 주는 RNA의 가장 낮은 복용량을 목표로 하는 것이 가장 좋습니다. 더 많은 양의 RNA가 배반의 팽창을 방해하는 위화 결함을 일으킬 수 있습니다. - 배아를 2-4 세포 단계에 도달하면 0.1x MBS(표1)에서5% Ficoll을 포함하는 주사 접시 또는 트레이로 이동합니다. 하단에 나일론 메쉬 가 장착된 35mm 페트리 디쉬는 배아를 고정상태로 유지하는 저렴한 분사 접시역할을 할 수 있습니다. 동물 극 근처에 바늘을 삽입하고 각 배아의 한 세포에 RNA의 10 nL을 주입.
참고: 배아는 16개의 세포 단계 사이 언제든지 쉽게 주입될 수 있습니다. 갈라진 후에 태아를 주입하면 계란이 수정되고 태아가 건강하다는 것을 보장합니다. 주사의 정확한 위치는 필수적이지 않습니다. X. laevis 배아로 의 산란, 배양 및 미세 주입에 대한 자세한 설명은 참조 15에서 찾을 수 있습니다. - 주입된 배아를 0.1x MBS(표1)에서5% 피콜로 채워진 35mm 페트리 접시로 옮킨다. 작은 요리를 150mm 페트리 접시 안에 놓고 뚜껑으로 느슨하게 덮어 문화 매체가 증발하는 것을 방지합니다. 배아를 15-16°C에서 하룻밤 사이에 배양한다.
참고: Ficoll에서 배아를 배양하면 주사 부위를 치유하는 데 도움이 됩니다. 미세 바늘을 사용하는 경우, 2-3 % Ficoll에서 배양하는 것은 충분하다, 반면 5 % 피콜은 명백한 손상이 관찰되는 경우 바람직하다. 주사 후 1-2 h를 위한 Ficoll 용액에 배아를 유지하는 것은 치유를 돕기에 충분하지만, 하룻밤 잠복은 가스삽입이 시작되기 전에 용액이 변경되는 한 배아를 손상시키지 않습니다.
4. Tgfß 분열 제품의 Blastocoele 추출 및 분석
- 주사 후 다음 날 아침, Ficoll 용액을 제거하고 죽거나 죽어가는 배아를 제거하십시오. 0.1x MBS로 배아를 한두 번 헹구고 실온에서 벤치에 0.1x MBS로 배아를 배양한다.
참고: 배아는 또한 발달을 늦추기 위하여 16°C 생물학 인큐베이터로 반환될 수 있습니다. - 다음 설정이 있는 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세혈관을 미세 한 지점으로 가열하고 당깁니다: 두 단계 당김; 열 1: 67.4°C; 열 2 : 62 ° C.
참고: 이러한 설정은 여기에 사용되는 풀러 및 유리모세관(재료 표)에따라 다릅니다. - 해부 현미경에서, 집게를 사용하여 당겨진 바늘의 끝을 잘라. 막힘을 방지하기 위해, 발아 포부를 위해 사용되는 바늘의 개구부는 미세 주입에 사용되는 바늘보다 커야합니다. 발아포포에 사용되는 양호한 바늘과 잘린 바늘의 예가 도 1C에도시된다. 마이크로인젝터에 연결된 바늘 홀더에 포부를 삽입하고 바늘 홀더를 미세 조작기에 부착합니다.
참고: 최적의 바늘 직경은 시행착오에 의해 경험적으로 결정됩니다. 직경이 큰 바늘은 너무 빨리 채우고 세포 파편이 바늘에 들어갈 가능성이 더 높습니다. 대조적으로, 아주 작은 직경 바늘은 막히기 위하여 확률이 높습니다. 적절한 바늘이 생성되면 동일한 위치에서 잘린 여러 바늘을 생성하는 것이 유용합니다. - 배아를 0.1x MBS로 채워진 접시에 놓으면 초기단계부터 중간 가스트룰라 단계(10-11단계)에 도달합니다.
- 동물 극 근처 배아의 표면 아래에 바늘을 삽입합니다. 해부 현미경을 보면서 마이크로 인젝터의 채우기 버튼을 눌러 바늘과 배아를 주시하십시오. 몇 초 동안, 맑은 액체의 수준은 바늘에 상승하고 태아가 붕괴되고 오목하게 될 것입니다.
- 흐린 백색 물질이 바늘에 들어가면 채우기 버튼을 놓고 주입 버튼을 한 번 이상 펄스하여 프로테아제가 포함 될 가능성이있는 세포 파편으로 구성된 흐린 물질을 배출하십시오.
참고: 배반구가 무너지고 셀 파편이 채우기 버튼을 누르자마자 바늘에 들어가면 바늘의 개구부가 너무 크다는 것을 나타냅니다. 배합이 무너지지 않지만 백색 물질이 즉시 바늘에 들어가면 바늘이 너무 깊게 삽입되어 배반장 바닥에 닿는 것을 보여줍니다. 백색 물질을 배출하고 다음 배아로 이동합니다. 포부 속도는 계속 누르기보다는 채우기 버튼을 펄스하여 보다 신중하게 제어할 수 있습니다. 이것은 바늘에 있는 개구부가 최적 보다는 더 큰 경우에 특히 중요합니다.
- 흐린 백색 물질이 바늘에 들어가면 채우기 버튼을 놓고 주입 버튼을 한 번 이상 펄스하여 프로테아제가 포함 될 가능성이있는 세포 파편으로 구성된 흐린 물질을 배출하십시오.
- 10-20 배아의 배아로부터 유체가 흡입될 때까지 4.5단계를 반복하십시오.
참고: 일반적으로 10-20개의 배아로부터 흡실된 배아의 배아를 흡면한 배아는 면역블롯에서 분열 제품을 감지하기에 충분합니다. 그러나, 이것은 항체 질에 따라 변화할 수 있고 경험적으로 결정되어야 합니다. - 사출 트레이에 파라핀 조각을 놓고 뉴클레아제가 없는 물의 피펫 1 μL을 위에 놓습니다. 물 방울 아래에 바늘을 잠그고 주입 버튼을 눌러 배합 유체를 물에 방출합니다.
- 대안적으로, 파라필름에 직접 유체를 배출하지만,이 경우, 그것을 누르기보다는 주입 버튼을 펄스. 이것은 낮은 압력하에서 유체를 추방하여 파라필름에서 평평해지는 것을 방지하여 파이펫을 그리기가 어렵습니다.
- 파발액을 얼음 위에 멸균 된 미세 심심 분리튜브로 옮기습니다. 배아당 약 0.3-0.5 μL의 배아를 수확할 것으로 예상됩니다. 핵이 없는 물을 추가하여 최종 부피를 30 μL로 조정합니다.
- 배아를 얼음에 별도의 튜브로 배아 유체 고갈 배아를 전송합니다. 초과 0.1x MBS를 제거하고 냉각 (4 °C) 배아 리세이트 버퍼 (배아 당 10 μL)의 200 μL을 추가합니다(표 1). 배아는 완전히 균질화되고 덩어리가 남아있을 때까지 마이크로 파이프를 사용하여 10-20 번 배아를 위아래로 피펫합니다.
- 10분 동안 10,000 x g에서 냉장 된 미세 원심 분리기에서 균질화 된 배아를 원심 분리합니다. P200 파이펫을 사용하여 160 μL의 체퍼를 제거하고 얼음에 새로운 튜브로 이송하여 튜브의 하단에 있는 백색 노른자 단백질 및 기타 세포 이물질을 피하십시오.
- 마이크로원심분리를 한 번 반복하고 투명한 상류체의 128 μL을 얼음의 새로운 튜브로 옮긴다. 이 시점에서, 클리어된 배아 용액및 배반액은 원하는 만큼 -80°C에 보관될 수 있다.
참고: 몇 가지 예외를 제외하고, Tgfß 전구체 단백질은 배반구체로 분비되지 않으며 고갈된 배아 용해물에서만 검출됩니다. 대조적으로, Tgfß 가족 분열 제품은 주로 blastocoele 액체에서 볼 수 있습니다. 대부분의 목적을 위해 배아 용액과 배아 용액을 모두 수확하고 분석하는 것이 도움이됩니다. 최소한 전구체가 견고하게 변환되고 안정적으로 변환되었는지 확인하는 긍정적인 컨트롤을 제공합니다. 또한, 분열 제품의 상대적 비율을 상이한 야생형 또는 돌연변이 단백질 중 전구체에 비교할 수 있으며, 전구체가 배아유체로 분비될 수 있도록 하는 돌연변이(예를 들어, 분열 없이 적절한 접이식 및 분비를 허용하는 PC 컨센서스 모티프 내의 돌연변이) 또는 배아와 아폭소 유체 모두에서 손상되지 않은 전구체가 검출됩니다. 비-클릴 단백질(이 경우 전구체가 배아 용액에서 검출되지만, 분열 제품은 배아 액액에 존재하지 않습니다).
- 마이크로원심분리를 한 번 반복하고 투명한 상류체의 128 μL을 얼음의 새로운 튜브로 옮긴다. 이 시점에서, 클리어된 배아 용액및 배반액은 원하는 만큼 -80°C에 보관될 수 있다.
- 이 시점에서 PNGase F와 블라스트로코엘액에 존재하는 탈리코클레트 단백질은 제조업체의 지시에 따라.
참고 이러한 내구 망상 (ER)을 나타내기 때문에 배아 용액에 존재하는 전구체 단백질을 deglycosylate 할 필요가 없습니다 -PNGase F에 의해 제거 복잡한 N 연결 올리고당이 부족한 전구체의 상주 형태. 대조적으로, 블라스트코엘 액에 존재하는 분열 제품은 탄수화물이 더 변형되고 PNGase F에 의해 제거될 수 있는 트랜스 골기 네트워크(TGN)를 통해 이동했습니다. 데글리코실화에 이어, 분열 제품은 SDS 젤에 보다 단단히 응축된 밴드로 마이그레이션하여 분열 제품을 시각화, 양화 및 정확하게 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 엄격히 요구되지 않습니다, 그러나 당신이 이동 패턴에 따라 호모이너와 이종성중자를 구별하려고하거나 분열 제품에 광범위한 퍼지 밴드로 마이그레이션하는 원인이 이질성 탄수화물을 포함하는 경우, 예를 들어, 도움이 될 수 있습니다. - 4x 시료버퍼(표 1)를15μL에 줄이고, 해정된 배아 용액의 15μL을 5μL을 추가합니다. 비감소 4x 샘플버퍼(표 1)의5μL을 나머지 15μL의 blastocoele 유체에 추가합니다. 5 분 동안 100 °C로 가열하고 얼음에 놓습니다.
참고: 비감소 조건 하에서 단백질을 분석하는 것은 갈라진 균질성 또는 이성구리간의 형성을 분석하는 데 필수적이지만 분열 부위 또는 절단 된 단백질 의 수준을 분석하는 경우에만 필요하지 않습니다. 몇 가지 예외를 제외하고 프로도메인 조각은 단조로 분비됩니다. 더욱이, 배아 lysate에 존재하는 전구체 단백질은 주로 전개되고, ER 상주 단량체. 따라서, 비 감소 조건에서 이러한 제품을 분석 할 필요가 없습니다. - 15% SDS/폴리아크라이알라미드 젤에 전기전구체 단백질 및 분열 제품을 해결합니다.
- 전기 전광을 이용하여 젤에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전달한다.
- 프로 도메인 및 리간드 도메인(또는 해당 도메인에 삽입된 에피토프 태그)을 인식하는 적절한 항체로 멤브레인을 배양하고 적절한 이차 항체로 배양합니다. 화학 발광 또는 형광 화상 진찰을 통해 단백질을 시각화합니다.
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Representative Results
아래에 설명된 실험의 목표는 Bmp4와 Bmp7 형태 이성구(Bmp4 리간드 1개와 Bmp7 리간드 1개로 구성된 디머), 호모디머(Bmp4 또는 2개의 Bmp7 리간드로 구성됨) 또는 X. laevis에서 공동 발현될 때 각각의 혼합물을 결정하는 것이었습니다. 도 2에 표시된 데이터는 이전에 게시된 연구10에서추출된다. 도 2A는 Bmp4 또는 Bmp7 균질 전구체 또는 Bmp4/7 이성구체 전구체의 프로테올리컬 성숙에 의해 생성된 분열 생성물을 보여주는 회로도이다. Bmp4는 Prodomain 내의 두 사이트에서 갈라져 SDS-PAGE 젤에서 ~26kDa에서 이동하는 두 개의 프로도메인 조각(어두운 녹색 및 노란색)과 1개의 희미한 리간드 조각(light green)을 생성합니다. Bmp7은 단일 부위에서 크리브되어 하나의 프로도메인 조각(maroon)과 ~35 kDa에서 마이그레이션하는 하나의 희미한 리간드 조각(pink)을 생성합니다. 이성구리간은 ~30kDa에서 이동합니다. 리간드 디머의 실버 막대는 이 도메인에 삽입된 myc-epitope 태그를 나타냅니다.
Bmp4myc 또는 Bmp7myc 전구체(200 pg) 또는 두 RNA(각각100pg)를 코딩하는 RNA는 2-4 세포 단계에서 X. laevis 배아로 주입되었다. 배아는 초기 가스트룰라 단계에 도달할 때까지 16°C에서 하룻밤 사이에 배양되었다. 이 시점에서, 유체는 각 그룹에서 20개의 배아의 블라스토칼에서 흡인되었고, 멸균수를 첨가하여 총 30μL로 부피를 가져왔습니다. 탈당화 후, 각 샘플은 두 개의 튜브로 분할되었다. 감소 시료 버퍼가 한 튜브에 추가되었고, 비감소 시료 버퍼가 다른 튜브에 추가되었습니다. 샘플은 5 분 동안 100 °C로 가열되었다. 단백질은 그 때 SDS/PAGE에 의해 분리되고 면역blot는 myc-epitope 꼬리표를 인식하는 항체로 조사되었다(도 2B). 감소 조건하에서, Bmp4 단량체와 갈라진 BMP7 단량체에 대응하는 단일 대역은 각각 Bmp4 또는 Bmp7만 발현하는 배아로부터 리자이트에서 검출되었다(그림2C,D,하부 패널, 레인 1, 2). 두 밴드는 Bmp4 및 Bmp7(도2C,D,하부 패널, 레인 3)을 공동 발현하는 배아에서 검출되었다. Bmp4 및 Bmp7 단량의 상대적으로 동등한 양은 세 그룹 (하부 패널, 감소)의 각각에 존재했다. 본 실험에서, 단백질이 비환량 조건 하에서 분리되었을 때, 중간 이동성의 단일 성숙한 Bmp4/7 이종구체 대역은 Bmp4및 Bmp7(그림2C,상부 패널)를 공동 발현하는 배아에서 Bmp4 호모디머의 미량과 함께 검출되었다. 이러한 결과에서 우리는 Bmp4와 Bmp7 전구체 단백질의 동등한 수준이 제노푸스 배아에서 발현되는 경우에, 그(것)들은 호모머 보다는 오히려 이성엽수를 우대하게 형성한다는 결론을 내립니다. 도 2D에도시된 실험에서, Bmp7 단백질이 Bmp4(하부 패널, 감소)에 비해 훨씬 더 많이 존재한다. 그 결과, Bmp7과 Bmp4 전구체 단백질을 모두 표현하는 배아에서 Bmp4 호모디머는 검출되지 않고 대신 사용 가능한 Bmp4는 Bmp4/7 이종수로 존재하며, 초과 Bmp7 형태 호모디머. 이 실험은 최적이지는 않지만, Bmp4와 Bmp7 전구체의 동등한 양을 공동 표현하는 것이 목표이기 때문에 Bmp4와 Bmp7이 공동 표현 될 때 호모이머보다 우선적으로 이성구를 형성한다는 결론과 여전히 일치합니다.
그림 1. 주사와 포부 바늘. 당기지만 잘린 것이 아닌 대표적인 바늘의 사진이 표시되어 주사 바늘(B)으로 사용하기 위해 당겨서 잘린 또는 포부바늘(C)으로 사용하기 위해 당겨서 잘린 것으로 나타났다. 화살표와 화살촉(A)은 유리가 잘린 지점을 나타내주며, 각각 주사및 포부를 위한 바늘을 생성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. X. laevis blastocele 액체에서 추출한 갈라진 Bmp 리간드의 분석. (A)Bmp4 및 Bmp7 호종전구체 단백질 및 myc 에피토프 태그(실버 바)의 위치에서 생성된 분열 제품은 주사 및 발파유체 추출의 타이밍을 보여주는 괄호형(B) 회로도를 도시한다. (C-D) 제노푸스 배아는 Bmp7 또는 Bmp4 RNA의 200 pg, 또는 Bmp4 및 Bmp7 RNA를 함께 혼합하여 주입하였다(각각 100 pg). 가스트룰라 단계에서, 유체는 각 실험 군에서 동일한 수의 배아의 배아로부터 추출되었다. 발아액에 존재하는 단백질은 SDS-PAGE에 의해 탈구되고 분리되었다. myc-epitope 태그를 인식하는 항체는 면역 blot를 조사하기 위하여 이용되었습니다. 면역 반응성 리간 드 단량체 및 조광기의 상대적 위치는 각 젤의 오른쪽에 스키마하게 표시됩니다. 검은 선(C)은블롯에 중간 차선의 제거를 나타냅니다. 표시된 데이터는 이전에 게시된 연구10에서추출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 구성 |
| 0.2% 트리카인 | 산화물에 용해된 트리카인 20g, 중탄산나트륨 첨가에 의해 pH를 7.4로 조정 |
| 10x MBS | 880mM NaCl, 10mM KCl, 25m NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgSO4,0.14 mM Ca (NO3)2,0.41 mM CaCl2; NaOH와 함께 pH 7.5에 적응하십시오. 10x MBS 재고는 4°C에 저장되고 필요에 따라 희석될 수 있다. |
| 시스테인 용액 2% | 100mL당 시스테인 2g을 수산화나트륨으로 pH를 7.8-8.0으로 조정한다. 매일 신선하게 만드세요. |
| 20x 드보어의 연못 물 | 100 mM NaCl, 1.3 mM KCl, 0.44 mM CaCl2; NaHCO3로pH 7.4로 조정하십시오. DeBoer의 연못 물의 20배 재고는 4°C에 저장되고 필요에 따라 희석될 수 있습니다. |
| 4배 비감소 시료 버퍼 | 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0.4% 브로모페놀 블루, 40% 글리세롤. |
| 4배 감소 시료 버퍼 | 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0.4% 브로모페놀 블루, 40% 글리세롤, 14.4 M ß-메르카토에탄올 |
| 5% 피콜 솔루션 | 500mL 0.1x MBS에서 25 g의 피콜을 수산화나트륨으로 pH를 7.5로 조정합니다. 4 °C에 보관하십시오. |
| 배아 리자테 버퍼 | 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 2.5% NP-40. 4 °C에 보관하십시오. |
| 인간의 융기 생식선 호르몬 | 19G 바늘에 부착된 3mL 주사기를 사용하여, 인간 융골 생식샘트로프틴(10,000 IU)의 고무 스토퍼를 통해 멸균수 2.5mL를 주입한다. 4 °C에 저장합니다. |
| 고환 버퍼 | 10% 태아 소 혈청, 1% 펜/스트렙 (100U/mL 페니실린, 1x MBS에서 100 mg/mL 연쇄절제술 |
표 1.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 비교적 빨리 완료될 수 있고, 고가의 시약을 필요로 하지 않으며, 생리학적 조건 하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공한다는 것이다. 또 다른 장점은 에피토프 태그 단백질을 분석하고 따라서 대부분의 Tgfß 가족 prodomain을 인식하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 부족을 우회할 수 있다는 것입니다. 또한 전감염된 배양 포유류 세포에서 에피토프 태그Tgfß 전구체 단백질의 분열을 분석할 수 있지만, X. laevis를사용하는 데는 몇 가지 장점이 있다. 초기 X. laevis 배아는 내인성 Tgfß 변환제 (후린, Pcsk5, Pcsk6 및 Pcsk7)13,14,16에대한 후보PC 제품군의 네 구성원을 모두 표현한다. 일부 포유류 세포주 하나 이상의 PC를 발현하지 않으며, 전구체 단백질과 그 컨버터제 모두의 자궁 발현을 요구하여분열(17)을검사한다. 더 중요한 고려 사항은 변형 된 세포의 과도 경질 에 의해 생성 된 전구체 단백질의 매우 높은 수준이 전구체 수준이 ER18에서품질 관리 용량을 초과하는 경우 발생할 수있는 잘못된 골짜기 제품의 분비와 같은 유물로 이어질 수 있다는 것입니다. 이는 잘못된 분열 제품이 미디어에 나타나고 활동이 분석되지 않는 한 잘못된 접이식이 검출되지 않기 때문에 전구체 이압 및 분열에 대한 해로운 돌연변이의 효과를 가리킬 수 있다. 대조적으로, X. laevis 배아를 이용한 실험은 접이식에 있는 결점을 쉽게 검출하고, ER에서 잘못 접힌 단백질 반응 또는 비감소 조건 하에서 분열 제품의 비정상적인 이동으로 인해 전구체의 손실로 이끌어 내는10,18.
상기 포부 절차 동안, 각 배아로부터 약 상당량의 배아액을 추출하는 것이 필수적이며, 특히, 예를 들어, 야생형 및 돌연변이 전구체로부터 생성된 골짜기 생성물을 비교하는 것이 목표였다. 이것은 부정확한 과학이지만 각 태아에서 대략 동등한 시간 동안 호흡하는 것은 부피를 정상화하는 것을 돕습니다. 또한, 각 그룹에서 더 많은 수의 배아에서 유체를 흡입하면 개별 배아 사이의 부피 차이를 정상화하는 데 도움이됩니다.
시험관 내 분열 반응은 Tgfß 전구체 단백질에 존재하는 특정 PC 모티브가 절단되어 있는지 여부를 결정하고 주어진 기판에 대한 내인성 변환기로 잠재적 PC를 식별 및/또는 배제하는 데 사용할 수 있는 대체 절차이다. 기존 프로토콜은 X. laevis oocytes를 사용하여 토끼 망상 세포 또는 생체 내를사용하여 시험관내에서 방사성 표지전구체 단백질이 생성되는 간단한 분석체를 설명합니다. 기판은 그 때 전기전도 및 사방사선에 의해 분석된 후보 재조합 PC 및 분열제품으로 시험관내에서 배양된다. 이 프로토콜은 단백질이 PC 기판인지 여부를 결정하고 생체 내에서어떤 잠재적인 분열 부위를 식별할 수 있는 빠르고 쉬운 방법을 제공하지만, 전구체 단백질은 적절하게 접히거나 분화될 가능성이 낮으며, 따라서 이러한 실험에서 얻은 분열 정보는 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다.
우리가 여기에서 기술하는 프로토콜의 한 가지 단점은 X. laevis 배아에서 제대로 접힌, 이질된 전구체 단백질을 시각화하는 것은 불가능하다는 것입니다. 삼촌단황 전구체 단백질이 ER 내에서 훨씬 더 높은 수준으로 분화되고 접힌 전구체보다 훨씬 높은 수준으로 축적되기 때문에 과도하게 전염된 포유류 세포와 같은 다른 자궁 발현 시스템에서도 마찬가지입니다. 이산화된 전구체는 ER을 떠난 후 빠르게 갈라지고 분비됩니다. 전구체 단백질의 이질화 및 접기를 분석하는 것이 필수적인 경우, 유용한 대체 절차는 X. laevis oocytes20에서방사성 표지 전구체의 인신 매매 및 분열을 검사하는 것입니다. 자가 방사선 사진의 높은 감도, 단백질이 배양 된 포유류 세포 또는 배아에서보다 난피세포에서 보다 더 느리게 분비 시스템을 통해 이동한다는 사실과 결합하여 oocytes 내의 이질전구단백질을 검출하고 단백질이 제대로 접혀 있고 그들의 글리코실화 상태를 검사하여 ER을 떠난지 여부를 테스트할 수있습니다. 21.
요약하자면, 본 프로토콜은 Tgfß 가족 전구체 단백질의 성숙에 의해 생성된 분열 제품을 분석하는 신속하고 간단한 방법을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 훌륭한 동물 관리에 대한 메리 산체스 감사합니다. 저자의 연구는 국립 보건 원 (NIH /NICHD)의 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NIH /NICHD)에 의해 지원됩니다 R01HD067473-08 및 R21 HD102668-01 및 당뇨병 과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소에 의해 (NIDDK/NIH) R01DK1208.08.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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