Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol udnytter agarose hævelse som en kraftfuld og generaliserbar teknik til at indarbejde integrerede membranproteiner (IMP) i gigantiske unilamellar lipid vesikler (GUVs), som beskrevet her for rekonstitution af human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), en af klasserne af farmakologisk vigtige G protein-koblede receptorer.

Abstract

Robuste in vitro-undersøgelser af strukturen og funktionen af integrerede membranproteiner har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet og de mange faktorer, der påvirker proteinadfærden i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og meget tunable in vitro-modelsystem til undersøgelse af protein-membraninteraktioner og sondering af proteinadfærd på en præcis, stimulusafhængig måde. I denne protokol præsenterer vi en billig og effektiv metode til fremstilling af GUVs med den menneskelige serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stabilt integreret i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjælp af en modificeret hydrogel hævelse metode; ved at deponere en lipidfilm oven på en blanding af agarose og 5-HT1AR og derefter fugte hele systemet, kan vesikler dannes med korrekt orienteret og funktionel 5-HT1AR indarbejdet i membranen. Disse GUV'er kan derefter bruges til at undersøge protein-membran interaktioner og lokalisering adfærd via mikroskopi. I sidste ende kan denne protokol fremme vores forståelse af funktionaliteten af integrerede membranproteiner, hvilket giver dyb fysiologisk indsigt.

Introduction

Syntetiske modelmembraner er kraftfulde værktøjer i undersøgelsen af biomembranernes grundlæggende egenskaber og funktioner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en af de mest fremtrædende platforme til at studere en række plasmamembranegenskaber og kan konstrueres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er veletableret, at plasmamembranen og dens organisation spiller en central rolle i en lang række cellulære processer, såsom signaltransduktion, vedhæftning, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs er blevet fremstillet ved hjælp af forskellige metoder, herunder blid hydrering16, hydrogel hævelse17, elektroformation18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, jetting23, og opløsningsmiddel udveksling24,25,26. På grund af udfordringer med håndtering af integrerede membranproteiner (IMP) har in vitro-platforme til at studere dem været begrænsede. GUV'er præsenterer en forenklet platform til at studere IMP i et miljø, der efterligner deres oprindelige miljø. Selv om der har været flere tilgange til proteinkonstitution i GUV'er, opstår der udfordringer ved at inkorporere proteiner med den korrekte orientering og opretholde proteinfunktionalitet27.

Den mest vellykkede proteinkonkonstitution i GUV'er kræver vaskemiddeludvekslingsmetoden; som indebærer at opløse proteinerne fra deres oprindelige miljø ved rengøringsmidler, efterfulgt af proteinrensning, og derefter erstatte vaskemiddelmolekylerne med lipider gennem forskellige metoder28. Mens vaskemidler tjener til at stabilisere den tertiære struktur af IMP under rensning, vaskemiddel micelles er et relativt unaturligt miljø for disse proteiner, som er bedre stabiliseret, især for funktionelle undersøgelser, i lipid bilayers28,29,30. Desuden har det været vanskeligt at inkorporere funktionelle transmembranproteiner i lipid-bilayeren ved hjælp af traditionelle GUV-fremstillingsteknikker på grund af størrelsen, delikatessen af disse proteiner og de ekstra vaskemiddeludvekslingstrin, der ville være nødvendige27,31,32,33. Brugen af organisk opløsningsmiddel til at fjerne rengøringsmidler forårsager protein aggregering og denaturering34. En forbedret vaskemiddelmedieret metode har været lovende, men forsigtighed er nødvendig for vaskemiddel fjernelse trin og optimering kan være nødvendig for specifikke proteiner31,35. Derudover, metoder, der udnytter elektroformation kunne begrænse valget af protein og kan ikke være egnet til alle lipid kompositioner særligt ladede lipider31,36,37. En anden teknik, der er blevet brugt, er peptid-induceret fusion af store unilamellar vesikler (LUVs), der indeholder det ønskede protein med GUVs, selv om det viste sig at være besværligt og kan føre til indsættelse af udenlandske molekyler-fusogenic peptider33,38,39. Giant plasmamembran vesikler (GPMVs), som er afledt af levende celler, kan bruges til at overvinde nogle af disse spørgsmål, men de giver minimal kontrol af den resulterende lipid og protein sammensætning14,40,41. Derfor udgør integrationen af IMP i bilipidlaget af GUV'er ved hjælp af vores modificerede agarose hævelsesmetode en pålidelig metode til yderligere at undersøge disse proteiner i membranmiljøet42,43,44,45.

Cellulær signalering og kommunikation involverer en familie af proteiner kendt som G protein-koblede receptorer (GPCRs); GPCR er blandt de største familie af proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetit, blodtryk, hjerte-kar-funktion, åndedræt, og søvn blandt mange andre fysiologiske funktioner46. I denne undersøgelse, Vi brugte human serotonin 1A receptor (5-HT1AR), som er et prototypisk medlem af GPCR familien. 5-HT1AR kan findes i centralnervesystemet (CNS) og blodkar; det påvirker mange funktioner såsom hjerte-kar-, gastrointestinale, endokrine funktioner, samt deltager i reguleringen af mood47. En stor barriere for GPCR forskning stammer fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVs præsentere en lovende platform for undersøgelsen af forskellige egenskaber af interesse, lige fra protein funktionalitet, lipid-protein interaktioner, og protein-protein interaktioner. Forskellige tilgange er blevet brugt til at studere lipid-protein interaktioner såsom overflade plasmon resonans (SPR)48,49, nuklear magnetisk resonans spektroskopi (NMR)50,51, protein lipid overlay (PLO) assay51,52,53,54, native massespektrometri55, isotermisk titrering calorimetri (ITC) 56,57, og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Vores laboratorium har brugt den forenklede GUV-tilgang til at undersøge effekten af lipid-protein interaktioner på proteinfunktionalitet ved at indkapsle BODIPY-GTPγS, som binder sig til Giα-underenheden i receptorens aktive tilstand. Deres bindende løsner fluorophoren, der producerer et fluorescenssignal, der kunne detekteres over tid45. Desuden undersøgte forskellige undersøgelser Lipid-protein interaktioner og proteiners rolle i at mærke eller stabilisere membrankrumningen60,61, og ved hjælp af en mulig GUV-tilgang kunne det være en vigtig fordel.

Denne protokol viser en enkel metode til at indarbejde GPCR'er i membranen af GUV'er ved hjælp af et modificeret agarose hydrogelsystem17,42. Desuden kan vores metode på baggrund af vores tidligere arbejde være velegnet til IMP, der kan bære kortvarig eksponering for 30-40 °C. Kort, vi sprede en tynd film af agarose kombineret med membran fragmenter, der indeholder GPCR af interesse. Efter gelering af dette lag deponerer vi en lipidopløsning oven på agarose og tillader opløsningsmidlet at fordampe. Rehydrering af systemet blev derefter udført med en vandig buffer, hvilket resulterede i dannelsen af GUVs med protein indarbejdet i lipid bilayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinmærkning

  1. Tillad NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin afsaltningskolonne at ekvilibrere ved stuetemperatur.
  2. 1 mg NHS-rhodamin opløses i 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO).
  3. Der tilsættes 5 μL 1 M natriumbicarbonatopløsning for at øge pH-5-HT1AR-opløsningen til pH 8.
  4. Der tilsættes 3,66 μL af NHS-rhodaminopløsningen til 50 μL af 5-HT1AR-opløsningen og pipetten forsigtigt op og ned i et mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Sørg for at have mindst 10x molar overskydende NHS-rhodamin.
  5. Hold blandingen beskyttet mod lys og sæt rotator på ved stuetemperatur i 1 time.
  6. Vask en 7 k MWCO spin kolonne med 200 μL af 1x fosfat buffer saltvand (1x PBS) tre gange i 1,5 min ved 1,5 RCF for hver vask.
  7. Tilsæt det mærkede protein til en kolonne og balancere mængden i et andet mikrocentrifugerør.
  8. Skru ned for det mærkede protein én gang i 5 min ved 1,5 RCF.
  9. Tag et UV-vis spektrum ved hjælp af et nanodrop spektrofotometer ved 280 nm og 554 nm og beregne mærkningseffektiviteten efter producentens manual.
  10. Det mærkede protein, der er dækket af mærket, opbevares ved 5 °C, indtil det anvendes yderligere. Opløsningen er stabil i ca. en uge efter mærkningen.

2. GUV'er med membraninstrukt 5-HT 1A

  1. Fremstilling af materialer og reagenser
    1. Lad proteinet, lipider og BSA (Kvægserum albumin) ekvilibrere til stuetemperatur.
    2. I løbet af denne tid rengøres dækslerne ved at placere dem i methanol og sonikering i 30 min ved 40 °C. Sørg for, at methanolen helt dækker dækslerne, og vandstanden i vandbadet er over metanolniveauet i beholderen.
      BEMÆRK: Methanol er giftigt og skal håndteres i passende kemisk hætte.
    3. Tør den overskydende metanol på dækslerne med en blid luftstrøm. Dæksleren er dækket af en 40 °C ovn i 15 min for at sikre, at de overskydende dæksler tørrer af.
    4. Begynd plasmarensningsprocessen. Først skal dækslerne placeres i plasmarenseren og lukke luftindtagsventilen for at evakuere al luften inde i kammeret.
    5. Når kammeret er under vakuum, rengør dækslerne i 5 min ved hjælp af høj RF-effektindstilling og et næsten komplet vakuum, med kun et lille luftindtag ind i vakuumkammeret. For at sikre det korrekte niveau af plasma skal du justere åbningen af vakuumkammeret, så plasmaets resulterende farve er en stabil, lyserød.
      BEMÆRK: Det er afgørende, når du bruger luft, at plasmaet forbliver en lyserød farve under plasmabehandlingstrinnet, da en mørkere lilla farve indikerer, at der er en forkert mængde luft i kammeret og vil resultere i en suboptimal plasmabehandling.
    6. Når de 5 min er gået, slukke RF strøm og slip vakuum.
      BEMÆRK: Når plasmakammeret fjernes, skal du sørge for, at dækslerne forbliver dækket.
  2. Hydrogel forberedelse
    1. Kombiner 6 mg ultralav smeltetemperatur agarose med 300 μL ultrapurt vand (dvs. 2% (w/v) agarose).
      BEMÆRK: 2% agarose vil blive brugt til at lave proteinfrie GUV'er. Agaroseopløsning kan opbevares ved 45 °C i to dage.
    2. Kombiner 9 mg ultralav temperatur agarose med 300 μL ultrapure vand til 3 w /v% agarose ved som forberedt i trin 3.1. 3% agarose vil blive brugt til at gøre protein indarbejdet GUVs.
    3. Vortex opløsningen kort før du placerer dem på 90 °C varmeblokken i 10 min. Derefter hvirvler røret igen, før du overfører det til en 45 °C varmeblok for at holde det i smeltet form, indtil det anvendes yderligere.
  3. Agarose og proteinblanding
    1. Bland 21 μL af 3% agarose med 7 μL af 5-HT1AR membranfragmenter. Pipette op og ned langsomt mange gange for at sikre tilstrækkelig blanding. Inkuberes derefter ved 45 °C i 1 min.
  4. Hydrogel og lipid deposition
    1. Til proteinfri GUV'er: Lav en tynd film på friskplasma-rensede coverslips med 20 μL på 2% agarose. Hurtigt slippe en anden coverlip på toppen af agarose dråbe og forsigtigt skubbe coverslips fra hinanden for at gøre en tynd film på begge coverslips.
      BEMÆRK: Dette trin er vanskeligt, fordi dråben skal glide, mens agarose stadig er i smeltet form.
    2. For protein-indbyggede GUVs: Pipette protein / agarose blandingen op og ned endnu en gang, og derefter deponere 20 μL af de 2% agarose på en plasma-renset coverlip. Følg slip-casting anvisningerne som beskrevet ovenfor.
    3. Lad agaroseen gelbeskyttet mod lys i 30 min ved stuetemperatur.
    4. Sæt lipiderne dropwise oven på agaroselaget. Brug i alt 10 μL 2 mg/mL 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholin (POPC) med 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (DPPE) mærket med ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (eller lipidblanding af interesse) i kloroform oven på agarosefilmen. Sæt dråberne af ved hjælp af en gaskromatografinål og spred en dråbe ad gangen via en blid luftstrøm.
      BEMÆRK: Forsigtighed er nødvendig med dette trin for at lave et relativt ensartet lag lipider oven på hydrogelen. Kloroform er også giftigt og bør håndteres i passende kemisk hætte.
    5. Sykes-Moore (S-M) kamre ved at placere en O-ring oven på coverlip, og derefter placere den øverste del af kammeret på toppen af O-ring. Brug den nøgle, som fabrikanten stiller til rådighed, til at samle kammeret ved at skrue kammerkomponenterne sammen for at forsegle kammeret og forhindre lækage.
      BEMÆRK: Toppen af kammeret skal strammes på O-ringen, men der er behov for forsigtighed for at sikre, at dækslet forbliver intakt, da dækslet kan knække, hvis O-ringen ikke sidder ordentligt i kammeret. Sørg også for, at kammeret er forseglet stramt nok, så kammeret ikke lækker, når hævelsesopløsningen tilsættes. Hvis kammeret ikke strammes tilstrækkeligt, vil det resultere i lækager og tab af prøve.
  5. Hævelse og høst af vesikler
    1. Fugt hele systemet ved forsigtigt at pipettere 450 μL 200 mM saccharose i 1x PBS og forsigtigt trykke på kamrene for at sikre tilstrækkelig bufferdækning af hydrogel-lipidlagene.
      BEMÆRK: Saccharoseopløsningen kan erstattes med en rehydreringsbuffer, der indeholder biologiske sonder af interesse.
    2. Kamrene placeres ved 45 °C, og dæk den øverste del af kammeret med en dækslet for at forhindre fordampning. Lad prøven svulme op, beskyttet mod snavs og lys i 1 time.
    3. Der tilsættes 100 μL 1 mg/mL BSA i ultrapurt vand i hver brønd af en 96-brønds plade, der er beregnet til at blive brugt. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    4. Vask tre gange med ultra-rent vand og en gang med 200 mM saccharose i 1x PBS.
    5. Endelig tilsættes 200 mM glukose i 1x PBS indtil tilsætning af GUV-prøveopløsningen.
      BEMÆRK: BSA blev brugt til at blokere GUV adsorption.
    6. Efter at have tilladt hydrogel at svulme op, forsigtigt ryste og trykke på kammeret for at løsne eventuelle GUVs, der kan forblive fastgjort til hydrogel overflade. Derefter forsigtigt pipette op GUV-saccharose opløsning.
      BEMÆRK: Som et valgfrit skridt for at sikre, at alle vesikler løsnes fra overfladen, skal du forsigtigt pipette noget af saccharoseaffjedringen tilbage på hydrogeloverfladen.
    7. Affjedringen flyttes ind i et tidligere forberedt mikrocentrifugerør, der indeholder 700 μL på 200 mM glukose i 1x PBS.
      BEMÆRK: Tætheden gradient vil føre til afvikling af vesikler til bunden af centrifugerøret.
    8. Lad vesiklerne nøjes i endnu en time for at sikre, at vesiklerne kan synke til bunden af mikrocentrifugerøret, hvilket giver mulighed for optimal samling.
    9. Efter afregning af GUV'er i glukose overføres 300 μL fra bunden af centrifugerøret (de afsatte vesikler) til den tidligere forberedte og BSA-behandlede 96-brønds plade for at undersøge vesiklerne under det konfokale mikroskop.
      BEMÆRK: Sørg for at undgå bunden af mikrocentrifugrøret for at minimere mængden af snavs, der opsamles i den endelige prøve.
  6. Kontroller prøverne under mikroskopet.
    1. Shine en 488 nm laser på prøven (der giver os mulighed for at visualisere membranen, som bilayer er blevet mærket med ATTO-488-DPPE).
    2. Shine en 561 nm laser på prøven (der giver os mulighed for at visualisere proteinet, da det er blevet mærket med NHS-Rhodamine).
      BEMÆRK: Forsigtighed er nødvendig, mens billeddannelse prøven som fotooxidation kan destabilisere vesikler. Vesikler blev observeret samme dag.

Figure 1
Figur 1: Illustration af de detaljerede protokoltrin. Oprettet med BioRender.com Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Koncentrationen af protein blev målt, og mærkningsgraden blev beregnet som molarforholdet mellem farvestoffet og proteinet til 1:1. Ved at undersøge GUV'erne ved hjælp af konfokal mikroskopi var vi i stand til at bekræfte vellykket dannelse og proteinintegration af vesiklerne. Lipiderne blev mærket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet blev kovalent mærket via rhodamin NHS-ester modifikation af primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininstruerede vesikel i henholdsvis ATTO 488- og rhodaminkanalerne. Alle mikrografer er blevet mørke strøm og flatfield korrigeret. Figur 2c og figur 2d viser en negativ kontrol GUV uden protein indarbejdet. Figur 3a og figur 3b viser et protein, der er indbygget GUV med linjeintensitetsprofiler givet af den stiplede hvide linje af samme vesikel i begge kanaler. Linjeintensitetsprofilen viser et todimensionelt plot af intensiteten af pixel langs den hvid tegnede linje i billedet. X-aksen er afstanden langs linjen, og y-aksen er pixelintensiteten. ImageJ software blev brugt til at plotte profil intensiteten af den angivne linje.

Figure 2
Figur 2: Mikrografer, der sammenligner protein, indbygget GUV'er og GUV'er uden protein (kontrol). Mikrografer (a) og b) viser protein, der er indbygget GUV-fluorescens med henholdsvis de respektive ATTO 488- og rhodaminkanaler. Mikrografer (c) og (d) viser et protein udeladt GUV, når ophidset med ATTO 488 og rhodamin kanaler, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Øverste række viser mikrografer af protein indbygget GUVs i ATTO 488 (a) og rhodamin (b) kanaler. Linjeintensitetsprofiler for de angivne hvidstiplede linjer er nedenfor. Analysen blev udført ved hjælp af ImageJ-software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har identificeret to trin, der er afgørende for succesen af den samlede protokol: plasmabehandling og lipidaflejring. Plasmarensning udretter to ting: For det første fjerner det spor af organisk materiale fra glasoverfladen; For det andet aktiverer den coverlip-overfladen, hvilket giver mulighed for en stigning i vådbarheden, da glasoverfladen hydrofilitet øges62,63. Berøring af dækslet overflade efter plasmarensning vil inaktivere og forurene den ultraren overflade og frarådes kraftigt. Vores anbefaling er kun at røre selve kanterne og undersiden af dækslerne ved håndtering af dækslerne til agarose slip casting trin. Denne metode bruger en dropwise lipid deposition, som kræver en gaskromatografi (GC) nål og en luftstrøm til at deponere et par mikroliters lipidopløsning ad gangen, hvilket giver mulighed for præcis kontrol af mængden af lipid tilsat og placeringen af lipidfilmen på hydrogeloverfladen. Ulempen ved denne metode er, at hvis det ikke gøres omhyggeligt, kan det resultere i et par udvalgte områder med en tykkere lipidfilm, hvilket resulterer i reducerede GUV-udbytter. Derfor er det afgørende at sikre, at der er så ensartet tyndt af et lipidlag som muligt på overfladen af agarose.

En af de mest betydningsfulde fordele ved denne protokol er fleksibiliteten i selve platformen; denne metode egner sig meget godt til ændringer i protein- og lipidsammensætning samt indkapsling og bufferændringer. Denne protokol kan i princippet omfatte ethvert transmembranprotein, da vi har været i stand til med succes at indarbejde en række forskellige transmembranproteiner, lige fra adenosinreceptoren (A2AR) til plante aquaporiner uden at ofre funktionalitet42,45,64. Traditionelt er proteiner blevet indarbejdet i GUV'er efter opløselighed ved rengøringsmidler eller iblanding i proteo-liposomer eller små unilamellar vesikler, der efterfølgende kan integreres i en præformet GUV65. Fordelen ved vores modificerede hydrogel hævelse metode er, at det fjerner afhængigheden af vaskemidler eller mellemliggende vesikler og giver en mellemliggende hydreret stillads. Fordelene ved dette er dobbelte: Vi kan stabilt indarbejde funktionelle GPCR'er i membranen i en mere fysiologisk relevant buffer uden at stole på vaskemiddeludvekslingsmetoder, der kræver mere forberedelse og pleje med hensyn til koncentrationen af de nævnte vaskemidler, og at den proces, hvorved GUVs knop off overfladen af hydrogel giver mulighed for korrekt orientering af proteinerne i bilayer66 . Vi har vist, at GUV spirende proces indebærer sammensendelse af mange mindre nanometer-skala vesikler i større, mikron-skala vesikler, hvilket tilskynder til korrekt protein orientering fra begyndelsen. Vi har vist, at dette er tilfældet i vores tidligere arbejde. Kort sagt, vi kovalent mærket et antistof rettet mod en bestemt cytosolic sløjfe af Adenosin receptor og inkuberet mærket antistof med proteinet, og derefter indarbejdet mærket protein i lipid-dye-mærket GUVs ved hjælp af den modificerede hydrogel hævelse metode. Vi udsatte derefter protein-indbyggede vesikler til en ladet quencher, som ikke er i stand til at krydse bilayer. Vi ser efterfølgende en 50% reduktion i fluorescensen af lipidfarvestoffet, men fluorescensen af det mærkede protein forbliver upåvirket af quencheren, hvilket viser korrekt orientering44.

Tidligere arbejde ud af vores laboratorium har undersøgt den rolle, hvor lipid headgroup afgift, zwitterionic og net-ioniske ladede lipider, samt buffer og hydrogel egenskaber såsom pH, ionisk styrke, osmolarity, og hydrogel koncentration har på dynamikken i GUV dannelse67. Kort sagt påvirker lipidladning ikke i høj grad GUV-dannelsen, mens bufferegenskaber som stigninger i saccharosekoncentrationen (f.eks. 500 mM Saccharose i 185 mM ionisk styrke PBS-buffer) påvirker GUV-dannelsen negativt, hvilket resulterer i uregelmæssigt formede vesikler, som sandsynligvis ikke umiddelbart vil egne sig til høst. Sure opløsninger (pH = 3) øger dannelseshastigheden, mens en mere grundlæggende opløsning (pH = 8) undertrykker guv-formationshastigheden. GUVs stadig form på både sure og grundlæggende buffere, med kun marginale forskelle i vesikel størrelse. Lav agarose koncentrationer (~ 0,1-1 w /v%) også negativt påvirke GUV dannelse på grund af manglende homogen overfladedækning og et fald i hydrogel hævelse, en nødvendig kraft i sammensendelse og spirende guvs fra hydrogel overflade. Således har vi fastslået, at en 2 w / v% endelig agarose koncentration med en saccharose / glukoseopløsning på 100-200 mM, kombineret med en buffer ionisk styrke på 185 mM PBS ved pH 7,4 opnår en god balance mellem agarose hævelse, GUV dannelseshastighed og efterfølgende vesikelstørrelse. For vesikler, der indeholder protein, giver en forøgelse af den oprindelige agarosekoncentration til 3 w/v% mulighed for en endelig agarosekoncentration på 2 w/v% efter tilsætning af proteinopløsningen. Ud over dannelsesdynamikken letter saccharose/glukosebuffersystemet også sedimentering og efterfølgende indsamling af dannede GUV'er samt visualisering under fasekontrastmikroskopi65,68.

Der er nogle forsigtighedspunkter med hensyn til denne protokol, specielt med hensyn til agarose og udvælgelse af vesikler. For eksempel, mens vi bruger en ultralav smeltetemperatur agarose, skal agarose-vandaffjedringen nå mindst 60 °C for at blive smeltet, og agaroseproteinblandingen inkuberes ved 45 °C.  Det er vores erfaring, at denne temperatur ikke eliminerer aktiviteten af 5-HT1AR, men forsigtighed er berettiget til andre proteiner. Generelt begynder den agarose, vi bruger, at gelere ved 20 °C, og dermed kan hævelsesreaktionen finde sted ved temperaturer over 20 °C, men denne proces kan ikke fungere under denne temperatur. Det skal også bemærkes, at jo tættere temperaturen kommer på 20 °C, jo mindre effektiv bliver hævelsestrinnet, hvilket fører til efterfølgende fald i GUV-udbytter. Der kræves således forsigtighed for den temperatur, der kræves for at opretholde den smeltede agarose og sikre, at den nævnte temperatur ikke vil denaturere det pågældende protein samt aspirere afregningsopløsningen for at undgå, at overskydende suspenderet agarose medtages i den endelige prøve. Denne metode i sin nuværende tilstand resulterer også i en heterogen GUV befolkning størrelse, med nogle vesikler viser multilamellarity og andre fejlbehæftede vesikel fænomener såsom vesikler i vesikler. Dette er typisk for almindelige GUV dannelsesmetoder og kræver årvågenhed og diskretion, når du vælger vesikler til mikroskopi og analyse. GUVs, der viser usædvanligt høje niveauer af fluorescens anbefales heller ikke til analyse, da agarose kan findes på det indre af nogle af disse vesikler. Upubliceret arbejde ud af vores laboratorium har været i stand til at køre mikropipette aspiration eksperimenter ved hjælp af vesikler lavet ved hjælp af denne teknik, der illustrerer, at agarose metode producerer vesikler uden mekanik-ændre agarose i lumen.

Begrænsninger til side, denne protokol præsenterer en robust og ligetil metode til generering af protein indarbejdet GUVs. Det kan generere høje udbytter af GUVs i fysiologisk relevante forhold, der inkorporerer korrekt orienterede transmembrane proteiner i bilayer uden at gå på kompromis med deres funktionalitet. Dette er en afvigelse fra andre metoder til vesikeldannelse, som involverer elektriske strømme eller blid hydrering, der ville skade proteinets struktur betydeligt og gøre det ikke-funktionelt eller kræve yderligere vaskemiddelopslusing og fjernelsestrin. I betragtning af at GPCR'er repræsenterer op mod en tredjedel af alle farmaceutiske mål, er der betydelig interesse for at kunne studere denne proteinfamilie i en meget tunable, high-throughput, biomimetiske platform. Mere specifikt spænder applikationerne i dette arbejde fra studiet af protein-lipidinteraktioner, hvordan lipidmikromiljøet påvirker proteinfunktionalitet og lokalisering og andre grundlæggende biofysiske spørgsmål, der kan informere lægemiddeludvikling og opdagelse. Et eksempel på dette kan findes i det udførte arbejde i vores laboratorium, som har været i stand til at skelne afvigelser i receptorfunktionalitet som følge af lipidoxidation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Matthew Blosser for værdifuld diskussion og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) og National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

Bioengineering udgave 180
Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter