Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Philip E. J. Smith; Taylor Slouka; Mona Dabbas; Javin  P. Oza

doi:10.3791/62866

Articolo metodologico

Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

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DOI:

10.3791/62866

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22 luglio 2021

Philip E. J. Smith¹^,² , Taylor Slouka¹^,² , Mona Dabbas¹^,² , Javin P. Oza¹^,²

¹Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, ²Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

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Sommario

Questo lavoro descrive la preparazione dell'estratto cellulare di Escherichia coli (E. coli) seguito da reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) in meno di 24 ore. La spiegazione del protocollo CFAI (Cell-Free Autoinduction) descrive i miglioramenti apportati per ridurre la supervisione dei ricercatori e aumentare le quantità di estratto cellulare ottenuto.

Abstract

La sintesi proteica senza cellule (CFPS) è cresciuta come piattaforma biotecnologica che cattura i macchinari di trascrizione e traduzione in vitro. Numerosi sviluppi hanno reso la piattaforma CFPS più accessibile ai nuovi utenti e hanno ampliato la gamma di applicazioni. Per i sistemi CFPS a base di lisato, gli estratti cellulari possono essere generati da una varietà di organismi, sfruttando la biochimica unica di quell'ospite per aumentare la sintesi proteica. Negli ultimi 20 anni, Escherichia coli (E. coli) è diventato uno degli organismi più utilizzati per sostenere la CFPS grazie alla sua convenienza e versatilità. Nonostante i numerosi progressi chiave, il flusso di lavoro per la preparazione dell'estratto di cellule di E. coli è rimasto un collo di bottiglia chiave per i nuovi utenti per implementare CFPS per le loro applicazioni. Il flusso di lavoro di preparazione dell'estratto richiede molto tempo e richiede competenze tecniche per ottenere risultati riproducibili. Per superare queste barriere, abbiamo precedentemente segnalato lo sviluppo di un flusso di lavoro CFAI (Cell-Free Autoinduction) 24 ore su 24 che riduce l'input dell'utente e le competenze tecniche richieste. Il flusso di lavoro CFAI riduce al minimo il lavoro e le competenze tecniche necessarie per generare estratti di cellule, aumentando al contempo le quantità totali di estratti cellulari ottenuti. Qui descriviamo quel flusso di lavoro in modo graduale per migliorare l'accesso e supportare l'ampia implementazione della CFPS basata su E. coli .

Introduzione

L'uso della sintesi proteica senza cellule (CFPS) per applicazioni biotecnologiche è cresciuto notevolmente negli ultimi anni ^1,2,3. Questo sviluppo può essere attribuito in parte a maggiori sforzi nella comprensione dei processi che si verificano nelle CFPS e del ruolo di ciascun componente ^4,5. Inoltre, i costi ridotti attribuiti a configurazioni ottimizzate e fonti di energia alternative hanno reso la tecnologia senza celle più facile da implementare per i nuovi utenti 6,7,8,9.