Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث التلقائي الخالي من الخلايا

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف هذا العمل تحضير مستخلص الخلايا من الإشريكية القولونية (E. coli ) متبوعا بتفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في أقل من 24 ساعة. يشرح شرح بروتوكول الحث الذاتي الخالي من الخلايا (CFAI) بالتفصيل التحسينات التي تم إجراؤها لتقليل إشراف الباحثين وزيادة كميات مستخلص الخلايا التي تم الحصول عليها.

Abstract

نمت توليف البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) كمنصة للتكنولوجيا الحيوية تلتقط آلات النسخ والترجمة في المختبر. جعلت العديد من التطورات منصة CFPS أكثر سهولة للمستخدمين الجدد ووسعت نطاق التطبيقات. بالنسبة لأنظمة CFPS القائمة على التحلل ، يمكن توليد مستخلصات الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، وتسخير الكيمياء الحيوية الفريدة لهذا المضيف لزيادة تخليق البروتين. خلال السنوات ال 20 الماضية ، أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) واحدة من أكثر الكائنات الحية استخداما على نطاق واسع لدعم CFPS بسبب قدرتها على تحمل التكاليف وتنوعها. على الرغم من العديد من التطورات الرئيسية ، ظل سير العمل لإعداد مستخلص خلايا E. coli عنق الزجاجة الرئيسي للمستخدمين الجدد لتنفيذ CFPS لتطبيقاتهم. يستغرق سير عمل إعداد المستخلص وقتا طويلا ويتطلب خبرة فنية لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. للتغلب على هذه الحواجز، أبلغنا سابقا عن تطوير سير عمل الحث التلقائي (CFAI) الخالي من الخلايا على مدار 24 ساعة والذي يقلل من مدخلات المستخدم والخبرة التقنية المطلوبة. يقلل سير عمل CFAI من العمالة والمهارة التقنية المطلوبة لتوليد مستخلصات الخلايا مع زيادة إجمالي كميات مستخلصات الخلايا التي تم الحصول عليها. هنا نصف سير العمل هذا بطريقة خطوة بخطوة لتحسين الوصول ودعم التنفيذ الواسع النطاق ل CFPS القائم على E. coli.

Introduction

نما استخدام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية1،2،3. ويمكن أن يعزى هذا التطور جزئيا إلى زيادة الجهود المبذولة لفهم العمليات التي تحدث في CFPS ودور كل مكون 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انخفاض التكاليف المنسوبة إلى الإعدادات المحسنة ومصادر الطاقة البديلة جعلت التكنولوجيا الخالية من الخلايا أسهل في التنفيذ للمستخدمين الجدد6،7،8،9. من أجل تنفيذ عوامل النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين ، غالبا ما يستخدم مستخلص الخلايا لدفع التفاعلات الخالية من الخلايا10. قدمت أدلة المستخدم المنشورة مؤخرا بروتوكولات بسيطة لإنتاج مستخلص وظيفي ، مما يسهل تنفيذه للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة على حد سواء 1،11،12،13،14. عادة ما يتم الحصول على مستخلص الخلايا من خلال تحلل مزرعة الخلايا ، والتي يمكن زراعتها باستخدام كائنات حية مختلفة اعتمادا على الاستخدام المحدد المطلوب1،15،16.

أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) بسرعة واحدة من الكائنات الحية المضيفة الأكثر استخداما لإنتاج مقتطفات وظيفية17. يفضل سلالة BL21 Star (DE3) لأنها تزيل البروتياز من الغشاء الخارجي (OmpT protease) والسيتوبلازم (Lon protease) ، مما يوفر بيئة مثالية لتعبير البروتين المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DE3 على λDE3 الذي يحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7 RNAP) تحت سيطرة مروج lacUV5 ؛ يحتوي المكون النجمي على جين RNaseE متحور يمنع انقسام الحمض النووي الريبوزي المرسال4،14،18،19. تحت مروج lacUV5 ، يسمح تحريض الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) بالتعبير عن T7 RNAP20,21. تستخدم هذه السلالات لزراعة وحصاد الخلايا ، والتي تعطي المواد الخام لإعداد المستخلص. يمكن إجراء تحلل الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، بما في ذلك ضرب الخرز ، والصحافة الفرنسية ، والتجانس ، والصوتنة ، وتجويف النيتروجين1،11،12،22.

عملية الزراعة البكتيرية والحصاد متسقة عبر معظم المنصات عند استخدام الإشريكية القولونية، ولكنها تتطلب عدة أيام وإشرافا مكثفا من الباحثين1،11،13. تبدأ هذه العملية عموما بزراعة البذور بين عشية وضحاها في مرق LB ، والذي عند النمو بين عشية وضحاها يتم تلقيحه بعد ذلك في ثقافة أكبر من 2xYTPG (الخميرة ، التربتون ، الفوسفات العازل ، الجلوكوز) في اليوم التالي. تتم مراقبة نمو هذه الثقافة الأكبر حتى تصل إلى مرحلة السجل المبكرة إلى المتوسطة ، بكثافة بصرية (OD) تبلغ 2.514,20. مطلوب قياس مستمر حيث ثبت سابقا أن مكونات النسخ والترجمة نشطة للغاية في مرحلة السجل المبكر إلى المتوسط23,24. في حين أن هذه العملية يمكن أن تخلق مستخلصا قابلا للتكرار ، فقد طور مختبرنا مؤخرا طريقة جديدة باستخدام وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا (CFAI) ، مما يقلل من إشراف الباحثين ، ويزيد من العائد الإجمالي للمستخلص للتر معين من زراعة الخلايا ، ويحسن الوصول إلى إعداد المستخلص القائم على الإشريكية القولونية لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد (الشكل 1 ). نقدم هنا الدليل خطوة بخطوة لتنفيذ سير عمل CFAI ، للانتقال من لوحة مخططة من الخلايا إلى تفاعل CFPS مكتمل في غضون 24 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. نمو وسائل الإعلام

  1. قم بإعداد 960 مل من وسائط CFAI كما هو موضح في الجدول 1 واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام KOH.
  2. انقل وسائط الثقافة إلى قارورة محيرة سعة 2.5 لتر وأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول سكر 40 مل كما هو موضح في الجدول 1. قم بتصفية المحلول في حاوية زجاجية منفصلة معقمة.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول السكر في حاضنة 30 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  4. اسمح للوسائط بأن تبرد تماما إلى أقل من 40 درجة مئوية بعد التعقيم.
  5. قبل تلقيح وسائط CFAI ، أضف محلول السكر مباشرة إلى وسائط CFAI.
  6. لتلقيح الوسائط، اسحب حلقة من المستعمرات من لوحة E. coli BL21 Star (DE3) المخططة سابقا وأدخلها مباشرة في الوسائط. قم بتدوير الحلقة في الوسائط ولكن تجنب لمس جوانب الحاوية. تأكد من أن لوحة الخط طازجة ، مع خلايا قابلة للحياة.
  7. ضع القارورة مع الوسائط الملقحة في حاضنة 30 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. اسمح للثقافة بالنمو بين عشية وضحاها. إذا تم تلقيح الخلايا في المساء ، فستصل الثقافة إلى كثافة بصرية تقريبية ، تقاس عند 600 نانومتر (OD600) ، من 10 في صباح اليوم التالي. يمكن تعديل أوقات التلقيح والحصاد حسب الحاجة.

2. حصاد الخلايا

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30 مقدما واحفظه باردا. قم بإعداد المخزن المؤقت S30 وفقا للجدول 2 ، إلى درجة الحموضة النهائية 8.2.
    ملاحظة: يمكن تحضير المخزن المؤقت S30 قبل أيام من حصاد الخلايا. إذا تم ذلك ، فاستعد بدون ديثيوثريتول وخزنه عند 4 درجات مئوية. أضف ديثيوثريتول قبل الاستخدام مباشرة.
  2. من هذه النقطة فصاعدا ، احتفظ بجميع الحلول والمواد على الجليد. انقل 1 لتر من الوسائط إلى زجاجة طرد مركزي سعة 1 لتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 5000 × جم بين 4-10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ديكان والتخلص من supernatant. باستخدام ملعقة معقمة ، انقل الكريات إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا ووزنه سابقا 50 مل.
  3. اغسل مرة واحدة باستخدام 30-40 مل من المخزن المؤقت S30 البارد عن طريق تعليق الكريات عن طريق الدوامة في رشقات نارية لمدة 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد.
    ملاحظة: نظرا لارتفاع حجم الكريات ، يمكن أن يكون تقسيم حبيبة الخلية إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل مفيدا لخطوة الغسيل. يوفر تخزين الخلايا في أليكوتس أصغر أيضا مرونة للمعالجة النهائية.
  4. جهاز الطرد المركزي إعادة تعليق الخلية عند 5000 × g بين 4-10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. تخلص من السوبرناتانت وامسح أي فائض من الجدران الداخلية للأنبوب المخروطي سعة 50 مل باستخدام منديل نظيف ، وتجنب لمس الكريات نفسها. وزن وفلاش تجميد بيليه في النيتروجين السائل. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: قد لا تتطلب الكريات تجميدا سريعا إذا كان المستخدم يخطط للاستمرار في بروتوكول إعداد المستخلص.

3. استخراج التحضير

  1. امزج الكريات المجمدة مع 1 مل من المخزن المؤقت S30 لكل 1 غرام من حبيبات الخلية واتركيها تذوب على الجليد لمدة 30-60 دقيقة تقريبا. أعد تعليق الكريات المذابة عبر الدوامة في رشقات نارية من 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد. دوامة حتى لا تكون هناك كتل مرئية من الخلايا المتبقية.
    ملاحظة: يمكن إعادة تعليق الكتل الصغيرة عن طريق الخلط باستخدام ماصة.
  2. نقل الأليكوتات من 1.4 مل من إعادة تعليق الخلية إلى أنابيب microfuge 1.5 مل لتحلل الخلايا. سونيك كل أنبوب بتردد 20 كيلو هرتز وسعة 50٪ لثلاث رشقات نارية من 45 ثانية مع 59 ثانية من الراحة لكل دورة محاطة بحمام جليدي. اقلب الأنبوب بين الدورات وأضف على الفور 4.5 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol بعد دورة الصوتنة الأخيرة.
    ملاحظة: نظرا للحرارة المنبعثة من الصوتنة ، من المهم للغاية التأكد من الاحتفاظ بجميع الأليكوتات على الجليد عندما لا يتم صوتها. يجب تجديد حمام الثلج باستمرار أو كبير بما يكفي للبقاء باردا طوال عملية الصوتنة بأكملها.
  3. جهاز طرد مركزي لكل أنبوب عند 18000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استرجع supernatant و aliquot إلى أنابيب microfuge 1.5 مل في 600 ميكرولتر aliquots. قم بتجميد الأليكوتات بسرعة وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. يجب توخي الحذر في ماصة فقط supernatant.

4. تخليق البروتين الخالي من الخلايا

  1. قم بإذابة أليكوت واحد من المستخلص من الخطوة السابقة لأداء 15 ميكرولتر من تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في أنابيب microfuge 1.5 مل في أربعة أضعاف.
  2. تحضير كل تفاعل عن طريق الجمع بين 240 نانوغرام من الحمض النووي (16 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) ، 2.20 ميكرولتر من المحلول A ، 2.10 ميكرولتر من المحلول B ، 5.0 ميكرولتر من المستخلص ، وحجم مختلف من الماء الجزيئي لملء التفاعل إلى 15 ميكرولتر. يمكن تحجيم هذا التفاعل إلى أحجام أكبر. انظر الجدول 3 للاطلاع على النسب.
    1. إعداد الحل ألف وباء وفقا للجدول 4. يمكن تحضير كل محلول على دفعات من 100 ميكرولتر إلى 1 مل ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي اعتمادا على البروتين محل الاهتمام. في هذه الحالة ، تم تحسين البلازميد المستخدم ، pJL1-sfGFP ، ليعمل عند 16 ميكروغرام / مل ، أو 597 ميكرومتر.
  3. دع التفاعلات تعمل لمدة 4 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.

5. تحديد كمية البروتين مراسل ، سوبر مجلد بروتين الفلورسنت الأخضر (sfGFP)

  1. باستخدام صفيحة بوليسترين سوداء نصف مساحة 96 بئرا ، اجمع 2 ميكرولتر من كل منتج تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا مع 48 ميكرولتر من 0.05 M HEPES العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.2. يوصى بثلاثة إلى أربعة نسخ متماثلة لكل أنبوب تفاعل.
  2. حدد كميا شدة التألق ل sfGFP بطول موجي للإثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجي للانبعاثات يبلغ 528 نانومتر.
  3. لتحويل وحدات التألق النسبية إلى عائد حجمي (ميكروغرام / مل) من sfGFP ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام pJL1-sfGFP المنقى .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عند تحضير وسائط CFAI ، تم استبدال الجلوكوز بزيادة اللاكتوز والجلسرين كركيزة الطاقة الرئيسية في الوسائط. بالإضافة إلى ذلك ، تم زيادة سعة التخزين المؤقت لوسائط CFAI أيضا. وترد هذه المكونات المحددة في الجدول 1.

ثم نمت الخلايا إلى كل من OD600 من 10 والمعيار 2.5 في وسائط CFAI لإظهار الاتساق مع جودة المستخلص على الرغم من اختلاف كميات المستخلص. تم زراعة وسائط 2.5 OD 600 CFAI بعد التلقيح من مزرعة البذور في مرق LB عند 37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة ، في حين تم تلقيح ثقافة OD600 10 مباشرة من لوحة. ثم تم رصد كل دفعة من وسائط CFAI وحصادها في OD600 الخاص بها. وأدى النمو إلى OD600 من 10 إلى زيادة في كمية أكبر من حبيبات الخلايا والمستخلص الكلي الذي تم الحصول عليه، حيث أنتج 9.60 مل من المستخلص مقابل 2.10 مل من المستخلص الذي تم الحصول عليه من النمو إلى 2.5 OD600 (الشكل 2). أظهر مزيد من التحليل لتركيز البروتين الكلي عدم وجود فرق كبير في البروتين الكلي في كل مستخلص (الجدول 5). على الرغم من أنها نمت إلى مستويات مختلفة من الكثافة البصرية ، إلا أن كلتا الدفعتين من المستخلص أظهرتا نتائج مماثلة في تفاعلات خالية من الخلايا باستخدام sfGFP (الشكل 3). هذا يشير إلى أن الجمع بين زيادة سعة التخزين المؤقت ، واستخدام اللاكتوز والجلسرين كمصدر رئيسي للكربون وتنفيذ اللاكتوز بدلا من IPTG لتحريض T7RNAP يساعد على استقرار نمو المستخلص إلى أي OD600 أقل من 10.

وسائل الإعلام CFAI المعقوفة:
مكونات مبلغ
كلوريد الصوديوم 5.0 غ
تريبتون ٢٠,٠ غرام
مستخلص الخميرة 5.0 غ
فوسفات البوتاسيوم، أحادي القاعدة 6.0 غ
فوسفات البوتاسيوم، ثنائي القاعدة 14.0 غ
نانوبيورTM المياه تعبئة ما مجموعه 960 مل
مرشح محلول السكر المعقم:
مكونات مبلغ
د-الجلوكوز 0.50 غ
د-اللاكتوز 4.0 غ
80٪ v / v الجلسرين 7.5 مل
نانوبيورTM المياه 28.0 مل

الجدول 1: مكونات CFAI. مكونات وسائط CFAI ومحاليل السكر بكميات خاصة بها. يجب تحريك الوسائط طوال إضافة كل مكون وتعقيم مرشح محلول السكر. يجب إضافة كل محلول إلى حاوية معقمة منفصلة قبل التلقيح.

S30 المخزن المؤقت
مكونات تركيز
تريس أسيتات الرقم الهيدروجيني 8.2 في درجة حرارة الغرفة 10 مللي متر
خلات المغنيسيوم 14 مللي متر
خلات البوتاسيوم 60 مللي متر
ديثيوثريتول 2 مللي متر

الجدول 2: مكونات المخزن المؤقت S30: تمت إضافة مكونات المخزن المؤقت S30 مع كميات كل منها في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.

مكون مبلغ
الحل أ 2.20 ميكرولتر
الحل باء 2.1 ميكرولتر
استخرج 5 ميكرولتر
قالب الحمض النووي حجم ل 16 ميكروغرام / مل النهائي
الماء املأ ما مجموعه 15 ميكرولتر

الجدول 3: نسب تفاعل CFPS: النسب المئوية النسبية للحجم للمحلول A والمحلول B والمستخلص. يمكن أن يختلف حجم الحمض النووي اعتمادا على تركيز البلازميد المحدد وقد يحتاج إلى تحسينه للبلازميد المحدد للمستخدم المستخدم.

الحل أ الحل باء
مكونات تركيز مكونات تركيز
رابطة محترفي التنس 1.2 ملليمتر غلوتامات المغنيسيوم 10 مللي متر
جي تي بي 0.850 مللي متر غلوتامات الأمونيوم 10 مللي متر
UTP 0.850 مللي متر غلوتامات البوتاسيوم 130 مللي متر
CTP 0.850 مللي متر فوسفونولبيروفات (PEP) 30 مللي متر
حمض الفولينيك 31.50 ميكروغرام/مل إل-فالين 2 مللي متر
tRNA 170.60 ميكروغرام/مل إل-تريبتوفان 2 مللي متر
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD) 0.40 مللي متر إل-آيسولوسين 2 مللي متر
الإنزيم المساعد A 0.27 مللي متر إل-ليوسين 2 مللي متر
حمض الأكساليك 4.00 مللي متر إل-سيستين 2 مللي متر
بوتريسين 1.00 مللي متر إل-ميثيونين 2 مللي متر
سبيرميدين 1.50 مللي متر إل-ألانين 2 مللي متر
HEPES العازلة درجة الحموضة 7.5 57.33 ملليمتر إل-أرجينين 2 مللي متر
إل-أسباراجين 2 مللي متر
L-حمض الأسبارتيك 2 مللي متر
L-حمض الجلوتاميك 2 مللي متر
إل-جليكاين 2 مللي متر
إل-جلوتامين 2 مللي متر
إل-هيستيدين 2 مللي متر
إل-ليسين 2 مللي متر
إل-برولين 2 مللي متر
إل-سيرين 2 مللي متر
إل-ثريونين 2 مللي متر
إل-فينيل ألانين 2 مللي متر
إل-التيروزين 2 مللي متر

الجدول 4: مكونات الحلين ألف وباء. وأضيفت تركيزات المخزون لمكونات المحلولين ألف وباء بكميات كل منهما، كل منها في أنبوب ميكروفوجي سعة 1.5 مل.

استخرج تركيز البروتين الكلي (ميكروغرام / مل) الانحراف المعياري
2xYTPG 2.5 OD 30617 3745
CFAI 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

الجدول 5: إجمالي إنتاج بروتين المستخلص. تحليل البروتين الكلي لنمو مستخلص الخلايا المختلفة. تم تحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص برادفورد. تم تحديد كل تركيز من ثلاثة أضعاف باستخدام تخفيف 1:40.

Figure 1
الشكل 1: مقارنة بين CFAI وسير العمل النموذجي من الخلايا إلى CFPS: مقارنة الجدول الزمني الإجمالي من الخلايا إلى CFPS باستخدام سير عمل CFAI (A) (يسار ، أحمر) مقابل الطريقة (B) التي تم إنشاؤها مسبقا (أخضر ، يمين). توضح المقارنة انخفاض إشراف الباحث والجدول الزمني عند إجراء CFPS باستخدام سير عمل CFAI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة حجم الكريات CFAI. مقارنة بين كريات وسائط CFAI بعد حصاد الخلايا عند OD600 مختلف. نمت الوسائط إلى OD 600 من 2.5 أنتجت بيليه خلية 2.23 جم (يسار) ونمت الوسائط إلى OD600 من 10 أنتجت بيليه خلية 9.49 جم (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: آثار النمو على غلة تفاعل CFPS. (أ) مقارنة غلة تفاعل CFPS بين النمو إلى 2.5 OD 600 و10 OD600 ، مع (B) صور لكل تفاعل CFPS أعلى من العائد الخاص بها. تم إجراء التفاعلات الخالية من الخلايا في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل وتم قياسها كميا بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية باستخدام منحنى قياسي لربط التألق بتركيز sfGFP. يتوافق "السلبي" مع مجموعة تفاعلات التحكم السلبية التي لم تتم فيها إضافة أي قالب للحمض النووي. وسائط 2xYTPG التقليدية (التحكم الإيجابي) ومستخلصات CFAI ذات جودة مماثلة كما هو موضح من خلال غلتها العالية CFPS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك حاجة تقليديا إلى إشراف الباحث لإجراءين رئيسيين أثناء نمو الخلايا: تحريض T7 RNAP وحصاد الخلايا في OD600 محدد. CFAI يتجنب كل من هذه المتطلبات لتقليل وقت الباحث والتدريب الفني المطلوب من أجل إعداد مستخلصات الخلايا عالية الجودة. يتم تحقيق الحث التلقائي ل T7 RNAP عن طريق استبدال الجلوكوز باللاكتوز كسكر أساسي في الوسائط ، مما يتجنب الحاجة السابقة لمراقبة النمو بنشاط ثم الحث باستخدام IPTG عند نقطة دقيقة أثناء نمو الخلايا. كما يتم تجنب الحاجة إلى مراقبة مزارع الخلايا بنشاط للحصاد في OD600 محدد ، مما يؤدي إلى فك ربط الباحث بثقافة الخلايا. وهذا يضيف إلى العمل الأخير الذي أظهر أيضا إنتاج مستخلصات عالية الجودة يتم حصادها في أوقات غير تقليدية13،25،26. تعمل تركيبة الوسائط الجديدة على تحسين قدرة التخزين المؤقت ومصادر الكربون لدعم استقلاب الطاقة النشط حتى مع اقتراب زراعة الخلايا من المرحلة الثابتة. تسمح القدرة على الحصول على مستخلصات خلايا قوية من مزارع OD600 العالية للباحث بحصاد الثقافات في الوقت الذي يناسبهم27. سير العمل الذي نفضله ونوصي به هو تلقيح الثقافة في المساء والعودة إلى الحصاد في صباح اليوم التالي.

يؤدي حصاد الخلايا عند OD600 أعلى أيضا إلى كمية أكبر بكثير من الخلايا التي تم الحصول عليها لإعداد المستخلص. بالنسبة للباحثين ذوي الخبرة ، تجدر الإشارة إلى أن حبيبات الخلايا أغمق بكثير في اللون مقارنة بالخلايا المزروعة في وسائط 2xYTPG ، حتى عند حصادها في OD600 من 2.5. من المهم أيضا ملاحظة أنه إذا تمت معالجة حبيبات الخلية بأكملها في وقت واحد ، فإن الكمية الكبيرة من إعادة التعليق التي تم الحصول عليها لكل حبيبة خلية عند إجراء التحلل عن طريق الصوتنة ستستغرق بعض الوقت. وبالتالي ، من المهم الحفاظ على جميع الأليكوتات باردة خلال هذه العملية11،13،14. الزيادة في حجم المستخلص لكل نمو تقلل التكلفة بشكل متناسب وتدعم تطبيقات التصنيع الحيوي. مع التحسينات الموضحة ، يوفر سير عمل CFAI بروتوكولا أسهل للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة للتكنولوجيا الخالية من الخلايا لإنتاج مستخلص E. coli الوظيفي القابل للتكرار.

على الرغم من مزايا وسائط CFAI المقدمة ، إلا أن هناك قيودا على هذه الطريقة. التحدي الرئيسي هو الطبيعة الوليدة لسير العمل. في حين أن تحليل الأيض قد سلط الضوء على الاختلافات في مستخلصات CFAI OD600 10 وكذلك منتجات التفاعل مقارنة ب 2xYTPG ، فإن آثار هذه الاختلافات على تطبيقات محددة لا تزال غير مميزة27. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير سير العمل هذا للتحلل القائم على BL21 E. coli. من غير الواضح ما إذا كانت إعادة صياغة الوسائط ستدعم التحضير القوي للمستخلص من سلالات الإشريكية القولونية الأخرى ، مثل السلالات المعاد ترميزها وراثيا من E. coli28,29. ومن الممكن أن يستخدم نهج CFAI لتوليد مقتطفات من الكائنات البكتيرية الأخرى، ولكن من غير المرجح أن يدعم إعداد المستخلص للكائنات حقيقية النواة مثل مبيض الهامستر الصيني أو خلية شبكية الأرانب؛ ومع ذلك ، فإن هذه لها أساليبها الخاصة المحددة30,31. نتوقع أن تؤدي بساطة سير عمل CFAI إلى تقليل الحواجز وتحفيز المجتمع الخالي من الخلايا على توصيف وتقييم فائدته لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تدعمها CFPS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب مصالح مالي منافس.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة جنيفر فاندركيلين وأندريا لاوبشر على الدعم الفني. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا نيكول غريغوريو وماكس ليفين وأليسا مولين وبيونغ تشول سو وأوغست بروكويل وإليزابيث (ليزي) فويفودا ولوغان بورينغتون وجيليان كاسمان على المناقشات المفيدة. يعترف المؤلفون أيضا بدعم التمويل من صندوق بيل وليندا فروست ، ومركز التطبيقات في منحة شيفرون للبحوث التطبيقية للتكنولوجيا الحيوية ، وأبحاث كال بولي ، والعلمية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF-1708919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 173،

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث التلقائي الخالي من الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter